Summary
Dette manuskript beskriver en detaljeret protokol for Hepatitis B-virus (HBV) infektion i nye manipuleret 293T celler (293T-NE-3NRs, der udtrykker menneskelige NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα) og traditionelle leverceller (HepG2-NE, der udtrykker menneskelige NTCP).
Abstract
HBV hovedsageligt inficerer humane hepatocytter, men det har også vist sig at inficere extrahepatic væv såsom nyre og testikler. Ikke desto mindre er cellebaserede HBV-modeller begrænset til hepatomacellelinjer (såsom HepG2 og Huh7), der overexpresserer en funktionel HBV-receptor, natrium taurocholate-co-transport af polypeptid (NTCP). Her brugte vi 293T-NE-3NRs (293T overexpressing humanE NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα) og HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) som modelcellelinjer. HBV-infektion i disse cellelinjer blev udført enten ved hjælp af koncentrerede HBV-viruspartikler fra HepG2.2.15 eller ved co-culturing HepG2.2.15 med målcellelinjerne. HBcAg immunofluorescens for HBcAg blev udført for at bekræfte HBV-infektion. De to metoder, der præsenteres her, vil hjælpe os med at studere HBV-infektion i ikke-levercellelinjer.
Introduction
Hepatitis B påvirker livet for mere end 2 milliarder mennesker og er en af de største trusler mod folkesundheden. Omkring 257 millioner mennesker er kronisk inficeret med hepatitis B-virus (HBV) på verdensplan, hvilket medfører en stor byrde for samfundet1. Hepatocytter er ikke de eneste celler inficeret med HBV og andre celler i ikke-levervæv, såsom nyre og testiker, er også inficeret med denne virus2,3. I øjeblikket, HBV infektion cellemodeller er begrænset til humane hepatocytter med kun få ikke-hepatisk celle linje modeller. Dette hæmmer studiet af HBV-infektion og HBV-relateret patologi af ikke-levervæv. Her præsenterer vi protokoller for at studere HBV-infektion i ikke-lever 293T celler samt i hepatoma-baserede celler.
Natrium taurocholate co-transport polypeptid (NTCP) er en funktionel receptor for human hepatitis B og hepatitis D virus4. Hepatocyt nuklear faktor 4α (HNF4α), retinoid X receptor α (RXRα) og peroxisome proliferator-aktiveret receptor α (PPARα) er leverberigede transskriptionsfaktorer, der begrænser viral tropisme i HBV. De er blevet verificeret for at fremme HBV pregenomic RNA syntese og støtte HBV replikation i en nonhepatoma cellelinje5. Vi konstrueret tre forskellige cellelinjer, HepG2 cellelinjer udtrykker NTCP (HepG2-NE), 293T cellelinje udtrykker NTCP (293T-NE) og 293T cellelinje udtrykke fire vært gener; NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα (293T-NE-3NRs). Der blev udviklet to metoder til HBV-infektion baseret på 293T-NE-3NRs (figur 1). Den første metode anvender vaccination i 293T-NE-3NRs med høj viral genomækvivalens (høj GEq (150), DMSO og PEG8000) i 24 timer. Den anden metode anvender co-dyrkning 293T-NE-3NRs med HepG2.2.15, som kan producere HBV partikler (lav GEq (ca. 1,83) uden DMSO og PEG8000), og dermed tæt efterligne naturlige forhold.
HepG2.2.15 celler er afledt af HepG2 linje og kronisk udskiller infektiøse HBV, samt subvirale partikler i kulturmediet6,7. Cyclosporin A (CsA) er et immunhæmmende middel, der anvendes klinisk til undertrykkelse af xenograftafstødning. Undersøgelser har vist, at CsA hæmmer HBV's indtræden i dyrkede hepatocytter ved at hæmme NTCP's transportaktivitet og blokere bindingen af NTCP til store kuvertproteiner8.
