Summary
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor hepatitis B-virus (HBV) infectie in nieuwe 293T cellen (293T-NE-3NRs, uitdrukken van menselijke NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα) en traditionele levercellen (HepG2-NE, uitdrukken van menselijke NTCP).
Abstract
HBV infecteert voornamelijk menselijke hepatocyten, maar het is ook gevonden om extrahepatische weefsels zoals nier en testis te infecteren. Niettemin zijn op cel gebaseerde HBV-modellen beperkt tot hepatoma-cellijnen (zoals HepG2 en Huh7) die een functionele HBV-receptor overdonderen, natrium taurocholaat co-transporteren polypeptide (NTCP). Hier gebruikten we 293T-NE-3NRs (293T overexpressing human NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα) en HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) als modelcellijnen. HBV-infectie in deze cellijnen werd uitgevoerd door het gebruik van geconcentreerde HBV-virusdeeltjes uit HepG2.2.15 of co-culturing HepG2.2.15 met de doelcellijnen. HBcAg immunofluorescentie voor HBcAg werd uitgevoerd om HBV-infectie te bevestigen. De twee methoden hier gepresenteerd zal ons helpen studie HBV infectie in niet-levercellijnen.
Introduction
Hepatitis B beïnvloedt het leven van meer dan 2 miljard mensen en is een van de grootste bedreigingen voor de volksgezondheid. Ongeveer 257 miljoen mensen zijn chronisch besmet met het hepatitis B-virus (HBV) wereldwijd, waardoor een grote last voor de samenleving1. Hepatocyten zijn niet de enige cellen besmet met HBV en andere cellen in niet-leverweefsel, zoals nier- en testis, zijn ook geïnfecteerd door dit virus2,3. Momenteel, HBV infectie cel modellen zijn beperkt tot menselijke hepatocyten met slechts enkele niet-levercellijn modellen. Dit belemmert de studie van HBV-infectie en HBV-gerelateerde pathologie van niet-leverweefsels. Hier presenteren we protocollen om HBV-infectie te bestuderen in niet-levermatige 293T-cellen en in op hepatoma gebaseerde cellen.
Natrium taurocholaat co-transport polypeptide (NTCP) is een functionele receptor voor human hepatitis B en hepatitis D virus4. Hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α), retinoïde X receptor α (RXRα) en peroxisome proliferator-geactiveerde receptor α (PPARα) zijn met de lever verrijkte transcriptiefactoren die het virale tropisme van HBV beperken. Ze zijn geverifieerd om hbv pregenomic RNA synthese te bevorderen en HBV-replicatie te ondersteunen in een nonhepatoma-cellijn5. We bouwden drie verschillende cellijnen, HepG2-cellijnen die NTCP (HepG2-NE) uitdrukken, 293T-cellijn die NTCP (293T-NE) en 293T-cellijn uitdrukken die vier gastheergenen uitdrukken; NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα (293T-NE-3NRs). Twee methoden voor HBV-infectie werden ontwikkeld op basis van 293T-NE-3NRs (figuur 1). De eerste methode maakt gebruik van inenting in 293T-NE-3NRs met een hoge virale genoom equivalentie (hoge GEq (150), DMSO en PEG8000) voor 24 uur. De tweede methode maakt gebruik van co-culturing 293T-NE-3NRs met HepG2.2.15, die HBV-deeltjes (lage GEq (ongeveer 1,83) zonder DMSO en PEG8000 kan produceren, waardoor de natuurlijke omstandigheden nauw kunnen worden geëmulgeerde.
HepG2.2.15 cellen zijn afgeleid van de HepG2 lijn en chronisch afscheiden besmettelijke HBV, evenals subvirale deeltjes in de cultuur medium6,7. Cyclosporin A (CsA) is een immunosuppressivum dat klinisch wordt gebruikt voor de onderdrukking van xenograftafstoting. Studies hebben aangetoond dat CsA de toegang van HBV tot gekweekte hepatocyten remt door de transportactiviteit van NTCP te remmen en de binding van NTCP aan grote envelopeiwitten te blokkeren8.
