Summary
שיטה זו ממחישה את השימוש בטכניקת הכלאה הצפוני כדי לזהות miRNAs מתוך תמצית RNA מוחלטת.
Abstract
מיקרורונאס (miRNAs) הם מחלקה של מבוטא באופן שגוי בקידוד, ~ 21 nt RNAs קטן מעורב בוויסות של ביטוי גנים בשני הצמחים ובעלי חיים. רוב miRNAs לפעול כמתגים שליליים של ביטוי גנים מיקוד גנים מפתח. ב צמחים, ראשי miRNAs (פרי-miRNAs) התעתיקים נוצרות על ידי RNA פולימראז II, והם יוצרים אורכים שונים של מבנים גזע לולאה יציבה בשם pre-miRNAs. הסכם endonuclease, Dicer-like1, מעבד את מקדם-מירנס לתוך דופלקסים של Mirnas-Mirnas. אחד הגדילים מ-miRNA-miRNA * דופלקס נבחר ונטען על החלבון 1 Argonaute או הומויומנים שלה כדי לתווך את המחשוף של mRNAs היעד. למרות miRNAs הם מולקולות איתות מפתח, הזיהוי שלהם מבוצע לעתים קרובות על-ידי פחות שיטות מבוססות PCR מיטביות במקום ניתוח כתמי בצפון רגיש. אנו מתארים פשוטה, אמין, שיטה צפונית מאוד רגיש האידיאלי עבור כימות של רמות miRNA עם רגישות גבוהה מאוד, פשוטו כמשמעו מכל רקמת הצמח. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לאשר את הגודל, היציבות והשפע של miRNAs ואת הסמנים הקדם.
Introduction
הגילוי האחרון של RNAs ברגולציה קטנה, microRNAs, הוביל מחקר בהבנת אותם ואת תפקידם בצמחים ובעלי חיים1. משתמשים ארוכי-סמנים של mirnas מעובדים לתוך 21 כדי 24 nt בוגרת mirnas על ידי HYL1 ו-dicer מסוימים כמו חלבונים2,3. A 22 nt miRNA יכול ליזום מדורגת על ידי יצירת siRNAs משני4. מחקרים הראו את התפקיד של mirnas ואת sirnas משני בפיתוח, הגורל תא התגובות הלחץ5,6.
הכלאה בצפון היא שיטה ניסיונית המועסקים באופן שגרתי כדי לזהות מולקולות RNA מסוימות. שיטה זו מתאים אישית את השימוש שלה בזיהוי של כ-19 -24 nt RNAs קטן ארוך מתוך מאגר של סך RNAs7. בהפגנה זו אנו ממחישים את השימוש בטכניקה זו לאיתור ולקוונפיקציה של miRNAs. שיטה זו משתמשת בתיוג של הגששים באמצעות רדיואיזוטופים; thus, רמות miRNA במדגם ניתן להבחין עם רגישות מוגברת. שלא כמו שיטות המבוססות על PCR, שיטה זו מבטיחה כימות ביטוי, כמו גם קביעת גודל של ה-miRNAs. בפרוטוקול זה, אנו מציגים צעדים מכריעים המשפרים את גילוי miRNA. שינו שינוי בשלבים בגושים והיברידיזציה לקבלת זיהוי אותות ברזולוציה גבוהה של miRNAs. טכניקה זו יכולה לשמש גם לאיתור RNAs קטנים שונים אנדוגניים כגון siRNAs, tasi-RNAs משנית ו שנחונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של 15% הרפתקאות פוליאקרילמיד ג'ל
- שוקלים ולהוסיף 4.8 g של אוריאה, להוסיף 3.75 mL של 40% אקרילאמיד: bisacrylamide (19:1) פתרון 1 מ ל של 10x TBE pH ה8.2 לתוך שפופרת סטרילי משנת mL.
- מפזר אוריאה באמצעות מרחץ מים שנקבע ב 60 ° c לתוך פתרון ברור.
- הפוך את עוצמת הקול ל-10 מ"ל באמצעות מים סטריליים טריים ומצננים את תערובת ג'ל לטמפרטורת החדר.
- להכין חדש 10% (w/v) הפתרון אמוניום פרסולפט.
2. הרכבת לוחית הזכוכית ויחידת האלקטרופורזה
- שוטפים את כל המכשירים הנדרשים לאלקטרופורזה בג ולאלקטרו-מיכשור כביסה. בעדינות לקרצף אותם באמצעות ספוג רך להסיר מאגר שיורית אקרילמיד, לשטוף עם מים ולאפשר להם להתייבש.