HepG2-NE-celler blev anvendt som positiv kontrol, mens CsA-behandlede celler blev anvendt som negativ kontrol. Ved at sammenligne med de positive og negative kontrolgrupper kan vi finde ud af, hvilke værtsgener der spiller en afgørende rolle i HBV-infektion. Derudover, gennem denne form for HBV infektion, kan vi også finde andre nye mekanismer eller vært gener involveret i HBV infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kultur, indsamling af supernatanter fra HepG2.2.15-celler og HBV-infektion bør udføres i laboratorium på niveau II (P2) eller biosikkerhedsniveau III (P3) i henhold til landets retningslinjer for biosikkerhed. Laboratoriesikkerhedspraksis bør følges for at sikre laboratoriepersonalets sikkerhed, og alle bør vaccineres og påvises HBsAb-positiv, før der udføres HBV-forsøg. Overhold cellernes tilstand ved hvert trin, før du fortsætter til næste trin. Human serum prøver blev anvendt i overensstemmelse med godkendelsen fra Institutional Review Board af Shantou University Medical College.
1. HepG2.2.15 cellekultur
BEMÆRK: HepG2.2.15 cellesupernatant, HepG2.2.15 cellesupernatantkoncentrat og alle spidser, kolber, plader og rør, der kommer i kontakt med HepG2.2.15, skal bortskaffes efter at være blevet dyppet i 2% virucid natten over.
- Hætteglasset, der indeholder HepG2.2.15-cellerne, fjernes fra flydende nitrogen, og tø op ved forsigtigt at hvirvle hætteglasset i et 37 °C-vandbad.
BEMÆRK: For at reducere risikoen for kontaminering skal hætten holdes ude af vandet. Optøningen skal være hurtig (ca. 2 min. ). - Fjern hætteglasset fra vandbadet, så snart cellerne er optøet og desinficere det med 70% ethanol.
BEMÆRK: Fra dette punkt udføre alle trin under strenge aseptiske betingelser. - Cellerne overføres til en 25 cm2 vævskulturkolbe og tilsættes 4 ml komplet dyrkningsmedium (DMEM indeholdende 10% FBS, penicillin 100 U/ml, streptomycin 0,1 mg/ml). Cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5% CO2.
2. Indsamling af HepG2.2.15 cellekultur supernatant
- Kultur HepG2.2.15 celle i T25 kolber ved 37 °C, 5% CO2 i en befugtet inkubator. Skift mediet hver tredje dag.
- Opsaml cellesupernatanten i et centrifugerør på 50 ml. Luk låget godt og pak det ind med en paraffinfilm.
- TappG2.2.15-supernatanten opbevares ved -20 °C for at holde HBV-virus aktiv.
3. Koncentration HepG2.2.15 supernatant
- HepG2.2.15-supernatanten fjernes fra -20 °C og optøs ved 4 °C.
- For at fjerne cellefragmenterne filtreres Overlejringsaner hepG2.2.15 med en 0,45 μm membran til et nyt centrifugerør på 50 ml. Først blokere filteret ved at filtrere 10 ml DMEM med 10% FBS før filtrering af virus, derefter filtrere cellekultur supernatant.
- Tilsæt 14 ml filtreret supernatant til en viruskoncentratorkolonne, og luk låget. Kolonnen centrifugeres ved 3.200 x g i 35 min. i en vandret centrifuge. HepG2.2.15-supernatantkoncentratet (ca. 200 μL) opsamles i et 1,5 ml rør.
- Kolonnen vaskes med DMEM én gang ved at tilsætte 200 μL DMEM og opsamles i et 1,5 ml rør.
4. Påvisning af HBV DNA i supernatantkoncentrat
- Tænd for tørblokvarmeren, og indstil temperaturen til 100 °C.
- For at sikre, at koncentrationen af HBV DNA i HepG2.2.15-supernatantkoncentratet ligger inden for standardkurveområdet, fortyndes koncentratet 20 gange ved at tilsætte 10 μL HepG2.2.15-supernatantkoncentrat til 190 μL DMEM i et 1,5 ml mikrocentrifglas. Der tilsættes 200 μL HepG2.2.15 supernatant, negativ kontrol (HBV-negativt serum fra rask donor), HBV-positiv kontrol (HBV-positivt serum fra HBV-patient) og fire fortyndinger af de kvantitative referencer i sættet (2,0 x 106,2,0 x 105,2,0 x 104,2,0 x 103 GEq /mL), henholdsvis for at adskille 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes 450 μL HBV DNA-ekstraktionsbuffer fra sættet til alle de ovennævnte otte 1,5 ml rør, vortex i 15 s og dreje ned i 10 s. Inkuber ved 100 °C i 10 min. i tørblokvarmer. Centrifuge ved 12.000 x g i 5 min. ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 27 μL PCR-masterblanding og 3 μL Taq polymeraseenzym til PCR-rørene, der er anbragt på is.
