Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلاً لعدوى فيروس التهاب الكبد B (HBV) في الخلايا 293T الجديدة المهندسة (293T-NE-3NRs، التي تعبر عن بروتP الإنسان، HNF4α، RXRα وPPARα) والخلايا الكبدية التقليدية (HepG2-NE، التعبير عن الـ NTCP البشري).
Abstract
HBV يصيب أساسا الكبدات البشرية، ولكن تم أيضا العثور على أن تصيب الأنسجة خارج الكبد مثل الكلى والخصية. ومع ذلك، تقتصر نماذج HBV القائمة على الخلايا على خطوط خلايا الكبد (مثل HepG2 و Huh7) بشكل مفرط في مستقبلات HBV الوظيفية، توروشولاتي الصوديوم شارك في نقل بوليبيبتيد (NTCP). هنا، استخدمنا 293T-NE-3NRs (293T OVEREXP الإنسان، HNF4α، RXRα وPPARα) وHpG2-NE (HEpG2 OVEREXPRESSING) كطريف الخلايا النموذجية. وقد أجريت العدوى بفيروس التهاب الكبد B في هذه الخطوط الخلوية إما باستخدام جزيئات فيروس HBV المركزة من HepG2.2.15 أو شارك في زراعة HepG2.2.15 مع خطوط الخلايا المستهدفة. تم إجراء الفلور المناعية HBcAg لHBcAg لتأكيد عدوى HBV. الطريقتان المقدمتان هنا ستساعدنا على دراسة عدوى فيروس التهاب الكبد في خطوط الخلايا غير الكبدية.
Introduction
ويؤثر التهاب الكبد B على حياة أكثر من ملياري شخص، وهو أحد التهديدات الرئيسية للصحة العامة. ما يقرب من 257 مليون شخص مصابين بشكل مزمن بفيروس التهاب الكبد B (HBV) في جميع أنحاء العالم، مما تسبب في عبء كبير على المجتمع1. خلايا الكبد ليست هي الخلايا الوحيدة المصابة بفيروس التهاب الكبد والخلايا الأخرى في الأنسجة غير الكبدية، مثل الكلى والخصيتين، هي أيضا مصابة بهذا الفيروس2،3. حاليا, نماذج خلايا عدوى HBV تقتصر على خلايا الكبد البشرية مع نماذج خط الخلية غير الكبدية فقط. وهذا يعوق دراسة عدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي والأمراض المرتبطة بهبسج الكبدي من الأنسجة غير الكبدية. هنا نقدم بروتوكولات لدراسة عدوى HBV في الخلايا 293T غير الكبدية وكذلك في الخلايا التي تعتمد على الكبد.
الصوديوم taurocholate شارك في نقل بوليبيببتيد (NTCP) هو مستقبل وظيفي لالتهاب الكبد البشري B والتهاب الكبد D فيروس4. العامل النووي الكبدي 4α (HNF4α)، مستقبلات ريتينويد X α (RXRα) ومستقبلات التكاثر المنشط البيروكسي (PPARα) هي عوامل النسخ المخصبة بالكبد التي تقيد التروبيزم الفيروسي لـ HBV. وقد تم التحقق منها لتعزيز HBV تخليق الحمض النووي الريبي ودعم النسخ المتماثل HBV في خط الخلية nonhepatoma5. نحن شيدت ثلاثة خطوط الخلايا المختلفة, HepG2 خطوط الخلية التي تعبر عن نتب (HepG2-NE), 293T خط الخلية التعبير عن NTCP (293T-NE) و 293T خط الخلية 293T التعبير عن أربعة الجينات المضيفة; (ب) نظام الـ NTCP، HNF4α، RXRα وPPARα (293T-NE-3NRs). وقد وضعت طريقتين للعدوى HBV على أساس 293T-NE-3NRs (الشكل 1). الأسلوب الأول يستخدم التلقيح في 293T-NE-3NRs مع معادلة عالية من الجينوم الفيروسي (GEq عالية (150)، DMSO وPEG8000) لمدة 24 ساعة. وتستخدم الطريقة الثانية 293T-NE-3NRs مع HepG2.2.15، والتي يمكن أن تنتج جزيئات HBV (GEq منخفضة (حوالي 1.83) دون DMSO و PEG8000)، وبالتالي محاكاة الظروف الطبيعية بشكل وثيق.