- להרכיב את לוחיות הזכוכית יחד ולמקם אותם בחוזקה על הספוג. השתמש בלוח עבה 1 מ"מ עבור הגדרה זו. ודא כי הלוחות נמצאים באותה רמה כדי למנוע דליפה.
- כדי 10 mL ג'ל לערבב, להוסיף 8 μl של temed ו 80 μl של טרי מוכן 10% (w/v) הפתרון אמוניום פרסולפט.
- ללא דיחוי, לערבב בעדינות לשפוך את זה בין צלחות זכוכית מורכבים. . הציבו את המסרק בזהירות הימנע מיצירת בועות אוויר בשלב זה.
- אפשר לג לפולימל כ-45 דקות.
- רוחצים את הג הפילמור במים סטריליים לפני הצבתם בתוך הכיוונון המפעיל ג'ל.
- הכנס את הלוחות בתוך הקלטת הפועלת והסר את המסרק בעדינות.
- לשפוך טרי מוכן סטרילי 1x TBE, pH 8.2 לתוך הטנק.
- רוחצים את הבארות בזהירות על ידי ליטוף החוצץ כדי להסיר גבישי מלח. שלב זה מסייע לדגימת RNA לפעול בצורה אחידה על פני הג.
- בצע מראש הפעלה ב 80 V עבור 30 דקות.
3. הכנת צבע ודגימות של העמסה
- עבור 10 מ ל של צבע העמסה ג'ל, שוקל 5 מ ג של ברומאופנול כחול, 5 מ"ג של קסילן, להוסיף 10 מ ל של הטופסלמיד בזהירות ולערבב אותם היטב.
- Aliquot 10 μg של כולל RNA לתוך צינור 1.5 mL סטרילי ויבש את הדגימות באמצעות speedvac. . אל תייבש יותר מדי את הדגימות
- השהה מחדש את דגימות ה-RNA ב-8 μL של טעינה.
- החום דגימות ב 98 ° c עבור 2 דקות, קריר עבור 1 דקות ב RT, מערבולת ולסובב את הדגימות, עבור 3 פעמים. שלב זה חיוני עבור השעיה נאותה ובתורו זה עוזר בטעינה שווה של דגימות.
4. אלקטרופורזה בג
- הפסיקו את ההפעלה מראש ושטפו את הבארות לפני טעינת המדגם.
- החום דגימות ב 98 ° c עבור 1 דקות וטען את הדגימות חם לתוך הבאר באמצעות טיפים קפילר. הכנס את הקצה לתחתית הבאר, כך שמדגם זה תופס שכבה דקה אחת בבאר.
- . העלאה מלאה של כל הדגימות כלול כדי לטעון את סמן העשור של RNA.
- הפעל את ג'ל ב 80 V עד הצבע הכחול ברומרופנול פועל כמעט לחלוטין. ברומאופנול כחול רץ 10 bp ב 15% הרפתקאות אקרילאמיד ג'ל.
5. הכנה לאלקטרו-בלוקטים
- חותכים את קרום N + ניילון לממדים של צלחת זכוכית תווית הקרום בפינה הימנית העליונה שלה עם עיפרון HB.
- מניחים בעדינות את הקרום על פני השטח של מים סטריליים, מול הצד המסומן לכיוון משטח המים. להשרות את הקרום מראש במשך 15 דקות.
- גזור 4 חתיכות של נייר לחסום אני לממדים של משטח סיבים.
- הכן את כריך ג'ל להנחת הצד האפור של הקלטת למטה במגש נקי.
- הרטיב מראש את פד הסיבים והניחו אותו מעל הקלטת. להסיר בועות אוויר.
- לפני רטוב חתיכה אחת של נייר לחסום ב-1x TBE ומקום על המשטח סיבים. להסיר בועות אוויר על ידי גלגול צינורות פלסטיק על הנייר. הנח עוד פיסה של נייר מוכתם מראש והסירו בועות אוויר.
- בזהירות להסיר את הג מתוך הקלטת פועל ולמקם אותו על הגדרת כריך, כך את המדגם RNA הראשון נטען לכיוון ימין.
- טובלים בעדינות את הקרום הספוג מראש ב-1x TBE ומניחים אותו על הג, ופונים לכיוון מטה. להתגלגל כדי להסיר את בועות האוויר.
- טובלים בחתיכת נייר מוכתם, מניחים אותו על הקרום, ומסירים את בועות האוויר. לטבול עוד פיסת נייר כתמים, למקם אותו על הגדרת כריך ולהסיר בועות אוויר.