BEMÆRK: PCR-masterblandingen i sættet indeholder primerene mod det bevarede område af HBV DNA. - Der tilsættes 20 μL centrifugeret supernatantvæske til pcr-rørene, der anbringes på is. Dæk stramt og spin ned i 10 s.
- Der anvendes følgende betingelser på en PCR-maskine i realtid: 93 °C i 2 min., 10 cyklusser af 93 °C i 45 s efterfulgt af 55 °C for 60 s; derefter 30 cyklusser af 93 °C for 30 s efterfulgt af 55 °C for 45 s til at udføre real-time PCR.
BEMÆRK: Master mix leveres i den kommercielle kit har primere mod den bevarede region af HBV DNA. - Ct-værdierne eksporteres og genereres en standardkurve som vist i tabel 1 og figur 2.
- Baseret på standardkurven beregnes HBV DNA-koncentrationen af HepG2.2.15 supernatantkoncentrat fortyndet 20x som vist i tabel 2. HBV DNA-koncentrationen af HepG2.2.15-supernatantkoncentratet (tabel 2) beregnes .
- HepG2.2.15-supernatantkoncentratet opdeles i aliquoter og opbevares ved -80 °C indtil brug.
5. In vitro-infektion af HepG2-NE- og 293T-NE-3NR-celler
- Forbered følgende infektionsmedium i DMEM/F-12: 10% FBS, 4 mM glutamin supplement, 0,1 mM NEAA, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 1 μg/ml puromycin, 40 ng/ml dexamethason, 20 μg/mLcortison og 5 μg/ml insulin. Opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Disse NTCP-positive celler er puromycin-resistente9. - Tilsæt 0,1% gelatine til 5 brønde af 48 brøndplade, 200 μL til hver brønd. Pladen inkuberes ved 37 °C i 2 timer, da supernatanten kasseres. Pladen inkuberes ved 37 °C i yderligere 2 timer.
- Seed HepG2-NE ved en tæthed på 1 x 104 celler i 2 brønde hver. Frø 293T-NE-3NRs celler ved en massefylde på 1 x10 4 celler i 2 brønde hver (all-trans retinosyre ved 1 μmol/l og clofibrinsyre ved 1 mmol/l endelige koncentrationer blev tilsat til mediet for at aktivere henholdsvis RXRα og PPARα nukleare hormonreceptorer). Seed 293T-NE i 1 brønd ved en tæthed på 1 x 104 celler.
BEMÆRK: Passage cellerne ved sub-sammenløb ved hjælp af 0,25% trypsin. Tæl cellenummeret, og frø derefter cellerne til en passende tæthed. - Cellen inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i en befugtet inkubator i 24 timer. Overhold cellerne efter 24 timer og fortsæt med infektionen, hvis cellerne er sunde.
- Forbered infektionskomplekset som nævnt i tabel 3, tilsæt HBV (HepG2.2.15 supernatantkoncentrat), DMSO, PEG8000 og infektionsmediet til 1,5 ml mikrocentrifugerør. Forbered CsA-aktien ved at opløse den i DMSO til en koncentration på 5 mM og hold bestanden på -20 ºC. CsA's arbejdsløsning er 5 μM. Seed 1 × 104 celler pr brønd af 48-brønd plade. Der tilsættes 100 μL HepG2.2.15-supernatantkoncentrat (indeholdende HBV 1,5063 ×107 GEq/ml) for at inficere celler ved 150 GEq/celle.
- Der tilsættes 500 μL af infektionskomplekset til hver brønd, og cellerne inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i befugtet inkubator i 24 timer.
- Cellerne vaskes to gange med 500 μL PBS, før mediet skiftes. Tilsæt 1 ml af mediet i hver brønd. Hvis celletilstanden er dårlig, og nogle celler flyder, skal du ændre mediet direkte. Dette er dag 1 af infektion. Skift mediet forsigtigt hver anden dag.
