Summary
本手稿描述了新型工程293T细胞(293T-NE-3NRS,表达人类NTCP、HNF4+、RXR+和PAR+)和传统肝细胞(HepG2-NE,表达人类NTCP)中乙型肝炎病毒(HBV)感染的详细方案。
Abstract
HBV主要感染人类肝细胞,但也被发现感染肾外组织,如肾脏和睾丸。尽管如此,基于细胞的HBV模型仅限于肝瘤细胞系(如 HepG2 和 Huh7)过度表达功能性HBV受体,钠陶罗胆酸盐共同运输多肽(NTCP)。在这里,我们使用293T-NE-3NR(293T过度表达人类NTCP、HNF4+、RXR+和PAR+)和 HepG2-NE(HepG2 过行NTCP)作为模型细胞系。 这些细胞系中的HBV感染是通过使用来自 HepG2.2.15 的浓缩 HBV 病毒颗粒或与目标细胞系共同培养 HepG2.2.15 进行的。为HBcAg执行HBcAg免疫荧光以确认HBV感染。这里介绍的两种方法将有助于我们研究非肝细胞系的HBV感染。
Introduction
乙型肝炎影响20多亿人的生命,是公共卫生面临的主要威胁之一。全世界约有2.57亿人长期感染乙型肝炎病毒(HBV),给社会带来沉重负担。肝细胞不是受HBV感染的唯一细胞,非肝组织中的其他细胞,如肾脏和睾丸,也感染了这种病毒2,2,3。目前,HBV感染细胞模型仅限于人类肝细胞,只有很少的非肝细胞系模型。这妨碍了对乙肝病毒感染和非肝组织乙肝病毒相关病理学的研究。在这里,我们提出了在非肝293T细胞以及基于肝瘤的细胞中研究HBV感染的协议。
陶罗胆酸钠与多肽(NTCP)是人体乙型肝炎和D型肝炎病毒4的功能受体。肝细胞核因子4°(HNF4°)、视网膜X受体+(RXR+)和过氧化物增殖剂活化受体(PPAR+)是限制HBV病毒性转录因子的肝状转录因子。它们已被验证,以促进HBV基因组RNA合成,并支持HBV复制在非肝瘤细胞系5。我们构建了三种不同的细胞系,表示NTCP(HepG2-NE)的 HepG2细胞系,表达NTCP(293T-NE)的293T细胞系和表达四个宿主基因的293T细胞系;NTCP、HNF4+、RXR+和PAR+(293T-NE-3NR)。基于293T-NE-3NRs开发了两种乙肝病毒感染方法(图1)。第一种方法使用接种293T-NE-3NR高病毒基因组等效性(高GEq(150),DMSO和PEG8000)24小时。第二种方法采用与 HepG2.2.15 共同培养 293T-NE-3NR 的方法,它可以产生 HBV 粒子(低 GEq(约 1.83),无需 DMSO 和 PEG8000),从而密切模拟自然条件。
HepG2.2.15细胞来自 HepG2 线和慢性分泌传染性 HBV,以及亚病毒颗粒进入培养基 6,7,7。Cyclosporin A (CsA) 是一种免疫抑制剂,临床上用于抑制异种移植排斥。研究表明,CSA通过抑制NTCP的运输机活性,阻断NTCP与大包络蛋白8的结合,抑制HBV进入培养的肝细胞。
HepG2-NE细胞用作阳性对照,而CsA处理细胞用作阴性对照。通过与阳性和阴性对照组进行比较,我们可以找出哪些宿主基因在HBV感染中起着关键作用。此外,通过这种乙肝病毒感染模式,我们还可以找到其他与乙肝病毒感染相关的新机制或宿主基因。
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Protocol
根据国家的生物安全指南,应在生物安全II(P2)或生物安全III(P3)实验室进行从 HepG2.2.15 细胞和 HBV 感染中采集超级纳的培养。应遵循实验室安全做法,以确保实验室人员的安全,在进行HBV实验之前,应接种所有疫苗并检测出HBsAbb阳性。在继续下一步之前,观察每个步骤的单元格状态。根据汕头大学医学院审查委员会的批准,使用人体血清样本。
1. HepG2.2.15 细胞培养