- להשלים את הכריך על ידי הצבת משטח סיבים רטוב מראש על ההתקנה ולסגור בחוזקה את הקלטת.
- מניחים את הקלטת כתמים במודול ולמלא 1x TBE, pH 8.2 עד הסימון לחסום.
- העברה ב -10 וולט, הלילה ב -4 ° c.
- לאחר העברה, מניחים את הקרום הלח על גיליון נייר ומיד להצליב את ה-RNA לקרום על ידי הקרנה עם אור UV 254-nm (120,000 μles/cm ²). האבן החשופה לחתך החוצה מאוחסנת ב -4 ° c להמשך הכלאה.
6. הכנת בדיקה רדיוקולילד
- עיצוב לווין כי הוא משלים לחלוטין RNA קטן שהוא להתגלות.
- סיים את התווית החללית באמצעות ƳP32ATP (המתקבל מברית) בסוף ה -5 שלה על ידי שילוב הרכיבים לפי מתכון המסופק בטבלה 1.
- מודקון את תערובת התגובה לעיל ב 37 ° c עבור 30 דקות.
- הפרד את ƳP32ATP מההפרדה המסומנת באמצעות עמודה באמצעות Sephadex G-25 לפי פרוטוקול היצרן.
7. הכלאה של האבן החשופה
- מניחים את הכתם מקושרת, צד RNA פונה למעלה בתוך בקבוק הכלאה.
- מערבבים במרץ את מאגר היברידיזציה הרגיש במיוחד, מוסיפים 10 מ ל ממנה ומודפפות את האבן החשופה בתוך תנור הכלאה שנשמר ב-35 ° c, עם סיבוב.
- לבצע טרום היברידיזציה עבור 20 דקות.
- הסירו את הבקבוק מהתנור והוסיפו את המקדח המסומנת למאגר ההכלאה בעדינות.
- Hybridize האבן החשופה ב35 ° c, עם סיבוב של 12 שעות.
- לאחר היברידיזציה להעביר בזהירות את הפתרון הכלאה ל 15 מ ל צינור. ניתן לאחסן פתרון זה ב-4 ° צ' עד לשימוש חוזר.
- לבצע שטיפת מהירה של האבן החשופה עבור 2 דקות כדי להסיר פתרון היברידיזציה עודף על-ידי הוספת מאגר המיסלס 2x פלוס 0.5% SDS. בטל את הפתרון.
- מיכל האבן החשופה עם מאגר המידע הנוסף 0.5% SDS עבור 35 ° c, עם סיבוב עבור 30 דקות.
- שטפו שוב את האבן החשופה במאגר המידע החדש של 0.5 x בתוספת 0.5% SDS ב-35 ° c, עם סיבוב של 30 דקות.
- הצב את האבן החשופה בתוך כיסוי הכלאה, הסר את המאגר העודף וחתום אותו.
- לחשוף אותו הקרינה בחינם זרחן מסך צמידה לילה בתוך הקלטת.
- לזהות את האות הכלאה באמצעות imaole, ולנתח את התוצאות באמצעות תוכנה מתאימה.
- להסיר את אבן החשופה על-ידי דגירה ב 80 ° c, עם סיבוב עבור 30 דקות עם 0.5 X מאגר המידע ועוד 0.1% SDS ו 0.1 X מאגר המידע בתוספת 0.1% SDS עבור 30 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהפגנה זו, זיהינו לכמת את הביטוי של miR397 ברקמות שונות של האורז אינדיקה var וויטני (איור 1). miR397 הוא מבנה 22 nt ו-miRNA שימור. ניתן לזהות את הביטוי של miR397 בכל הדגימות שנבדקו. לפי הדור הבא ברצף נתונים, לדוגמה 1 (רקמת שתיל) יש miR397 ב 5 קריאות למיליון (rpm). גילינו את האות שלה בנוחות, המציין כי השיטה היא רגישה מאוד ניתן להשתמש כדי לזהות אפילו מאוד נמוך miRNAs שופע. בניסוי זה, השתמשנו miR168 ו U6 כמו טעינת פקדים.
באבן מחשופה זו (איור 1), חוזק האותות היה מסווג באמצעות imagej. הביטוי של miR397 הוא הגבוה ביותר במעטפת עלה וגטטיבי.