HepG2-NE cellen werden gebruikt als positieve controle, terwijl CsA behandelde cellen werden gebruikt als negatieve controle. Door te vergelijken met de positieve en negatieve controlegroepen, kunnen we erachter komen welke gastheergenen een cruciale rol spelen bij HBV-infectie. Bovendien, door middel van deze wijze van HBV-infectie, kunnen we ook andere nieuwe mechanismen of gastheer genen die betrokken zijn bij HBV-infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cultuur, verzameling van supernatants uit HepG2.2.15 cellen en HBV-infectie moeten worden uitgevoerd in bioveiligheid niveau II (P2) of bioveiligheid niveau III (P3) laboratorium volgens de bioveiligheid begeleiding in het land. Laboratoriumveiligheidspraktijken moeten worden gevolgd om de veiligheid van het laboratoriumpersoneel te waarborgen en alles moet worden gevaccineerd en HBsAb-positief worden gedetecteerd voordat hbv-experimenten worden uitgevoerd. Observeer de toestand van de cellen bij elke stap voordat u doorgaat naar de volgende stap. Menselijke serum monsters werden gebruikt in overeenstemming met de goedkeuring verkregen door de Institutional Review Board van Shantou University Medical College.
1. HepG2.2.15 celcultuur
OPMERKING: HepG2.2.15 celsupernatant, HepG2.2.15 cel supernatant concentraat en alle tips, kolven, platen en buizen die in contact komen met HepG2.2.15 moeten worden verwijderd nadat ze 's nachts in 2% virucide zijn gedrenkt.
- Verwijder de flacon met HepG2.2.15 cellen uit vloeibare stikstof en ontdooi door de flacon zachtjes te wervelen in een waterbad van 37 °C.
OPMERKING: Om de kans op besmetting te verminderen, moet u de dop uit het water houden. Ontdooien moet snel zijn (ongeveer 2 min). - Haal de flacon uit het waterbad zodra de cellen ontdooid zijn en ontsmet het met 70% ethanol.
LET OP: Voer vanaf dit punt alle stappen uit onder strikte aseptische omstandigheden. - Breng de cellen over naar een25 cm 2 weefselkweekkolf en voeg 4 mL volledig kweekmedium toe (DMEM met 10% FBS, penicilline 100 U/mL, streptomycine 0,1 mg/mL). Broed de cellen bij 37 °C in een bevochtigde couveuse met 5% CO2.
2. Verzameling van HepG2.2.15 celcultuur supernatant
- Kweek HepG2.2.15 cel in T25 kolven bij 37 °C, 5% CO2 in een bevochtigde couveuse. Verander het medium om de 3 dagen.
- Verzamel de cel supernatant in een 50 mL centrifuge buis. Sluit het deksel stevig en wikkel het met een paraffinefilm.
- Bewaar de HepG2.2.15 supernatant bij -20 °C om het HBV-virus actief te houden.
3. Concentratie HepG2.2.15 supernatant
- Verwijder HepG2.2.15 supernatant van -20 °C en ontdooi bij 4 °C.
- Om de celfragmenten te verwijderen, filtert u de HepG2.2.15 supernatant met een membraan van 0,45 μm op een nieuwe centrifugebuis van 50 mL. Eerst, blokkeer het filter door 10 mL DMEM met 10% FBS te filteren alvorens het virus te filteren, dan de celcultuur supernatant te filteren.
- Voeg 14 mL gefilterde supernatant toe aan een virusconcentraatkolom en sluit het deksel. Centrifugeren de kolom op 3.200 x g gedurende 35 minuten in een horizontale draaiende centrifuge. Verzamel het HepG2.2.15 supernatant concentraat (ongeveer 200 μL) in een buis van 1,5 mL.
- Was de kolom met DMEM één keer door 200 μL DMEM toe te voegen en verzamel deze in een buis van 1,5 mL.
4. Detectie van HBV-DNA in supernatant concentraat
- Zet de droge blokverwarming aan en stel de temperatuur in op 100 °C.
- Om ervoor te zorgen dat de concentratie HBV DNA in het HepG2.2.15 supernatant concentraat binnen het standaardcurvebereik valt, verdun het concentraat 20-voudig door 10 μL HepG2.2.15 supernatant concentraat toe te voegen aan 190 μL DMEM in een 1,5 mL microrifuge buis. Voeg 200 μL HepG2.2.15 supernatant, negatieve controle (HBV-negatief serum van gezonde donor), HBV-positieve controle (HBV-positief serum van HBV-patiënt) en vier verdunningen van de kwantitatieve referenties in de kit toe (2.2 0 x 106, 2,0 x 105,2,0 x10 4, 2,0 x 103 GEq /mL), respectievelijk om 1,5 mL microcentrifugebuizen te scheiden.
- Voeg 450 μL HBV DNA-extractiebuffer van de kit toe aan alle bovenstaande acht 1,5 mL-buizen, vortex voor 15 s en spin naar beneden voor 10 s. Incubate bij 100 °C gedurende 10 minuten in droge blokverwarming. Centrifuge op 12,000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 27 μL PCR master mix en 3 μL Taq polymerase enzym toe aan de PCR buizen die op ijs worden geplaatst.