وتستمد خلايا HepG2.2.15 من خط HepG2 وإفراز مزمن HBV المعدية، فضلا عن جزيئات تحت فيروسات في وسط الثقافة6،7. السيكلوسبورين A (CsA) هو مناعة تستخدم سريريا لقمع رفض xenograft. وقد أظهرت الدراسات أن CsA يمنع دخول HBV في الكبد المستزرعة عن طريق تثبيط نشاط الناقل من NTCP ومنع ربط نتاب لبروتينات المغلف كبيرة8.
استخدمت خلايا HEPG2-NE كتحكم إيجابي في حين تم استخدام الخلايا المعالجة CsA كتحكم سلبي. من خلال المقارنة مع مجموعات التحكم الإيجابية والسلبية ، يمكننا معرفة الجينات المضيفة التي تلعب دورًا حاسمًا في عدوى فيروس التهاب الكبد B. بالإضافة إلى ذلك، من خلال هذا الوضع من عدوى فيروس التهاب الكبد B، يمكننا أيضا العثور على آليات جديدة أخرى أو الجينات المضيفة المشاركة في عدوى فيروس التهاب الكبد B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وينبغي إجراء الثقافة، وجمع المواد فوقها من خلايا HepG2.2.15 وعدوى HBV في المستوى الثاني للسلامة الأحيائية (P2) أو السلامة البيولوجية المستوى الثالث (P3) مختبر وفقا لتوجيهات السلامة البيولوجية في البلاد. يجب اتباع ممارسات السلامة المختبرية لضمان سلامة العاملين في المختبرات، وينبغي تطعيم جميع واكتشاف HBsAb إيجابية قبل إجراء تجارب HBV. مراقبة حالة الخلايا في كل خطوة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. واستخدمت عينات المصل البشري وفقا للموافقة التي حصل عليها مجلس المراجعة المؤسسية لكلية الطب بجامعة شانتو.
1. لثقافة الخلية HepG2.2.15
ملاحظة: HepG2.2.15 الخلية الفائقة، HepG2.2.15 الخلية التركيز الفائق وجميع النصائح، قارورة، لوحات، والأنابيب التي تأتي في اتصال مع HepG2.2.15 ينبغي التخلص منها بعد أن غارقة في 2٪ في فيروسي بين عشية وضحاها.
- إزالة القارورة التي تحتوي على خلايا HepG2.2.15 من النيتروجين السائل وذوبان الجليد عن طريق تدوير القارورة بلطف في حمام مائي 37 درجة مئوية.
ملاحظة: للحد من احتمالية التلوث، حافظ على الغطاء خارج الماء. يجب أن يكون الذوبان سريعًا (حوالي 2 دقيقة). - إزالة القارورة من حمام الماء بمجرد إذابة الخلايا وتطهيرها مع الإيثانول 70٪.
ملاحظة: من هذه النقطة تنفيذ كافة الخطوات تحت شروط اكمت صارمة. - نقل الخلايا إلى قارورة زراعة الأنسجة 2 سم2 وإضافة 4 مل من ثقافة كاملة المتوسطة (DMEM تحتوي على 10٪ FBS، البنسلين 100 U/mL، ستريبتوميسين 0.1 ملغ/مل). احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO2.
2. مجموعة من HepG2.2.15 الخلية ثقافة فائقة
- ثقافة HepG2.2.15 خلية في قارورة T25 في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في حاضنةمرطبة. تغيير الوسط كل 3 أيام.
- جمع الخلية فائقة في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 مل. أغلق الغطاء بحزم ولفه بفلم البارافين.
- تخزين HepG2.2.15 فائقة في -20 درجة مئوية للحفاظ على فيروس HBV نشطة.
3. مركزة HepG2.2.15 فائقة
- إزالة HepG2.2.15 سوبرنات من -20 درجة مئوية وذوبان في 4 درجة مئوية.
- لإزالة شظايا الخلية، قم بتصفية جهاز HepG2.2.15 مع غشاء 0.45 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي جديد 50 مل. أولاً، منع مرشح عن طريق تصفية 10 مل من DMEM مع 10٪ FBS قبل تصفية الفيروس، ثم تصفية فائقة ثقافة الخلية.