注:HepG2.2.15细胞上流液,HepG2.2.15细胞上流液,以及所有与 HepG2.2.15 接触的尖端物、烧瓶、板和管,在浸泡在 2% 的维苏化剂中过夜后应予以处置。
- 从液氮中去除含有 HepG2.2.15 细胞的小瓶,并在 37 °C 水浴中轻轻旋转小瓶解冻。
注:为了减少污染的可能性,请将盖子远离水。解冻应快速(约 2 分钟)。 - 当细胞解冻后,立即将小瓶从水浴中取出,用70%乙醇进行消毒。
注:从这一点执行所有步骤在严格的无菌条件下。 - 将细胞转移到25厘米2组织培养瓶中,加入4 mL的完整培养基(含有10%FBS、青霉素100 U/mL、链霉素0.1毫克/mL)的DMEM。在37°C的加湿培养箱中用5%CO2孵育细胞。
2. HepG2.2.15 细胞培养上超常的集合
- T25烧瓶中的培养物 HepG2.2.15 细胞在 37 °C 下,在加湿培养箱中培养 5% CO2。每 3 天更换一次介质。
- 将细胞上一提液收集在 50 mL 离心管中。用石蜡薄膜牢牢合上盖子并包裹起来。
- 将 HepG2.2.15 上流液储存在 -20 °C,以保持 HBV 病毒活性。
3. 集中 HepG2.2.15 上一液
- 从-20°C中去除 HepG2.2.15 上因,并在 4 °C 下解冻。
- 要去除细胞碎片,请用0.45μm膜过滤 HepG2.2.15 上清液,过滤到新的 50 mL 离心管中。首先,在过滤病毒之前,先用10%FBS过滤10mL的DMEM,然后过滤细胞培养物。
- 将 14 mL 过滤的上一位液添加到病毒集中器柱中,然后合上盖子。在水平旋转离心机中,以 3,200 x g的离心柱离心 35 分钟。将 HepG2 . 2 . 15 上大(约 200 μL)收集到 1 . 5 mL 管中。
- 加入 200 μL 的 DMEM,用 DMEM 清洗一次柱,然后收集到 1.5 mL 管中。
4 . 在上流中检测 HBVDNA
- 打开干块加热器,将温度设置为 100°C。
- 为确保 HepG2.2.15 上流液浓缩物中的 HBV DNA 浓度在标准曲线范围内,在 1.5 mL 微离心管中将 10 μL 的 HepG2.2.15 上流液浓缩物添加到 190 μL 的 DMEM 中,稀释浓缩物 20 倍。加入200μL的 HepG2.2.15 上流液,阴性对照(来自健康供体中的 HBV 阴性血清),HBV阳性对照(HBV患者对 HBV 阳性血清)和试剂盒中提供的四种定量参考的稀释(2.2. 0 x 106、 2.0 x 105、 2.0 x 104、 2.0 x 103 GEq /mL),分别分离 1.5 mL 微离心管。
- 将 450 μL 的 HBV DNA 提取缓冲液从试剂盒添加到上述 8 个 1.5 mL 管中,旋转 15 s,在 100°C 下在干块加热器中孵育 10 分钟。在室温下以12,000 x g离心5分钟。
- 将 27 μL 的 PCR 主混合物和 3 μL 的 Taq 聚合酶添加到放在冰上的 PCR 管中。
注:套件中提供的 PCR 主混合物包含针对 HBV DNA 保存区域的底注。 - 将 20 μL 离心上清液加入放在冰上的 PCR 管中。盖紧,旋转10 s。
- 在实时 PCR 机器上使用以下条件:93 °C 2 分钟,10 个周期 93 °C 45 s,55 °C 60 秒;然后30个周期的93°C为30 s,然后55°C为45 s进行实时PCR。
注:商用套件中提供的主混合物具有针对 HBV DNA 保存区域的底注。 - 导出获得的 Ct 值并生成标准曲线,如表 1 和图2 所示。
- 根据标准曲线,计算 HepG2 . 2 . 15 中稀释 20 倍的 HBV DNA 浓度,如表2 所示。计算 HepG2.2.15 上流液精的 HBV DNA 浓度 (表 2).