- På dag 11 vaskes cellerne to gange med 500 μL PBS, og cellerne fastgøres med iskold methanol for immunfluorescens.
6. HepG2.2.15 co-kultur med HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE
- Tilsæt 1 ml/brønd på 0,1% gelatine til 5 brønde med 6 brøndeplade. Pladen inkuberes ved 37 °C i 2 timer, og supernatanten kasseres. Pladen inkuberes igen i yderligere 2 timer ved 37 °C for at tørre brønden helt.
- Seed 1 x 105 celler / godt af HepG-NE i 2 brønde, 293T-NE-3NRs i 2 brønde, og 293T-NE i 1 brønd af pladen. 1 x 105 celler/brønd hepG2.2.15 frøs på fem membranindsatser (24 mm, 0,4 μm porediameter, ubestrøget) i en separat 6-brøndplade. Cellerne inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i en befugtet inkubator i 24 timer.
- Efter 24 timer, hvis cellerne alle er klæbende og i god stand, forberede sig på co-kultur. Kassér mediet i 6-brøndpladen og cellemembranen skær. Membranindsatserne anbringes med HepG2.2.15 i den 6 brøndplade, der er sået med HepG-NE, 293T-NE-3NRs og 293T-NE ved pincet. Inkuber cellen ved 37 °C, 5% CO2 i en befugtet inkubator, ændre mediet hver 3-4 dage.
BEMÆRK: Angiv grupper som følger: Godt 1: 293T-NE co-kultur med HepG 2.2.15; Nå 2: HepG2-NE co-kultur med HepG 2.2.15; Nå 3: 293T-NE-3NRs co-kultur med HepG2.2.15; Nå 4: HepG2-NE co-kultur med HepG 2.2.15 (tilføj CsA); Nå 5: 293T-NE-3NRs co-kultur med HepG2.2.15 (tilføj CsA); Tilsæt hele mediet til godt nummer 1, 2 og 3, tilsæt mediet med 5 μM CsA til godt nummer 4 og 5 godt, omkring 9 ml for hver brønd, sørg for at medierne er i kontakt, for at viruspartikler kan migrere fra transwells for at inficere celler. - Efter 10 dage fjernes membranindsatserne, PBS tilsættes til 6-brøndpladen og vaskes forsigtigt to gange, cellerne fastgøres med iskold methanol for immunfluorescens.
7. Udfør immunfluorescens for HBcAg
- Cellerne med iskold methanol fastgøres ved -20 °C i mere end 3 timer. Cellerne vaskes med PBS i 10 minutter ved stuetemperatur på shaker, gentag i 3 gange.
- Der tilsættes 5% BSA (100 μL/48-brøndplade, 500 μL/6-brøndplade), ryst på vandret shaker i 1 time ved 40 rpm og stuetemperatur.
- Tilsæt HBcAg primære antistofopløsning (primær antistof: 5% BSA opløsning =1:200, 100 μL / 48-well-plade, 500 μL / 6-well-plade), ryst natten over ved 4 °C.
- Vask brønde med PBST (PBS med 0,1% tween 20), i 10 min ved stuetemperatur på shaker, gentag i 3 gange.
- Tilsæt den anden antistofopløsning (594 mærket antistof opdrættet i ged mod kanin IgG: PBS = 1:1.000, 100 μL /48-brøndplade, 500 μL / 6-brøndplade), dække pladen med folie og ryst i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask igen med PBST i tre gange, ryst i 10 min hver.
- Der tilsættes 1 μg/ml DAPI, omryst i 2 min. Vask to gange med PBST på en shaker i 5 min hver. PBST kasseres. Tilsæt PBS og observere under immunofluorescens mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi konstruerede pSIN-NTCP-EGFP plasmid, der udtrykker NTCP- og EGFP-fusion og med puromycinresistens. Plasmidet blev transficeret til HepG2- og 293T-celler for at konstruere stabile cellelinjer HepG2-NE og 293T-NE, der udtrykker NTCP og EGFP. Plasmider (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-flag) med puromycinresistens og udtryk blev transficeret til 293T-NE-celler for at konstruere en stabil cellelinje, der udtrykker 4 værtsgener9. Udtrykket ntcp-EGFP kan observeres ved grøn fluorescens, og verificeres af qPCR og western blot (data ikke vist, men se tidligere arbejde 9).