- إضافة 14 مل من السوبر تمت تصفيتها إلى عمود مركز الفيروسات وإغلاق الغطاء. الطرد المركزي العمود في 3200 س ز لمدة 35 دقيقة في جهاز طرد مركزي الغزل الأفقي. جمع التركيز 2.2.15 اللقلق من HepG2.15 (حوالي 200 ميكرولتر) في أنبوب 1.5 مل.
- غسل العمود مع DMEM مرة واحدة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من DMEM وجمعه في أنبوب 1.5 مل.
4. الكشف عن الحمض النووي HBV في التركيز الفائق
- بدوره على سخان كتلة الجافة وتعيين درجة الحرارة إلى 100 درجة مئوية.
- لضمان أن تركيز الحمض النووي HBV في التركيز فوق 2.2.15 هو ضمن نطاق منحنى القياسية، وتمييع التركيز 20 أضعاف بإضافة 10 ميكرولتر من HepG2.2.15 التركيز فوق إلى 190 ميكرولتر من DMEM في أنبوب microcentuge 1.5 مل. إضافة 200 ميكرولتر من HepG2.2.15 فائقة، سيطرة سلبية (مصل HBV سلبي من متبرع صحي)، HBV السيطرة الإيجابية (مصل إيجابي HBV من مرضى HBV) وأربعة تخفيف من المراجع الكمية المقدمة في مجموعة (2.00 0 ×10 6، 2.0 × 105، 2.0 × 104، 2.0 × 103 GEq / mL) ، على التوالي لفصل أنابيب 1.5 مل microcentuge.
- إضافة 450 ميكرولتر من HBV DNA استخراج العازلة من عدة إلى جميع الأنابيب الثمانية أعلاه 1.5 مل، دوامة ل15 ق وتدور أسفل ل 10 ق. احتضان في 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في سخان كتلة جافة. جهاز طرد مركزي عند 12، 000 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 27 ميكرولتر من المزيج الرئيسي PCR و 3 ميكرولتر من إنزيم طق البوليميراز إلى أنابيب PCR وضعت على الجليد.
ملاحظة: يحتوي المزيج الرئيسي PCR المقدم في المجموعة على ال أوليات ضد المنطقة المحفوظة من الحمض النووي HBV. - أضف 20 ميكرولتر من السائل الفائق المُطرد إلى أنابيب PCR الموضوعة على الجليد. غطيها بإحكام وتدور لأسفل لمدة 10 s.
- استخدام الشروط التالية على جهاز PCR في الوقت الحقيقي: 93 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 10 دورات من 93 درجة مئوية لمدة 45 s تليها 55 درجة مئوية لمدة 60 s؛ ثم 30 دورات من 93 درجة مئوية ل 30 s تليها 55 درجة مئوية لمدة 45 s لتنفيذ PCR في الوقت الحقيقي.
ملاحظة: يحتوي المزيج الرئيسي المقدم في المجموعة التجارية على التمهيديات ضد المنطقة المحفوظة من الحمض النووي HBV. - تصدير القيم Ct التي تم الحصول عليها وإنشاء منحنى قياسي كما هو موضح في الجدول 1 والشكل 2.
- استنادا إلى منحنى قياسي، وحساب تركيز الحمض النووي HBV من HepG2.2.15 التركيز الفائق المخفف 20x كما هو مبين في الجدول 2. حساب تركيز الحمض النووي HBV من التركيز HepG2.2.15(الجدول 2).
- قم بتقسيم التركيز فوق درجة الحرارة في 90 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
5. في المختبر عدوى من خلايا HepG2-NE و 293T-NE-3NRs
- إعداد متوسط العدوى التالية في DMEM /F-12: 10٪ FBS، 4 mM الجلوتامين، 0.1 mM NEAA، 1 mM بيروفات الصوديوم، 100 U/mL البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 1 ميكروغرام/مل بوروميسين، 40 نانوغرام/مل dexamethasone، 20 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون و5 ميكروغرام/مل أنسولين. يُخزن عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه الخلايا الإيجابية هي9مقاومة للبوروميسين. - إضافة 0.1٪ الجيلاتين إلى 5 آبار من 48 جيدا لوحة، 200 μL إلى كل بئر. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، والتخلص من supernatant. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية ل2 ساعة أخرى.