LET OP: PCR master mix in de kit bevatten de primers tegen het geconserveerde gebied van HBV DNA. - Voeg 20 μL centrifuged supernatant vloeistof toe aan de PCR-buizen die op ijs worden geplaatst. Dek goed af en draai naar beneden voor 10 s.
- Gebruik de volgende voorwaarden op een real-time PCR-machine: 93 °C gedurende 2 min, 10 cycli van 93 °C voor 45 s, gevolgd door 55 °C voor 60 s; dan 30 cycli van 93 °C voor 30 s gevolgd door 55 °C voor 45 s om real-time PCR uit te voeren.
LET OP: De master mix in de commerciële kit heeft primers tegen de geconserveerde regio van HBV DNA. - Exporteer de verkregen Ct-waarden en genereer een standaardcurve zoals weergegeven in tabel 1 en figuur 2.
- Bereken op basis van de standaardcurve de HBV DNA-concentratie van HepG2.2.15 supernatant concentraat verdund 20x, zoals weergegeven in tabel 2. Bereken de HBV DNA-concentratie van HepG2.2.15 supernatant concentraat (Tabel 2).
- Verdeel het HepG2.2.15 supernatant concentraat in aliquots en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
5. In vitro infectie van HepG2-NE en 293T-NE-3NRs cellen
- Bereid het volgende infectiemedium voor in DMEM/F-12: 10% FBS, 4 mM glutaminesupplement, 0,1 mM NEAA, 1 mM Natriumpyruvaat, 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 1 μg/mL puromycine, 40 ng/mL dexamethasone, 20 μg/hydrocortisone en 5 μg/mL insuline. Bewaar bij 4 °C.
LET OP: Deze NTCP-positieve cellen zijn puromycine-resistente9. - Voeg 0,1% gelatine toe aan 5 putten van 48 goedplaat, 200 μL aan elke put. Broed de plaat bij 37 °C gedurende 2 uur, gooi de supernatant weg. Incubeer de plaat op 37 °C voor nog eens 2 uur.
- Seed HepG2-NE bij een dichtheid van 1 x 104 cellen in 2 putten per stuk. Zaad 293T-NE-3NRs cellen bij een dichtheid van 1 x 104 cellen in 2 putten elk (all-trans retinoïnezuur bij 1 μmol/L en clofibrinezuur bij 1 mmol/L laatste concentraties werden toegevoegd aan het medium om de RXRα en PPARα nucleaire hormoonreceptoren te activeren, respectievelijk). Zaad 293T-NE in 1 put bij een dichtheid van 1 x 104 cellen.
OPMERKING: Doorsnee de cellen bij sub-samenvloeiing met behulp van 0,25% trypsine. Tel het celnummer en zaai de cellen op een passende dichtheid. - Broed de cel in bij 37 °C, 5% CO2 in een bevochtigde couveuse gedurende 24 uur. Observeer de cellen na 24 uur en ga verder met infectie als de cellen gezond zijn.
- Bereid het infectiecomplex zoals vermeld in tabel 3,voeg HBV (HepG2.2.15 supernatant concentraat), DMSO, PEG8000 en infectiemedium tot 1,5 mL microcentrifugebuis toe. Bereid de CsA-voorraad voor door het in DMSO op te lossen tot een concentratie van 5 mM en houd de voorraad op -20 ºC. De werkoplossing van CsA is 5 μM. Zaad 1 × 104 cellen per put van de 48-well plaat. Voeg 100 μL HepG2.2.15 supernatant concentraat (met HBV 1.5063 ×107 GEq/mL) toe om cellen te infecteren bij 150 GEq/cel.
- Voeg 500 μL van het infectiecomplex toe aan elke put en broed de cellen uit bij 37 °C, 5% CO2 in bevochtigde couveuse gedurende 24 uur.
- Was de cellen twee maal met 500 μL PBS voordat u het medium wijzigt. Voeg 1 mL van het medium in elke put. Als de celtoestand slecht is en sommige cellen zweven, wijzigt u het medium rechtstreeks. Dit is dag 1 van de infectie. Verander het medium voorzichtig om de 2 dagen.
- Op dag 11 was je de cellen twee maal met 500 μL PBS en bevestig je de cellen met ijskoude methanol voor immunofluorescentie.
6. HepG2.2.15 co-cultuur met HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE
- Voeg 1 mL/put van 0,1% gelatine toe aan 5 putten van 6 goedplaat. Broed de plaat 2 uur bij 37 °C en gooi de supernatant weg. Incubeer de plaat nog eens 2 uur bij 37 °C om de put volledig te drogen.