Primær antistof af HBcAg og DAPI inkuberet med faste celler viste en tydelig farvning, når det blev observeret ved hjælp af 10x mål på et fluorescerende omvendt mikroskop. Nuklear lokalisering blev bekræftet ved farvning med DAPI (Figur 3 og Figur 4-den tredje kolonne). NTCP-EGFP udtrykkes på cellemembranen og kan placeres ved den grønne fluorescens (figur 3 og figur 4-den anden kolonne). Udtryksstederne for HBcAg kan være placeret ved rød fluorescens (Figur 3 og Figur 4-den første kolonne). Når DAPI, NTCP og HBcAg er i samme celle, betyder det, at cellen er blevet inficeret med HBV (Figur 3 og Figur 4-den sidste kolonne).
CsA-gruppen var den negative kontrol. CsA forhindrede HBV i at trænge ind i celler ved at blokere NTCP. Som en positiv kontrol, inficerede HepG2-NTCP-EGFP celler kan udtrykke HBcAg. HBcAg blev påvist i 293T-NE-3NRs celler, men ikke i 293T-NE-celler, hvilket indikerer, at NTCP ikke er den eneste faktor, der er afgørende for HBV-infektion i 293T. Immunfluorescensen hos celler inficeret med HepG2.2.15 supernatantkoncentrat var den samme som for celler, der var co-kulturd med HepG2.2.15 celle. Det viste, at HBcAg blev udtrykt i 293T-NE-3NRs og HepG2-NE celler, dette tyder på, at de fire værtsgener (NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα) letter HBV-infektion. Men signaler for HBcAg i 293T-NE-3NRs var lavere i forhold til HepG2-NE, hvilket indikerer HBV infektion kan også blive påvirket af andre værtsfaktorer.
| Kvantitativ reference | Kvantitativ reference | Kvantitativ reference | Kvantitativ reference | Negativt kontrolelement | HBV positiv kontrol | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | Ingen | 12.3865 |
| GEq/ml | 2*10^3 | 2*10^4 | 2*10^5 | 2*10^6 | —— | —— |
Tabel 1: Ct-værdier for de kvantitative referencer.
| HepG 2.2.15 supernatant |
1/20 HepG 2.2.15 Koncentrere sig |
HepG 2.2.15 Koncentrere sig |
|
| Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
| GEq/ml | 1.65*10^4 | 7.53*10^5 | 1,5*10^7 |
Tabel 2: Ct-værdier for HBV DNA fra HepG2.2.15-supernatant. Værdier repræsenterer Ct-værdier for HBV DNA fra original supernatant, 1/20 fortynding eller dets koncentrat.
| 293T-NE | HepG2-NE | 293T-NE-3NRs | |||
| Hbv | Hbv | HBV+CsA delte et 28-års p-% | Hbv | HBV+CsA delte et 28-års p-% | |
| HBV GEq/celle | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| HBV μL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CsA μL (5 μM) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| DMSO μL | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
| 40 % PEG8000 μL | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Infektionsmedium μL | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
| I alt μL | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
Tabel 3: Infektionskompleks. Det samlede anvendte volumen var 500 μL. Cyclosporin A blev anvendt som en negativ kontrol.
