Summary
Denne protokollen beskriver en kanonisk metode for å forstå de kritiske genene som kontrollerer osteoklastaktivitet in vivo. Denne metoden bruker en transgen musemodell og noen kanoniske teknikker for å analysere skjelettfenotype.
Abstract
Transgene musemodeller er kraftige for å forstå de kritiske genene som kontrollerer osteoklastdifferensiering og aktivitet, og for å studere mekanismer og farmasøytiske behandlinger av osteoporose. Cathepsin K (Ctsk)-Cre mus har blitt mye brukt til funksjonelle studier av osteoklaster. Signaltransduseren og aktivatoren for transkripsjon 3 (STAT3) er relevant i bein homeostase, men dens rolle i osteoklaster i vivo forblir dårlig definert. For å gi in vivo bevis på at STAT3 deltar i osteoklast differensiering og bein metabolisme, genererte vi en osteoklast-spesifikk Stat3 sletting mus modell (Stat3 fl / fl; Ctsk-Cre) og analyserte skjelettfenotypen. Mikro-CT-skanning og 3D-rekonstruksjon antydet økt benmasse i de betingede knockout-musene. H&E farging, calcein og alizarin rød dobbel farging, og tartratresistent syre fosfatase (TRAP) farging ble utført for å oppdage bein metabolisme. Kort sagt beskriver denne protokollen noen kanoniske metoder og teknikker for å analysere skjelettfenotype og for å studere de kritiske genene som kontrollerer osteoklastaktivitet i vivo.
Introduction
Skjelettben er det viktigste bærende organet i menneskekroppen og er under press fra både det indre og ytre miljøet under turgåing og trening1. Gjennom ens liv går bein kontinuerlig gjennom selvfornyelse, som balanseres av osteoblaster og osteoklaster. Prosessen med osteoklaster som rydder gamle bein og osteoblaster som danner nytt bein, opprettholder homeostase og mekanisk funksjon av skjelettsystemet2. Forstyrrelser i balansen kan indusere benmetaboliske sykdommer, som osteoporose. Osteoporose, som er forårsaket av overflødig osteoklastisk aktivitet, er globalt utbredt og forårsaker betydelige økonomiske tap for samfunnet2,3,4. Ifølge det begrensede antallet legemidler som er tilgjengelige for osteoporosebehandling og deres risiko for bivirkninger4, er det viktig å avduke detaljene i osteoklastdannelse og aktivitet.
Osteoklaster avledet fra den monocytt/makrofag hematopoietiske avstamningen har flere kjerner (kan ha 2 til 50 kjerner) og er store (vanligvis større enn 100 μm i diameter)2. Selv om utforskningen av mekanismer og screening av legemidler for osteoklastiske lidelser har blitt mye forbedret via in vitro osteoklastkultur, gjør de kompliserte organiske reaksjonene in vivo-bevis uunnværlige for målrettet terapi. På grunn av genetiske og patofysiologiske likheter mellom mus og mennesker, brukes genetisk konstruerte musemodeller ofte til å studere mekanismene og de farmasøytiske behandlingene av menneskelig sykdom in vivo6. Cre-loxP-systemet er en mye brukt teknologi for musegenredigering og har gjort det mulig for forskere å undersøke genfunksjoner på en vevs- / cellespesifikk måte5. Cathepsin K (CSTK) er en cysteinprotease utskilt av osteoklaster som kan forringe ben kollagen8. Det er godt akseptert at CTSK uttrykkes selektivt i modne osteoklaster; Derfor anses Ctsk-Cre mus å være et nyttig verktøy for funksjonelle studier av osteoklaster og har blitt brukt6.