- 将 HepG2 . 2 . 15 上大分在等分中,储存在 - 80 °C,直到使用。
5. HepG2-NE和293T-NE-3NRs细胞的体外感染
- 在DMEM/F-12中准备以下感染媒介:10%FBS, 4 mM谷氨酰胺补充剂,0.1 mM NEAA,1 mM丙酮钠,100 U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,1微克/mL纯霉素,40纳克/mL脱沙松,20μg/mL氢皮质松和5μg/mL胰岛素。储存在4°C。
注:这些NTCP阳性细胞具有抗纯霉素9。 - 将0.1%明胶加入5口48孔板,每口井200μL。在37°C下孵育板2小时,丢弃上一液。在37°C下孵育板2小时。
- 种子 HepG2-NE 密度为 1 x 104细胞,每个孔为 2 个孔。种子293T-NE-3NRs细胞密度为1×104细胞,每个孔(全转视网膜酸在1μmol/L和氯纤维酸在1 mmol/L最终浓度添加到介质中,以激活RXR+和PAR®核激素受体,分别)。种子293T-NE在1井的密度为1×104细胞。
注:使用0.25%的三辛在亚汇合通过细胞。计算细胞数,然后将细胞种子设定为适当的密度。 - 在37°C下孵育细胞,在加湿培养箱中孵育5%CO222小时。观察细胞24小时后,如果细胞健康,则继续感染。
- 准备表3中提到的感染复合物,添加HBV(HepG2.2.15上流液)、DMSO、PEG8000和感染介质至1.5 mL微离心管。通过将 CSSO 中溶解到 5 mM,并使库存保持 -20 oC,准备 CSA 库存。CsA 的工作解决方案为 5 μM。种子 1×104细胞每井 48 井板。加入100μL的 HepG2.2.15 上流液浓缩物(含有 HBV 1.5063 ±107 GEq/mL),在 150 GEq/细胞下感染细胞。
- 将500μL的感染复合物添加到每个井中,在37°C下孵育细胞,在加湿培养箱中孵育5%CO 2,24小时。
- 在更换介质之前,用500μL的PBS清洗细胞两次。在每个井中加入1 mL的介质。如果单元格状态较差,并且某些单元格是浮动的,则直接更改介质。这是感染的第一天。每2天轻轻更换一次介质。
- 第11天,用500μL的PBS清洗细胞两次,用冰冷甲醇修复细胞,进行免疫荧光。
6. HepG2.2.15 与 Hepg2-NE / 293T-NE-3nrs / 293T-NE 共同培养
- 在 6 个井板的 5 口井中加入 1 mL/0.1% 明胶。在37°C下孵育板2小时,然后丢弃上一液。在37°C下再次孵育板2小时,使井完全干燥。
- 种子 1 x 105细胞/井的 HepG-NE 成 2 孔,293T-NE-3NRs 到 2 孔,293T-NE 到 1 孔的板。种子 1 x 105细胞/孔 HepG2.2.15 到五个膜插入 (24 毫米, 0.4 μm 孔径, 未涂层) 在一个单独的 6 孔板。在37°C下孵育细胞,在加湿培养箱中孵育5%CO22,24小时。
- 24小时后,如果细胞都粘附且状态良好,则为共培养做好准备。丢弃6孔板和细胞膜插入中的介质。将带 HepG2.2.15 的膜插入物放入 6 孔板中,用 HepG-NE、293T-NE-3NRs 和 293T-NE 用钳子播种。在37°C下孵育细胞,在加湿培养箱中孵育5%CO2,每3-4天更换一次培养基。
注:将组设置为如下:井 1:293T-NE 与 HepG 2.2.15 共同培养;井 2: HepG2-NE 与 HepG 2.2.15 共同培养;井 3: 293T - ne - 3nr 与 Hepg2.2.15 共同培养;好 4: Hepg2 - ne 与 Hepg 2.2.15 (添加 Csa) 共同培养;好 5: 293T - NE - 3nrs 与 Hepg2.2.15 共同培养 (添加 Csa);将完整的介质添加到井号 1、2 和 3,将带 5 μM CsA 的介质添加到井号 4 和 5 井,每个井约 9 mL,确保介质接触,使病毒颗粒从转流井迁移至感染细胞。 - 10天后,取出膜插入物,将PBS加入6孔板,轻轻清洗两次,用冰冰甲醇固定细胞进行免疫荧光。
7. 为HBcAg执行免疫荧光
- 在-20°C下用冰冰甲醇固定细胞超过3小时,丢弃甲醇。在摇床的室温下用 PBS 清洗细胞 10 分钟,重复 3 次。
- 加入 5% BSA(100 μL/48 井板、500 μL/6 井板),在 40 rpm 和室温下在水平摇床上摇动 1 小时。
- 加入HBcAg原抗体溶液(原抗体:5%BSA溶液±1:200,100μL/48井板,500μL/6井板),在4°C下过夜。