- Zaad 1 x 105 cellen/put van HepG-NE in 2 putten, 293T-NE-3NRs in 2 putten, en 293T-NE in 1 put van de plaat. Zaad 1 x 105 cellen/put van HepG2.2.15 op vijf membraanwisselplaten (24 mm, 0,4 μm porie diameter, ongecoat) in een aparte 6 putplaat. Broed de cellen bij 37 °C, 5% CO2 in een bevochtigde couveuse gedurende 24 uur.
- Na 24 uur, als de cellen zijn allemaal aanhangend en in goede staat, voor te bereiden op co-cultuur. Gooi het medium in de 6-well-plate en celmembraan inserts. Plaats de membraan inserts met HepG2.2.15 in de 6 put plaat gezaaid met HepG-NE, 293T-NE-3NRs en 293T-NE door pincet. Incubeer de cel bij 37 °C, 5% CO2 in een bevochtigde couveuse, verander het medium om de 3-4 dagen.
OPMERKING: Stel groepen als volgt: Nou 1: 293T-NE co-cultuur met HepG 2.2.15; Nou 2: HepG2-NE co-cultuur met HepG 2.2.15; Nou 3: 293T-NE-3NRs co-cultuur met HepG2.2.15; Nou 4: HepG2-NE co-cultuur met HepG 2.2.15 (voeg CsA); Nou 5: 293T-NE-3NRs co-cultuur met HepG2.2.15 (voeg CsA); Voeg het volledige medium toe tot goed nummer 1, 2 en 3, voeg het medium met 5 μM CsA toe aan goed nummer 4 en 5 goed, ongeveer 9 mL voor elke put, zorg ervoor dat de media in contact zijn om virusdeeltjes te laten migreren van transwells naar infecteren cellen. - Na 10 dagen, verwijder de membraan inserts, voeg PBS toe aan de 6-well-plate en was zachtjes twee keer, bevestig de cellen met ijskoude methanol voor immunofluorescentie.
7. Immunofluorescentie uitvoeren voor HBcAg
- Bevestig de cellen met ijskoude methanol op -20 °C voor meer dan 3 uur. Gooi de methanol weg. Was de cellen met PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op shaker, herhaal gedurende 3 keer.
- Voeg 5% BSA (100 μL/48-well-plate, 500 μL/6-well-plate), schud op horizontale shaker voor 1 h bij 40 rpm en kamertemperatuur.
- Voeg de primaire antilichaamoplossing HBcAg toe (primair antilichaam: 5% BSA-oplossing =1:200, 100 μL / 48-wel-plaat, 500 μL / 6-well-plate), schud 's nachts bij 4 °C.
- Was putten met PBST (PBS met 0,1% tween 20), gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op shaker, herhaal gedurende 3 keer.
- Voeg de tweede antilichaamoplossing (594 gelabeld antilichaam dat bij geit tegen konijn IgG wordt opgewekt: PBS = 1:1.000, 100 μL /48-well-plate, 500 μL / 6-well-plate), dek de plaat af met folie en schud gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Was opnieuw met PBST voor drie keer, schud voor 10 min per stuk.
- Voeg 1 μg/mL DAPI toe, schud gedurende 2 min. Was twee keer met PBST op een shaker gedurende 5 minuten per stuk. Gooi PBST weg. Voeg PBS toe en observeer onder immunofluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We bouwden pSIN-NTCP-EGFP plasmid uitdrukken NTCP en EGFP fusie en met puromycine weerstand. De plasmide werd omgezet in HepG2 en 293T cellen om stabiele cellijnen HepG2-NE en 293T-NE uitdrukken NTCP en EGFP te construeren. Plasmiden (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-flag) met puromycineweerstand en expressie werden omgezet in 293T-NE cellen om een stabiele cellijn te bouwen die 4 gastheergenenuitdrukt 9. De expressie van NTCP-EGFP kan worden waargenomen door groene fluorescentie, en geverifieerd door qPCR en westelijke vlek (gegevens niet getoond, maar zie vorig werk 9).
Primaire antilichaam van HBcAg en DAPI geïncubeerd met vaste cellen toonde een duidelijke kleuring bij het observeren met behulp van 10x doelstelling op een fluorescerende omgekeerde microscoop. Nucleaire lokalisatie werd bevestigd door kleuring met DAPI(figuur 3 en figuur 4-de derde kolom). NTCP-EGFP wordt uitgedrukt op het celmembraan en kan worden gelokaliseerd door de groene fluorescentie(figuur 3 en figuur 4-de tweede kolom). De expressiesites van HBcAg kunnen worden gevonden door rode fluorescentie(figuur 3 en figuur 4-de eerste kolom). Wanneer DAPI, NTCP en HBcAg zich in dezelfde cel bevinden, betekent dit dat de cel met succes is geïnfecteerd met HBV(figuur 3 en figuur 4-de laatste kolom).