Signaltransduseren og aktivatoren av transkripsjonsfamilien (STAT) er klassisk og svært viktig i immunitet og kreftprogresjon og utvikling7,8. Blant syv STATs rapporteres STAT3 å være den mest relevante for bein homeostase9,10. Flere in vivo-studier har rapportert at spesifikk inaktivering av STAT3 i osteoblaster reduserer beindannelse9,10. Likevel er solide bevis angående deltakelse av STAT3 i osteoklastdannelse og benmetabolisme in vivo fortsatt begrenset. Nylig ga vi in vivo bevis med en osteoklast-spesifikk Stat3 sletting mus modell (Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, heretter kalt Stat3Ctsk) at STAT3 deltar i osteoklastdifferensiering og benmetabolisme11. I den nåværende studien beskriver vi metodene og protokollene som vi brukte til å analysere endringene i beinmasse, ben histomorfologi og beinanabolisme og katabolisme av Stat3Ctsk-musene for å studere påvirkningen av osteoklastspesifikk STAT3-sletting på bein homeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder knyttet til dyrene beskrevet her ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
1. Avl av osteoklastspesifikke Stat3-slettingsmus
MERK: Stat3fl/fl mus ble oppnådd kommersielt. Ctsk-Cre mus ble levert av S. Kato (University of Tokyo, Tokyo, Japan12). Musene ble oppdrettet og vedlikeholdt under spesifikke patogenfrie (SPF) forhold i institusjonsdyranlegget under standardiserte forhold.
- Par en seksuelt moden mannlig mus med to kvinnelige mus på samme alder. Etter 18 dager, sjekk daglige sjekker for nyfødte. Skill de gravide kvinnelige musene og hold det alene om nødvendig. Bytt mannlige mus mellom forskjellige avlsbur hvis de kvinnelige musene ikke var gravide innen 1 måned etter paringen.
- Kryss Stat3fl/fl mus til Ctsk-Cre mus (F0). Klipp halene for genotyping og hold den mannlige Stat3fl /+; Ctsk-Cre mus til de er seksuelt modne, som er rundt 6 ukers alder (F1). Bruk følgende primere: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTCGTTC.
- Kryss 6 uker gammel mannlig Stat3fl/+; Ctsk-Cre mus med kvinnelige Stat3fl / fl mus. Klipp halene for genotyping og hold den mannlige Stat3 fl / fl; Ctsk-Cre mus til de er seksuelt modne, som er rundt 6 ukers alder (F2).
- Kryss 6 uker gamle mannlige Stat3 fl / fl; Ctsk-Cre mus med kvinnelige Stat3fl/fl mus (F3). Klipp halene for genotyping og erstatt de gamle avlsmusene med yngre mus i tide (F3 + N).
2. Prøvesamling
- Euthanize seks par 8 uker gamle mannlige Stat3fl / fl og Stat3Ctsk kullmat mus separat med karbondioksid kvelning.
MERK: CO2-strømningshastigheten fortrenger 30 % av merdvolumet per minutt (f.eks. i 45 cm x 30 cm x 30 cm merd er CO2-strømningshastigheten 40 l/min). - Plasser musene i en liggende stilling. Disloker de bilaterale hofteleddene forsiktig for hånd. Bruk oftalmisk saks for å kutte av huden vertikalt fra distal tibia og deretter dissekere hele huden fra bakre lem.
- Klipp av leddbåndet i høyre hofteledd og kneledd med saks for å skille bakre lem. Klipp trochanteren og krysset mellom fibula og senk deretter bakre lem i 4% paraformaldehyd. Hold de riktige bakre lemmer for trinn 3. Kutt benet i begge ender for å fullstendig nedsenke og fikse benmargen med 4% paraformaldehyd.
- Klipp leddbåndet i venstre hofteledd og kneledd med saks, fjern forsiktig bløtvevet, og separer forsiktig tibia og lårben. Senk tibia og lårben separat i 75% etanol. Hold femora for trinn 4 og tibiae for trinn 6. Sørg for å holde trochanteren intakt.
3. Forberedelse av Paraffinsseksjonen
- Fest riktig bakre lem i 4% paraformaldehyd ved 4 °C i 48 timer.
- Avkalking: Vask prøvene forsiktig med 1x PBS i 10 min 3 ganger. Avkalk prøvene i 15% EDTA (150 g EDTA i 800 ml ddH2O og 100 ml 10x PBS) med en ultralyddekalsifikatorer i 3 til 4 uker til beinene kan bøyes. Skift ut med frisk avkalkingsvæske annenhver dag.