- بذور HepG2-NE في كثافة 1 × 104 الخلايا في 2 آبار لكل من. بذور 293T-NE-3NRs الخلايا بكثافة 1 × 104 الخلايا في 2 الآبار لكل منهما (حمض الريتينويك جميع عبر في 1 ميكرومول / لتر و 1 كليفريك حمض في 1 ملليمول / لتر تم إضافة التركيزات النهائية إلى المتوسطة لتنشيط RXRα وPPARα مستقبلات الهرمون النووي، على التوالي). البذور 293T-NE في 1 بئر في كثافة 1 × 104 الخلايا.
ملاحظة: مرور الخلايا عند التقاء sub-التقاء باستخدام 0.25% التربسين. عد رقم الخلية ثم قم بزرع الخلايا إلى كثافة مناسبة. - احتضان الخلية في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في حاضنة مرطب لمدة 24 ساعة. مراقبة الخلايا بعد 24 ساعة والمضي قدما مع العدوى إذا كانت الخلايا صحية.
- إعداد مجمع العدوى كما هو مذكور في الجدول 3، إضافة HBV (HepG2.2.15 التركيز فوق) ، DMSO ، PEG8000 والعدوى المتوسطة إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. إعداد مخزون CsA عن طريق حله في DMSO إلى تركيز 5 mM والحفاظ على المخزون عند -20 درجة مئوية. الحل العامل لـ CsA هو 5 ميكرومتر. البذور 1 ×104 خلايا في بئر من لوحة 48-جيدا. إضافة 100 ميكرولتر من HepG2.2.15 مركز افرا (تحتوي على HBV 1.5063 × 107 GEq / مل) لتصيب الخلايا في 150 GEq / الخلية.
- إضافة 500 μL من مجمع العدوى إلى كل بئر واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في حاضنة مرطب لمدة 24 ساعة.
- اغسل الخلايا مرتين بـ 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل تغيير الوسط. إضافة 1 مل من المتوسط في كل بئر. إذا كانت حالة الخلية ضعيفة وبعض الخلايا عائمة، قم بتغيير الوسيط مباشرة. هذا هو اليوم 1 من العدوى. تغيير المتوسطة بلطف كل 2 أيام.
- في اليوم 11 ، وغسل الخلايا مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع الميثانول الباردة المثلج للflufluorescence.
6. HepG2.2.15 شارك في الثقافة مع HepG2 - NE / 293T - NE - 3NRs / 293T - NE
- إضافة 1 مل / بئر من 0.1٪ الجيلاتين إلى 5 آبار من 6 جيدا لوحة. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة والتخلص من supernatant. احتضان لوحة مرة أخرى ل 2 ساعة أخرى في 37 درجة مئوية لتجفيف تماما في البئر.
- البذور 1 × 105 خلايا / بئر من HepG-NE في 2 آبار، 293T-NE-3NRs في 2 آبار، و 293T-NE في 1 بئر من لوحة. البذور 1 × 105 خلايا / بئر من HepG2.2.15 على خمسة إدراج الغشاء (24 مم، 0.4 ميكرومتر المسام قطر، غير المصقول) في لوحة 6 جيدا منفصلة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في حاضنة مرطب لمدة 24 ساعة.
- بعد 24 ساعة، إذا كانت جميع الخلايا معتنقية وفي حالة جيدة، الاستعداد لثقافة المشاركة. تجاهل المتوسطة في 6-جيدا لوحة وغشاء الخلية إدراج. ضع الغشاء مع 3NRs HepG2.2.15 في 6 آبار لوحة بذر مع HepG-NE، 293T-NE-3NRs و 293T-NE بواسطة ملاقط. احتضان الخلية في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في حاضنة مرطب، وتغيير المتوسطة كل 3-4 أيام.
ملاحظة: تعيين المجموعات كما يلي: حسنا 1: 293T-NE ثقافة المشتركة مع HepG 2.2.15; حسنا 2: HepG2-NE شارك في الثقافة مع HepG 2.2.15; حسنا 3: 293T-NE-3NRs شارك في الثقافة مع HepG2.2.15؛ حسنا 4: HepG2-NE شارك في الثقافة مع HepG 2.2.15 (إضافة CsA); حسنا 5: 293T-NE-3NRs شارك في الثقافة مع HepG2.2.15 (إضافة CsA); إضافة متوسطة كاملة إلى عدد جيد 1 و 2 و 3، إضافة المتوسطة مع 5 μM CsA إلى رقم جيد 4 و 5 جيدا، حوالي 9 مل لكل بئر، تأكد من وسائل الإعلام هي في اتصال من أجل جزيئات الفيروس إلى الهجرة من transwells لتصيب الخلايا. - بعد 10 أيام، وإزالة إدراج الغشاء، إضافة برنامج تلفزيوني إلى لوحة 6-جيدا وغسل بلطف مرتين، وإصلاح الخلايا مع الميثانول الباردة المثلج للflufluoresence.