- 用 PBST(PBS,补间 20)洗井,在摇床室温下洗涤 10 分钟,重复 3 次。
- 加入第二个抗体溶液(594标记抗体在山羊对兔子IgG:PBS = 1:1,000,100μL/48井板,500μL/6-井板,用铝箔覆盖板,并在室温下摇动2小时。
- 用 PBST 再次清洗三次,每次摇动 10 分钟。
- 加入1μg/mL DAPI,摇动2分钟,用PBST在摇床上清洗两次,每次5分钟。丢弃 PBST。添加PBS并在免疫荧光显微镜下观察。
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Representative Results
我们构建了pSIN-NTCP-EGFP质粒表达NTCP和EGFP融合,具有霉素耐药性。质粒被转染到 HepG2 和 293T 细胞中,以构建稳定的细胞系 HepG2-NE 和 293T-NE 表达 NTCP 和 EGFP。具有普洛霉素耐药性和表达的质粒(pSIN-HNF4+,pSIN-RXR+,pLV-PPAR®-puro-flag)被转染成293T-NE细胞,以构建一个稳定的细胞系,表达4个宿主基因9。NTCP-EGFP的表达可以通过绿色荧光来观察,并经qPCR和西印验证(数据未显示,但见上一页9。
在荧光倒置显微镜上使用10倍靶度观察时,用固定细胞孵育的HBcAg和DAPI的初级抗体显示出明显的染色。使用DAPI染色证实了核定位(图3和图4——第三列)。NTCP-EGFP在细胞膜上表达,可以通过绿色荧光定位(图3和图4-第二列)。HBcAg 的表达点可以通过红色荧光定位(图3 和图4 -第一列)。当 DAPI、NTCP 和 HBCAg 在同一细胞中时,这意味着该细胞已成功感染 HBV(图 3 和图 4- 最后一列)。
CsA 组是负控制。CSA 通过阻断 NTCP 阻止 HBV 进入细胞。作为一种阳性对照,受感染的 HepG2-NTCP-EGFP 细胞可以表达 HbAgg。在293T-NE-3NRs细胞中检测到HBcAg,但在293T-NE细胞中未检测到,这表明NTCP并不是293T中HBV感染的唯一重要因素。感染 HepG2.2.15 上流液浓缩液的细胞的免疫荧光与与 HepG2.2.15 细胞共同培养的细胞的免疫荧光相同。结果表明,HBcAg在293T-NE-3NRs和 HepG2-NE细胞中表达,这表明四个宿主基因(NTCP、HNF4+、RXR®和PPAR®)促进HBV感染。但与 HepG2-3NR 相比,293T-NE-3NR 中的 HBCAg 信号较低,表明 HBV 感染也可能受到其他宿主因素的影响。
定量参考 | 定量参考 | 定量参考 | 定量参考 | 负控制 | HBV 阳性控制 | |
1 | 2 | 3 | 4 | |||
Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | 没有 | 12.3865 |
GEq/mL | 2*10~3 | 2*10~4 | 2*10~5 | 2*10~6 | —— | —— |
表 1:定量引用的 Ct 值。
赫普格 2.2.15 液 |
1/20 HepG 2.2.15 集中 |
赫普格 2.2.15 集中 |
|
Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
GEq/mL | 1.65*10~4 | 7.53*10~5 | 1.5*10~7 |
表2:从 HepG2.2.15 上流液获得的 HBV DNA 的 Ct 值。值表示从原始上流液、1/20 稀释或浓缩物获得的 HBV DNA 的 Ct 值。
293T-NE | 赫普格 2 - ne | 293T-NE-3NR | |||
Hbv | Hbv | HBV+CSA | Hbv | HBV+CSA | |
HBV GEq/细胞 | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
HBV +L | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
CsA μL (5 μM) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
Dmso μL | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
40 % PEG8000 μL | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
感染介质 +L | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