- Vask prøvene forsiktig 3x med 1x PBS og senk dem deretter ned i 75% etanol ved 4 °C over natten.
- Dehydrer: På den andre dagen, sekvensielt nedsenke prøver i 95% etanol, 100% etanol og xylen, hver i 1 time to ganger.
- Senk prøvene ned i 1/2 xylen 1/2 paraffin i 30 min. Senk prøvene ned i parafin ved 65 °C over natten.
- Bygg inn: Velg en passende innebyggingstank for innebygging. Plasser tibia jevnt under. Plasser lårbenet og tibia i en 90° vinkel. Etter at parafinen er fullstendig avkjølt og størknet, fjern den fra innbyggingstanken. Nummerer prøvene og lagre dem ved -20 °C over natten.
- Klipp 5 μm tykke seksjoner kontinuerlig ved hjelp av mikrotommen. Klipp 20-40 seksjoner. Spred seksjonene på 37 °C vann, fest dem til mikroskopsklier og stek ved 42 °C over natten.
4. Mikro-CT skanning og analyse
- Skann venstre femora med en micro-CT-skanner. Oppløsning: 10 μm; Spenning: 70 kV; Strøm: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Rotasjon trinn: 0,5°.
- Rekonstruer 3D-bilder av kortikale bein og trabekulære bein ved hjelp av skannerens støtteprogramvare i henhold til produsentens instruksjon. ROIer er i en total 1 mm bredde av trabekulært bein nær den distale vekstplaten og i en totalt 1 mm bred del av kortikale bein i midten av femoraen.
- Beregn de kvantitative mikroarkitekturparametrene: benmineraltetthet (BMD), benvolumfraksjon (BV/TV), trabekulær tykkelse (Tb.Th.), trabekulært tall (Tb.N.), trabekulær separasjon (Tb.Sp.) og kortikale bentykkelser (Ct.Th.).
5. TRAP flekker
- Stek parafindelene ved 65 °C i 30 minutter.
- Dewax: Senk seksjonene i xylen i 10 min. Utfør dette trinnet 3x med frisk xylen.
- Rehydrer: Senk seksjonene sekvensielt ned i 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol og ddH2O, hver i 5 minutter to ganger.
- Forbered fargingsløsningen ved hjelp av TRAP-fargesettet i henhold til produsentens anvisninger og varm til 37 °C.
MERK: TRAP-fargingsløsningen skal tilberedes på nytt umiddelbart før hver analyse. - Tilsett 50–100 μL fargeoppløsning i hver prøve og inkuber i et fuktig kammer på 37 °C i 20–30 minutter. Kontroller fargingsstatusen til osteoklastene under et lysmikroskop hver 5. Avslutt reaksjonen med ddH2O.
- Tellerstain i hematoksylinoppløsning i 30 s. Lag en stabil blå farge ved nedsenking i 1% ammoniakkløsning i 1 min. Skyll sakte i rennende vann fra springen.
- Monter seksjonene med deksler med nøytral balsam og tørk over natten.
- Fang 3-5 felt av interesse av et mikroskop. Analyser den trabekulære omkretsen etter bilde J: mål lengden på skalalinjen (Ls) ved hjelp av verktøyet 'rett linje' som L1, og mål deretter lengden på trabekulær omkrets ved hjelp av 'segmentert linje' verktøy som L2, den fysiske lengden (Lp)= Ls * L2 / L1). Tell antall TRAP-positive celler med mer enn tre kjerner.
6. Calcein og alizarin rød dobbel merking
- Prøvepreparat: Intraperitoneally injisere 20 mg/kg calcein (1 mg/ml i 2 % NaHCO3-oppløsning) på dag 0 og 25 mg/kg alizarin rød S (AL, 2 mg/ml i H2O) på dag 4. Ofre mus på dag 7. Fjern forsiktig tibiae og fest i 4% paraformaldehyd ved 4 °C i 48 timer.
- Dehydrat: Etter fiksering, vask tibiaen forsiktig 3x med 1x PBS. Senk prøvene sekvensielt ned i 95% etanol, 100% etanol og xylen i 5 min to ganger separat.