Figur 1: En grafisk gengivelse af protokollen. HepG2.2.15 var enten co-kulturderne med 293T-NE-3NRs og infektion blev observeret ved hjælp af immunfluorescens mikroskopi eller supernatant indeholdende virale partikler var koncentreret og indført i 293T-NE-3NRs kulturperler celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: HBV-standardkurve beregnet ud fra Ct-værdierne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: HepG2.2.15 supernatantkoncentrat blev brugt til at inficere 293T-NE, 293T-NE-3NRs og HepG2-NE celler med 150 GEq pr. celle. HBcAg-ekspression blev identificeret ved immunfluorescensanalyse. HBcAg blev udtrykt i 293T-NE-3NRs og HepG2-NE celler, mens der ikke blev observeret noget udtryk i disse celler behandlet med CsA (HBV entry inhibitor) og 293T-NE celler. Vægtlinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: 293T-NE, 293T-NE-3NRs og HepG2-NE dyrkes sammen med HepG2.2.15 celler. HBcAg-ekspression blev identificeret ved immunfluorescensanalyse. HBcAg blev udtrykt i 293T-NE-3NRs og HepG2-NE celler, mens der ikke blev observeret noget udtryk i disse celler behandlet med CsA (HBV entry inhibitor) og 293T-NE celler. Vægtlinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introducerer vi protokoller for HBV-infektion i ikke-lever 293T-NE-3NRs og hepatoma-baserede HepG2-NE-celler. 293T-NE-3NR'er var egnede til HBV-infektion ved både høj og lav GEq. Følgende kritiske trin skal tages i betragtning, når du bruger vores protokol. Cellestatus er en vigtig faktor for en vellykket infektion. Infektionsmediet skal skiftes rettidigt efter den indledende periode med HBV-infektion. 293T-NE-3NRs celler er typisk skrøbelige efter infektion med høje virale titere. Derfor skal disse celler vaskes forsigtigt for at undgå at løsne cellerne efter 24 timers infektion. Når du bruger membran skær til kultur, skal vi sørge for den oprindelige såningstæthed er passende, og kammeret er tilstrækkeligt nedsænket i medier for at sikre effektiv fastgørelse af virale partikler til 293T-NE-3NRs celler. For at detektere HBcAg skal vi vaske cellerne forsigtigt før fiksering for at undgå falske positive signaler. Der skal udvises forsigtighed under vasketrin, da 293T-cellerne har tendens til at løsne sig fra bunden.
Inficere 293T-NE-3NRs af HBV er ikke så let som NTCP-udtrykke HepG2. I modsætning til HepG2 er disse celler nemme at løsne fra bunden af pladen under kulturen. Og disse celler er mere skrøbelige end HepG2 efter infektion ved hjælp af DMSO og PEG8000 eller co-kultur med HepG2.2.15 i 10 dage uden passaging. Derfor er vi nødt til at belægge pladen med 0,1% gelatine og frø passende cellenummer i pladen. Der bør udvises større forsigtighed for at forhindre, at cellerne løsner sig under udskiftning af mediet, vask eller fastgørelse af cellerne.
Sammenlignet med traditionelle HBV infektion metoder, vi vedtog en manipuleret 293T celle linje, 293T-NE-3NRs, som infektion model og co-kulturperler det med HepG2.2.15. Interessant, 293T-NE-3NRs celler blev med succes inficeret med HBV selv ved lav GEq som efterligner naturlige fysiologiske forhold mere præcist. Modellering HBV infektion i 293T-NE-3NRs er et nyttigt supplement til den traditionelle på grund af den nonhepatiske baggrund af disse celler. Anvendelse af metoden kan hjælpe os med at identificere de nye værtsfaktorer, selv om infektionseffektiviteten af denne metode ikke er så høj som den traditionelle. Vi mener, at de in vitro-modeller, der præsenteres i dette manuskript, vil bidrage til at fremme nye opdagelser på området.
En begrænsning af denne metode er infektionen effektivitet. In vitro HBV infektion er ikke så let som at in vivo. Nuværende in vitro-modeller for HBV er begrænsede på grund af deres ringe følsomhed over for HBV-infektion, hvor ekstremt høje inocula er nødvendige for at initierer infektion, og der ikke er nogen åbenlys viral spredning10. Dette står i skarp kontrast til in vivo-observationer , hvor en enkelt HBV-virion kan inficere en stor del af hepatocytterne på blot uge11,12. Således er identifikationen af nye værtsfaktorer, der påvirker HBV replikation, i høj grad gavnlig for at fremme vores forståelse af HBV og værtsinteraktioner. Ved at efterligne in vivo lever- eller nyreudviklingen kan der desuden dannes funktionelle organoider, som i højere grad sammenfatter den fysiologiske funktion af en human lever eller nyre13,14. Dette ville i høj grad øge vores forståelse af HBV-infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 81870432 og 81570567 til X.L.Z.), (nr. 81571994 til P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (nr. 81950410640 til W.I.); Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 til P.N.S.). Vi vil gerne takke prof. Stanley Lin fra Shantou University Medical College for nyttige råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