总计+升 | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
表3:感染复杂。使用的总量为500μL。环孢素S用作负控制。
图 1:协议的图形表示形式。HepG2.2.15要么与293T-NE-3NRs共同培养,要么使用免疫荧光显微镜观察到感染,或者将含有病毒的上流物质浓缩并引入293T-NE-3NRs培养细胞。请单击此处查看此图的较大版本。
图 2:根据 Ct 值计算的 HBV 标准曲线。请单击此处查看此图的较大版本。
图 3 : HepG2 . 2 . 15 上大用于感染 293T - NE 、 293T - NE - 3NRs 和赫普格 2 - NE 细胞,每个细胞 150GEq 。HBcAg表达通过免疫荧光测定鉴定。HBcAg在293T-NE-3NRs和 HepG2-NE细胞中表达,而用CsA(HBV进入抑制剂)和293T-NE细胞治疗的这些细胞中未观察到表达。比例线 = 100 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图4:293T-NE、293T-NE-3NR和 HepG2-NE 与 HepG2.2.15 细胞共同培养。HBcAg表达通过免疫荧光测定鉴定。HBcAg在293T-NE-3NRs和 HepG2-NE细胞中表达,而用CsA(HBV进入抑制剂)和293T-NE细胞治疗的这些细胞中未观察到表达。比例线 = 100 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里,我们介绍非肝293T-NE-3NR和基于肝瘤的HpG2-NE细胞的HBV感染方案。293T-NE-3NR 适用于高低 GEq 的 HBV 感染。在使用我们的协议时,需要考虑以下关键步骤。细胞状态是成功感染的重要因素。在HBV感染的初始阶段后,必须及时改变感染媒介。293T-NE-3NRs细胞在感染高病毒滴答声后通常很脆弱。因此,这些细胞必须轻轻清洗,以避免在感染24小时后分离细胞。在使用膜插入物进行培养时,我们必须确保初始播种密度适当,并且该腔室充分浸入介质中,以确保病毒颗粒有效地附着到 293T-NE-3NRs 细胞中。要检测HBcAg,我们必须在固定前轻轻清洗细胞,以避免误报信号。由于 293T 电池容易从底部分离,因此在清洗步骤时必须小心。
通过 HBV 感染 293T-NE-3NR 不像 NTCP 表达 HepG2 那么容易。与 HepG2 不同,这些细胞在培养过程中很容易从板底分离。这些细胞比 HepG2 更脆弱感染后使用 DMSO 和 PEG8000 或与 HepG2.2.15 共同培养 10 天不传菌。因此,我们需要将板涂覆0.1%的明胶,并播种适当的细胞号到板中。在更换介质、清洗或固定细胞时,应更加小心,防止细胞分离。
与传统的乙肝病毒感染方法相比,我们采用了293T细胞系,293T-NE-3NRs作为感染模型,并与HpG2.2.15共同培养。有趣的是,293T-NE-3NRs细胞成功地感染了HBV,即使在低GEq,更准确地模仿自然生理条件。在293T-NE-3NR中模拟HBV感染是传统细胞的有益补充,因为这些细胞具有非肝背景。该方法的应用有助于我们识别新的宿主因素,尽管该方法的感染效率不如传统方法高。我们相信,本手稿中展示的体外模型将有助于促进该领域的新发现。
这种方法的一个限制是感染效率。体外HBV感染不像体内那么简单。目前乙肝病毒的体外模型是有限的,因为他们对HBV感染的敏感性差,其中极高的接种需要启动感染,并没有明显的病毒传播10。这与体内的观察结果形成鲜明对比,在体内,单个HBV病毒可以在11周12,周内感染大部分肝细胞。因此,识别影响HBV复制的新宿主因素,有利于加深我们对HBV和宿主相互作用的理解。此外,通过模仿体内肝脏或肾脏的发展,可以产生功能器官,可以更仔细地回顾人类肝脏或肾脏的生理功能13,14。13,14这将大大增进我们对乙肝病毒感染的了解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金(第81870432号和81570567至X.L.Z.)、国际青年科学家研究基金(第81571994号至P.N.S.)的支持(第81950410640号至W.I.);李嘉诚汕头大学基金会(第1号)L1111 2008 至 P.N.S.)。我们感谢汕头大学医学院的林士丹教授提供有用的建议。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
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