- Senk prøvene ned i aceton i 12 timer, i 1/2 aceton 1/2 harpiks i 2 timer, og i ren harpiks i en tørkeovn over natten.
MERK: Harpiksen ble fremstilt med kommersielt tilgjengelig harpiks (f.eks. innebygging 812 harpiks) i henhold til produsentens anvisninger. - Embed: Tilsett ren harpiks i en egnet silikagelinnbyggingstank og plasser prøvene forsiktig for å unngå bobler. Polymeriser harpiksen i en tørkeovn ved 60 °C i 48 timer.
- Klipp prøvene i 5 μm tykke seksjoner kontinuerlig med en roterende mikrotom. Oppbevar resten av prøvene med tørkemiddel ved romtemperatur.
- Følg seksjonene med pinsett i en dråpe på 75% alkohol. Monter seksjonene med deksler med nøytral balsam. Fang rød og grønn fluorescensmerking med et fluorescensmikroskop.
- Mål bredden mellom to merkelinjer (Ir.L.Wi), enmerkede trabekulære omkretser (sL.Pm), dobbeltmerkede trabekulære omkretser (dL.Pm) og total trabekulær omkrets (Tb.Pm). Beregn mineralappposisjonshastigheten (MAR) og bendannelseshastigheten (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/interval dager. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av den nåværende protokollen ble osteoklastspesifikke Stat3-slettingsmus generert for å studere påvirkningen av STAT3-sletting på osteoklastdifferensiering. Stat3Ctsk mus og deres wildtype (WT) kullkamerater ble oppdrettet og holdt etter genotyping. Benmargsmakrofager ble isolert og dyrket i osteoklaster, og STAT3-sletting i Stat3Ctsk-mus ble demonstrert (Figur 1).
Femora rekonstruksjon og kvantitativ analyse ved mikro-CT indikerte at beinmassen til Stat3Ctsk-musene ble økt sammenlignet med WT-mus (figur 2).
Histomorfologien til femoraen fra WT- og Stat3Ctsk-musene ble undersøkt via H&E-farging (figur 3).
Osteoklastogen aktivitet hos musene ble påvist ved TRAP-farging. Osteoklaster var TRAP+ (vinrøde eller lilla) celler med flere kjerner og stor størrelse (Figur 4A). Antall TRAP+ osteoklaster var lavere i Stat3Ctsk-musene sammenlignet med WT-musene (figur 4B), noe som indikerer at STAT3-mangel nedsatt osteoklastdannelse.
Osteogenese hos mus er representert ved mineralappposisjonsraten (MAR) og ble målt ved calcein og alizarin rød dobbeltmerking (figur 5). Calcein og alizarinrød ble sekvensielt intraperitonealt injisert. Derfor representerer området mellom calcein (grønn) og alizarin rød (rød) fluorescenslinjer nydannet bein over fire dager. Som vist i figur 5, slettet STAT3 i osteoklaster påvirket ikke bein anabolisme.