7. أداء الفلوروس المناعي لHBcAg
- إصلاح الخلايا مع الميثانول الباردة الجليد في -20 درجة مئوية لأكثر من 3 ح. تجاهل الميثانول. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر، كرر لمدة 3 مرات.
- أضف 5% BSA (100 ميكرولتر/48-جيدا لوحة, 500 ميكرولتر/6-جيدا لوحة), يهز على شاكر الأفقي ل1 ساعة في 40 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة.
- أضف محلول الأجسام المضادة الأساسية HBcAg (الأجسام المضادة الأولية: محلول BSA 5٪ = 1:200 ، 100 ميكرولتر / 48-جيد لوحة ، 500 ميكرولتر / 6-well-plate) ، اهز بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- غسل الآبار مع PBST (PBS مع 0.1٪ توين 20)، لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر، كرر لمدة 3 مرات.
- إضافة حل الأجسام المضادة الثانية (594 الأجسام المضادة المسمى التي أثيرت في الماعز ضد الأرنب IgG: برنامج تلفزيوني = 1:1،000، 100 ميكرولتر /48-جيدا لوحة، 500 ميكرولتر / 6-جيدا لوحة)، وتغطية لوحة مع احباط ويهز لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل مرة أخرى مع PBST لمدة ثلاث مرات، ويهز لمدة 10 دقيقة لكل من.
- إضافة 1 ميكروغرام / مل DAPI، يهز لمدة 2 دقيقة. غسل مرتين مع PBST على شاكر لمدة 5 دقائق لكل من. تجاهل PBST. إضافة برنامج تلفزيوني ومراقبة تحت مجهر المناعةfluorescence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن شيدت pSIN-NTCP-EGFP plasmid التعبير عن نتب وEGFP الانصهار ومع مقاومة البوروميسين. تم نقل البلازميد إلى خلايا HepG2 و 293T لبناء خطوط الخلايا المستقرة HepG2-NE و 293T-NE التعبير عن NTCP و EGFP. تم نقل Plasmids (pSIN-HNF4α، pSIN-RXRα، pLV-PPARα-بورو-العلم) مع مقاومة البوروميسين والتعبير إلى خلايا 293T-NE لبناء خط خلية مستقر يعبر عن 4 الجينات المضيفة9. ويمكن ملاحظة التعبير عن NTCP-EGFP من قبل الفلورس الخضراء، والتحقق من قبل qPCR ولطخة الغربية (البيانات غير مبينة، ولكن انظر العمل السابق 9).
وأظهرت الأجسام المضادة الأولية من HBcAg وDAPI المحتضنة مع الخلايا الثابتة تلطيخ متميزة عند ملاحظة استخدام الهدف 10x على المجهر المقلوب الفلورية. تم تأكيد التوطين النووي عن طريق تلطيخ DAPI (الشكل 3 والشكل 4- العمود الثالث). يتم التعبير عن NTCP-EGFP على غشاء الخلية ويمكن أن يكون موجوداً بواسطة الفلورس الخضراء(الشكل 3 والشكل 4- العمود الثاني). يمكن تحديد مواقع التعبير في HBcAg بواسطة الفلورس الأحمر(الشكل 3 والشكل 4- العمود الأول). عندما DAPI، NTCP وHBcAg في نفس الخلية، فهذا يعني أن الخلية قد تم بنجاح مع فيروس التهاب الكبد(الشكل 3 والشكل 4-العمود الأخير).