איור 1: זיהוי וכימות הביטוי של miR397 ברקמות שונות של דגימות אורז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מאגר ופתרון | תכון | ערות |
| 10 X TBE | 0.89 m תריס מאגר | pH צריך להיות מוגדר כדי 8.2 באמצעות חומצה אצטית |
| 0.89 m חומצה בורית | ||
| 30mM EDTA | ||
| ג'ל מיקס | 15% אקרילאמיד-ביאקרילאמיד סול, 19:1 | ג'ל לערבב לא צריך להכיל קריסטלים אוריאה |
| 8M שתנן | ||
| 1X TBE | ||
| צבע ג'ל | 0.05% (w/v) ברומאופנול כחול | יש לנקוט בזמן הטיפול בטופסאחר |
| 0.05% (w/v) קסילן קסייול | ||
| 100% הנחה-מעשית | ||
| התוויות של בדיקה | מאגר PNK (10X, 2 μL) | תערובת זו מכילה מולקולות רדיואקטיביות, שלב זה חייב להתבצע על ידי מיומן מיומנים בתוך מעבדה רדיואקטיבית |
| האנזים PNK (1 μL) | ||
| אוליגו (100 μM, 0.1 μL) | ||
| ƳP32 ATP (4 μL) | ||
| שטוף מאגר-I | 2X מהאס. | |
| 0.5% (w/v) SDS | ||
| שטוף מאגר-II | 0.5 X | |
| 0.5% (w/v) SDS | ||
| התפשטות מאגר-אני | 0.5 X | |
| 0.1% (w/v) SDS | ||
| התפשטות מאגר-II | 0.1 X מהאס. פי. | |
| 0.1% (w/v) SDS |
שולחן 1: טבלת מתכונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתן להשתמש בשיטה זו בהרחבה לאיתור וכימות של RNAs קטנים כולל מירנאס שופע פחות. הפרוטוקול מתאר בעיקר את השלבים של העברת ה-RNA הכולל במאגר טעינה, גודל הפרדה על ידי אלקטרופורזה ג'ל, העברה של RNA לקרום, להצליב את הקישור RNA אל ממברנה וhybridize באמצעות רדיויניום בדיקה הרצוי oligo.
הצעד הקריטי עבור כל ניסוי לחסום הוא השימוש ב-RNA באיכות טובה עבור הכנה לדוגמה. לפני טעינת ג'לים, יש לוודא כי הדגימות הן בחינם זורם ולא לדבוק טיפים הטעינה. הטיפול חייב להילקח בעת טעינת המדגם, עצה יש להוסיף ממש מעל החלק התחתון של הבאר כך מדגם תופס שכבה דקה אחת בבאר. הטמפרטורה של תנור הכלאה חייב להישמר ב 35 ° c לאיתור של miRNAs כי הם מאוד פחות שופע. לצורך הכלאה חוזרת של אבן חשופה, יש לאחסן את הקרום ב -4 ° c על-ידי שמירה על רטיבות ב-2 x.
שיטה זו ניתן להשתמש כדי לזהות RNAs קטנים מרקמות כי הם עשירים פוליסכרידים ו פוליפנולים8. בפרוטוקול זה, השימוש בייבוש ואקום לריכוז דגימות RNA מספק יציבות טובה יותר ופחות אובדן של דגימה בהשוואה לשיטות ישנות אחרות9. שינויים נוספים בשיטה כוללים, הפצת הקרום במים לפני טבילה ב-1x TBE במהלך העברת האלקטרו. זה משפר את היעילות של העברת RNA, מתן רזולוציה טובה יותר של אבן חשופה.
הגבלה מרכזית של השיטה היא שימוש ברדיואיזוטופים, הזקוקים לסגל מיומן ומעבדת רדיואיזוטופ כדי לבצע את הניסויים היברידיזציה. שיטה זו מספקת מידע מפורט לגבי כל השלבים המעורבים בניתוח כתמי RNA לאיתור מירנאס. פרוטוקול זה גם מבטיח את גודל ה-RNA הקטן מלבד זיהוי האותות שלו10. הטכניקה מספקת כלי חזק עבור ביולוגים מולקולריים כדי להעריך את השפע של RNAs קטנים שונים כגון miRNAs, siRNAs משני ו שנחונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו קונפליקטים של אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים מכירים בגישה למעבדת קרינה שמספקת המכון המארח וברית לרדיואיזוטופ. PVS מעבדה נתמכת על ידי המרכז הלאומי למדעים ביולוגיים, מכון טאטא למחקר ומענקים בסיסיים (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/ב/שוויצרי/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/קבל/119/151/2017) מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו. MP מכיר DBT-מחקר האסוציאטאניה, DBT, ממשלת הודו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