Figur 1: Illustrasjon av osteoklastspesifikk Stat3-sletting musemodellgenerering og genmodifiserte mus. (A) Skjematisk diagram over Stat3-sletting i cathepsin K (Ctsk)-uttrykkende osteoklaster via Cre-loxP-systemet. (B) Avl fremgang av osteoklast spesifikke Stat3 sletting mus. Stat3fl/fl mus ble krysset til Ctsk-Cre mus (F0) for å generere heterozygot Stat3fl/+; Ctsk-Cre mus (F1). Mannlig Stat3fl/+; Ctsk-Cre mus ble holdt og krysset til kvinnelige Stat3fl / fl mus for å generere homozygot Stat3 fl /fl; Ctsk-Cre mus (F2). Mannlig Stat3fl/fl; Ctsk-Cre mus ble holdt og krysset til kvinnelige Stat3fl / fl mus for å generere Stat3 fl /fl; Ctsk-Cre mus og Stat3fl/fl mus. (C) Genotyping for ulike genotyper av mus. Stat3 mutant: 187 bp, Stat3 wildtype: 146 bp, Cre: 200 bp. (D) Vestlig blott av STAT3 i osteoklaster dyrket med benmargsmakrofager fra Stat3fl/fl og Stat3Ctsk mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tredimensjonal rekonstruksjon og kvantitativ mikroarkitekturparameteranalyse i femora av mus ved hjelp av mikro-CT-skanning. (A) Tredimensjonalt rekonstruerte mikro-CT-bilder av trabekulært bein av femora fra 8 uker gamle WT- og Stat3Ctsk-mus. Interesseområdet (ROI) var i en total 1 mm bredde av trabekulært bein nær den distale vekstplaten. (B) 3D rekonstruerte mikro-CT bilder av kortikale bein av femora fra 8 uker gamle WT og Stat3Ctsk mus. ROI var i en totalt 1 mm bred del av kortikale bein fra midten av femora. (H–H) Kvantitative mikroarkitekturparametere for mikro-CT: benmineraltetthet (BMD), benvolumfraksjon (BV/TV), trabekulær tykkelse (Tb.Th.), trabekulært tall (Tb.N.), trabekulær separasjon (Tb.Sp.) og kortikale bentykkelser (Ct.Th.). Feilfelt representerer gjennomsnittet ± SD, n=4, *P<0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Histomorfologi av femora fra WT- og Stat3Ctsk-mus utstilt via H&E-farging. M-formet stiplet kurve indikerer et brusklag. Relativt høyeffektsfelt av kortikale bein er innrammet med stiplede linjer og utstilt nedenfor. Relativt høyeffektsfelt av trabekulært bein er sirklet med stiplede linjer og utstilt på bunnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Osteoklastogenese hos femora av mus representert via TRAP-farging. (A) TRAP farging av femora fra 8 uker gamle WT og Stat3Ctsk mus. TRAP+ multinukleerte osteoklaster er indikert av svarte trekanter. Relativt høyeffektsfelt av osteoklaster sirklet med stiplede linjer er utstilt nedenfor, og demonstrerer flere kjerner og en stor størrelse. (B) Antallet TRAP+ multinukleerte osteoklaster ble talt. Feilfelt representerer gjennomsnittet ± SD, n=5, *P<0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Osteogenese hos femora av mus representert via calcein og alizarin rød dobbeltmerking. (A) Syv uker gamle mus ble sekvensielt injisert med calcein på dag 0, med alizarin rød på dag 4, og deretter ofret på dag 7. Området mellom calcein (grønn) og alizarin rød (rød) fluorescens linjer representerer nydannede kortikale bein over fire dager. (B) Mineral apposition rate (MAR) og beindannelseshastighet (BFR / BS) beregnet av avstanden til de to linjene representerer den osteogene aktiviteten til kortikale bein. (C) Området mellom kalcein (grønn) og alizarin rød (rød) fluorescens linjer representerer nydannede trabekulære bein i fire dager. (D) MAR og BFR/BS representerer den osteogene aktiviteten til det trabekulære beinet. Feilfelt representerer gjennomsnittet ± SD, n=5, *P<0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetisk konstruerte musemodeller brukes ofte til å studere mekanismen og farmasøytisk behandling av menneskelig sykdom13. Ctsk-Cre mus har blitt mye brukt til funksjonelle studier av osteoklaster6. Den nåværende studien beskrev metodenes protokoller for å analysere skjelettfenotype og å studere de kritiske genene som kontrollerer osteoklastaktivitet in vivo.
Histologisk analyse er den beste intuitive metoden for å oppdage beinmetabolisme. Og kvaliteten på parafinseksjonene er grunnlaget for den histologiske analysen. Tilstrekkelig tid til full fiksering og avkalking av beinvevet er ekstremt viktig siden beinvev kan fragmenteres. Forskere med fokus på femora og tibiae bør plassere lårbenet og tibia i en 90° vinkel i innebyggingstrinnet. For å gjennomføre pålitelige og høykvalitets histologiske analyser valgte vi sagittale parafinseksjoner der brusklaget var symmetrisk og viste en klar M-formet linje i H&E-farging, som representerer egnet vinkel og dybde for de kontinuerlige seksjonene. På den annen side, hvis du trenger å observere kneleddene og tilstøtende leddbånd, bør lårbenet og tibia plasseres i en 120 ° vinkel.