وكانت مجموعة CSA السيطرة السلبية. منعت CsA HBV من دخول الخلايا عن طريق منع NTCP. كتحكم إيجابي، يمكن أن تُعبر خلايا HepG2-NTCP-EGFP المصابة عن HBcAg. تم الكشف عن HBcAg في 293T-NE-3NRs الخلايا ولكن ليس في خلايا 293T-NE، مما يشير إلى أن NTCP ليس العامل الوحيد الضروري لعدوى فيروس التهاب الكبد B في 293T. وكان تركيز الفلور المناعي للخلايا المصابة بالهيبج 2.2.15 من الخلايا المُزَوَّلة نفس الخلايا المُزَوَّلة مع خلية HepG2.2.15. وأظهرت أن HBcAg تم التعبير عنها في 293T-NE-3NRs وخلايا HepG2-NE، وهذا يشير إلى أن الجينات المضيفة الأربعة (NTCP، HNF4α، RXRα وPPARα) يسهل عدوى HBV. ولكن إشارات HBcAg في 293T-NE-3NRs كانت أقل مقارنة مع HepG2-NE، مما يشير إلى أن عدوى HBV قد تتأثر أيضًا بعوامل مضيفة أخرى.
| مرجع كميّ | مرجع كميّ | مرجع كميّ | مرجع كميّ | التحكم السلبي | تحكم إيجابي HBV | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | اي | 12.3865 |
| GEq / مل | 2*10^3 | 2*10^4 | 2*10^5 | 2*10^6 | —— | —— |
الجدول 1: قيم قيراطية للمراجع الكمية.
| هب جي 2.2.15 مُتَعَدّر |
1/20 هبغ 2.2.15 التركيز |
هب جي 2.2.15 التركيز |
|
| Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
| GEq / مل | 1.65*10^4 | 7.53*10^5 | 1.5*10^7 |
الجدول 2: قيم التصوير المقطعي للحمض النووي HBV التي تم الحصول عليها من هبغ 2.2-15 مُنَتَجِر. تمثل القيم قيم Ct للحمض النووي HBV التي تم الحصول عليها من المُنَع الأصلي، أو تخفيف 1/20 أو تركيزه.
| 293T-NE | HepG2-NE | 293T-NE-3NRs | |||
| Hbv | Hbv | HBV + CsA | Hbv | HBV + CsA | |
| HBV GEq / الخلية | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| HBV μL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CsA μL (5 ميكرومتر) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| DMSO μL | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
| 40٪ PEG8000 ميكرولتر | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| عدوى متوسطة μL | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
| مجموع μL | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
الجدول 3: مركب العدوى. وبلغ الحجم الإجمالي المستخدم 500 ميكرولتر.
الشكل 1: تمثيل بياني للبروتوكول. وقد تم إما أن يكون الـ HepG2.2.15 مُزرعاً مع 293T-NE-3NRs ولوحظت العدوى باستخدام المجهر المناعي أو أن المُنْتَكَنَة المحتوية على جسيمات فيروسية قد ركّزت وأدخلت في خلايا مُزَرَثَّة 293T-NE-3NRs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: منحنى معيار HBV محسوب من قيم Ct. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تم استخدام التركيز فوق 293T-NE و 293T-NE-3NRs و خلايا HepG2-NE مع 150 GEq لكل خلية. تم تحديد تعبير HBcAg عن طريق فحص الفلورس المناعي. تم التعبير عن HBcAg في خلايا 293T-NE-3NRs وHpG2-NE، في حين أنه لم يتم ملاحظة أي تعبير في هذه الخلايا المعالجة بـ CsA (مثبط دخول HBV) وخلايا 293T-NE. شريط مقياس = 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: 293T-NE، 293T-NE-3NRs و HepG2-NE شاركوا في زراعة خلايا HepG2.2.15. تم تحديد تعبير HBcAg عن طريق فحص الفلورس المناعي. تم التعبير عن HBcAg في خلايا 293T-NE-3NRs وHpG2-NE، في حين أنه لم يتم ملاحظة أي تعبير في هذه الخلايا المعالجة بـ CsA (مثبط دخول HBV) وخلايا 293T-NE. شريط مقياس = 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نقدم بروتوكولات لعدوى فيروس التهاب الكبد في خلايا HEPG2-NE غير الكبدية 293T-NE-3NRs والخلايا الكبدية القائمة على الكبد. 293T-NE-3NRs كانت مناسبة لعدوى HBV في كل من GEq عالية ومنخفضة. وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار الخطوات الحاسمة التالية عند استخدام البروتوكول. حالة الخلية هو عامل مهم لنجاح العدوى. يجب تغيير متوسط العدوى في الوقت المناسب بعد الفترة الأولية من الإصابة بفيروس التهاب الكبد B. 293T-NE-3NRs خلايا هشة عادة بعد العدوى مع اترات عالية الفيروسية. لذلك، يجب غسل هذه الخلايا بلطف لتجنب فصل الخلايا بعد 24 ساعة من العدوى. عند استخدام إدراج الغشاء للثقافة ، يجب علينا التأكد من أن كثافة البذر الأولية مناسبة ، والغرفة مغمورة بما فيه الكفاية في وسائل الإعلام لضمان ارتباط فعال من الجسيمات الفيروسية إلى خلايا 293T-NE-3NRs. للكشف عن HBcAg، يجب علينا غسل الخلايا بلطف قبل التثبيت لتجنب الإشارات الإيجابية الكاذبة. يجب توخي الحذر أثناء عملية الغسل حيث تميل خلايا 293T إلى الانفصال عن القاع.