TRAP har tjent i flere tiår som biokjemisk markør for osteoklastfunksjon14, siden den hovedsakelig uttrykkes i osteoklaster15,16. To substrater brukes vanligvis til å vurdere syrefosfataseaktivitet. Naphthol-ASBI fosfat (N-ASBI-P) er et utmerket substrat for osteoklastspesifikk TRAP isoform 5b. Para-nitrofenylfosfat (pNPP) kan imidlertid også hydrolyseres av ikke-type 5 TRAPs17. Derfor er naphthol-ASBI fosforsyre-pararosanilinmetoden for histokjemisk demonstrasjon av TRAP svært spesifikk i vevsseksjonene17,18,19. Makrofagfosfatase (syrefosfatase) har en pH optimal på 5,0-6,0, hvor den for det meste er tartratbestandig20. Dermed anbefaler vi at vevsseksjoner som er farget av hematoksylin i protokollen for TRAP-fargingsanalyse, ikke skal defarges med saltsyre. Viktig, selv om osteoblaster og osteocytter nær beinoppussingsområder også uttrykker TRAP21, ble bare store TRAP-positive celler med mer enn tre kjerner ansett som osteoklaster. I denne studien viste Stat3Ctsk-mus hemmet osteoklastaktivitet (Figur 4).
Calcein er en fluorokrom (grønn fluorescens) som er mye brukt til å indikere skjelettvekst under forkalkning. Det kan binde seg til kalsium og innlemmes i de nydannede kalsiumkarbonatkrystallene22. På samme måte ble calcein, alizarin rød (rød fluorescens) og tetracyklin (gul fluorescens) bygget inn i beinet for å estimere vekst fra eksponeringstidspunktet23,24. Mange studier tidligere har brukt enkle fluorokromer (vanligvis calcein) for å merke bein, men observatører kan lett forveksles mellom det nydannede beinet og det gamle beinet, spesielt i uregelmessig trabekulært bein. Derfor foreslår vi at forskere injiserer to forskjellige typer fluorokromer i mus for å skille det nyere beinet fra det eldre beinet. Ifølge våre tester kan calcein kombinert med alizarin oppnå den mest tilstrekkelige og varige kontrasten. I denne studien ble calcein-alizarin rød merking brukt til å oppdage den osteogene frekvensen av beinvev, og det viste seg at osteoblastaktivitet ikke ble påvirket i Stat3Ctsk-musene (Figur 5).
Kort sagt, for å forstå de kritiske genene som kontrollerer osteoklastaktivitet, beskriver denne protokollen en kanonisk metode for å generere en transgen musemodell. Denne protokollen beskriver også noen typiske teknikker for å analysere skjelettfenotypen. I denne studien ble slettingen av STAT3 svekket osteoklastdannelse og økt benmasse. Disse teknikkene kan være interessante for de som er nye i skjelettvevsforskning. Imidlertid er flere egenskaper ved skjelettsystemet bekymret for videre studier, for eksempel mekanisk egenskap25. Og vi må alltid følge med på utviklingen av nye teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker prof. Weiguo Zou og S. Kato for reagenser og mus og medlemmene av Zou-laboratoriet for nyttige diskusjoner. Vi takker også laboratoriet for digitalisert stomatologi og forskningssenter for kraniofaciale anomalier ved Shanghai niende folkesykehus for hjelp. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, SHIPM-mu-fondet fra Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], insentivprosjektet til innovasjonsteamet på høyt nivå for Shanghai Jiao Tong University School of Medicine , det tverrfaglige forskningsfondet for Shanghai niende folkesykehus, Shanghai JiaoTong University School of Medicine [JYJC201902]. Og L.J. er forsker på Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program og "Chen Xing" -prosjektet fra Shanghai Jiaotong University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
- Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
- Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
- Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).
- Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
- Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
- Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
- Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
- Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
- Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
- Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
- Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
- Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
- Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
- Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
- Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
- Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
- Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
- Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
- Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
- Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).