إصابة 293T-NE-3NRs من قبل HBV ليست سهلة كما هو الحال مع HEpG2 التعبير عن NTCP. على عكس HepG2 ، هذه الخلايا سهلة الانفصال عن الجزء السفلي من اللوحة أثناء الثقافة. وهذه الخلايا هي أكثر هشاشة من HepG2 بعد العدوى باستخدام DMSO و PEG80000 أو الثقافة المشتركة مع HepG2.2.15 لمدة 10 أيام دون passaging. لذلك، نحن بحاجة إلى معطف لوحة بنسبة 0.1٪ الجيلاتين والبذور رقم الخلية المناسبة في لوحة. وينبغي توخي المزيد من الحذر لمنع الخلايا فصل أثناء تغيير المتوسطة, غسل أو إصلاح الخلايا.
بالمقارنة مع أساليب العدوى بفيروس التهاب الكبد B التقليدية، اعتمدنا خط خلية 293T المهندسة، 293T-NE-3NRs، كنموذج العدوى وشاركنا في استزراعه مع HepG2.2.15. ومن المثير للاهتمام، تم إصابة خلايا 293T-NE-3NRs بنجاح مع HBV حتى في GEq منخفضة الذي يحاكي الظروف الفسيولوجية الطبيعية بشكل أكثر دقة. النمذجة عدوى HBV في 293T-NE-3NRs هو تكملة مفيدة لتقليدية واحدة بسبب خلفية غير الكبدية من هذه الخلايا. تطبيق الأسلوب قد يساعدنا على تحديد العوامل المضيفة رواية على الرغم من أن فعالية العدوى من هذه الطريقة ليست عالية مثل التقليدية. نحن نعتقد أن النماذج في المختبر المعروضة في هذه المخطوطة سوف تساعد في تسهيل اكتشافات جديدة في هذا المجال.
وهناك قيد على هذا الأسلوب هو كفاءة العدوى. العدوى في المختبر HBV ليست سهلة كما أن في الجسم الحي. النماذج الحالية في المختبر لBBB محدودة بسبب ضعفها للعدوى HBV، حيث مطلوب inocula عالية للغاية لبدء العدوى وليس هناك انتشار فيروسي واضح10. هذا في تناقض صارخ مع الملاحظات في الجسم الحي حيث واحد HBV virion يمكن أن تصيب جزءا كبيرا من خلايا الكبد في مجرد أسابيع11،12. وهكذا ، فإن تحديد العوامل المضيفة الجديدة التي تؤثر على تكرار HBV مفيد للغاية لتعزيز فهمنا لتفاعلات HBV والمضيف. وعلاوة على ذلك، عن طريق محاكاة في الكبد أو الكلى في الجسم الحي، يمكن أن تنشأ organoids الوظيفية التي من شأنها أن تُكَلَّم بشكل وثيق الأداء الفسيولوجي للكبد البشري أو الكلى13،14. وهذا من شأنه أن يعزز إلى حد كبير فهمنا للعدوى بفيروس التهاب الكبد B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 81870432 و81570567 إلى X.L.Z.) (رقم 81571994 إلى P.N.S.) وصندوق الأبحاث للعلماء الشباب الدوليين (رقم 81950410640 إلى W.I.)؛ مؤسسة جامعة لي كا شينغ شانتو (رقم 1999-1999). L1111 2008 إلى P.N.S.). نود أن نشكر البروفيسور ستانلي لين من كلية الطب بجامعة شانتو على المشورة المفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