De CsA-groep was de negatieve controle. CsA voorkwam dat HBV cellen binnendringen door NTCP te blokkeren. Als een positieve controle, geïnfecteerde HepG2-NTCP-EGFP cellen kunnen uitdrukken HBcAg. HBcAg werd gedetecteerd in 293T-NE-3NRs cellen, maar niet in 293T-NE cellen, wat aangeeft NTCP is niet de enige factor essentieel voor HBV infectie in 293T. De immunofluorescentie van cellen besmet met HepG2.2.15 supernatant concentraat was hetzelfde als die van cellen co-gekweekt met HepG2.2.15 cel. Het toonde aan dat HBcAg werd uitgedrukt in 293T-NE-3NRs en HepG2-NE cellen, dit suggereert dat de vier gastheer genen (NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα) vergemakkelijkt HBV infectie. Maar signalen voor HBcAg in 293T-NE-3NRs waren lager in vergelijking met HepG2-NE, wat aangeeft HBV-infectie kan ook worden beïnvloed door andere host factoren.
| Kwantitatieve referentie | Kwantitatieve referentie | Kwantitatieve referentie | Kwantitatieve referentie | Negatieve controle | HBV positieve controle | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | Geen | 12.3865 |
| GEq/mL | 2*10^3 | 2*10^4 | 2*10^5 | 2*10^6 | —— | —— |
Tabel 1: Ct-waarden voor de kwantitatieve referenties.
| HepG 2.2.15 Supernatant |
1/20 HepG 2.2.15 Concentreren |
HepG 2.2.15 Concentreren |
|
| Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
| GEq/mL | 1,65*10^4 | 7,53*10^5 | 1,5*10^7 |
Tabel 2: Ct-waarden voor HBV-DNA verkregen uit HepG2.2.15 supernatant. Waarden vertegenwoordigen Ct-waarden voor HBV-DNA verkregen uit originele supernatant, 1/20 verdunning of het concentraat ervan.
| 293T-NE | HepG2-NE HepG2-NE | 293T-NE-3NRs | |||
| Hbv | Hbv | HBV+CsA | Hbv | HBV+CsA | |
| HBV GEq/cel | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| HBV μL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CsA μL (5 μM) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| DMSO μL | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
| 40 % PEG8000 μL | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Infectiemedium μL | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
| Totaal μL | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
Tabel 3: Infectiecomplex. Het totale gebruikte volume was 500 μL. Cyclosporine A werd gebruikt als een negatieve controle.
Figuur 1: Een grafische weergave van het protocol. HepG2.2.15 werden ofwel co-gekweekt met 293T-NE-3NRs en infectie werd waargenomen met behulp van immunofluorescentie microscopie of de supernatant met virale deeltjes werd geconcentreerd en geïntroduceerd in 293T-NE-3NRs gekweekte cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: HBV-standaardcurve berekend op basis van de Ct-waarden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: HepG2.2.15 supernatant concentraat werd gebruikt om 293T-NE, 293T-NE-3NRs en HepG2-NE cellen met 150 GEq per cel te infecteren. HBcAg expressie werd geïdentificeerd door immunofluorescentie test. HBcAg werd uitgedrukt in 293T-NE-3NRs en HepG2-NE cellen, terwijl er geen expressie werd waargenomen in deze cellen behandeld met CsA (HBV entry inhibitor) en 293T-NE cellen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: 293T-NE, 293T-NE-3NRs en HepG2-NE co-gekweekt met HepG2.2.15 cellen. HBcAg expressie werd geïdentificeerd door immunofluorescentie test. HBcAg werd uitgedrukt in 293T-NE-3NRs en HepG2-NE cellen, terwijl er geen expressie werd waargenomen in deze cellen behandeld met CsA (HBV entry inhibitor) en 293T-NE cellen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier introduceren we protocollen voor HBV-infectie in niet-leverige 293T-NE-3NRs en hepatoma-gebaseerde HepG2-NE cellen. 293T-NE-3NRs waren geschikt voor HBV-infectie bij zowel hoge als lage GEq. Bij het gebruik van ons protocol moet rekening worden gehouden met de volgende kritieke stappen. De celstatus is een belangrijke factor voor een succesvolle infectie. Het infectiemedium moet tijdig worden gewijzigd na de eerste periode van HBV-infectie. 293T-NE-3NRs cellen zijn meestal kwetsbaar na infectie met hoge virale titers. Daarom moeten deze cellen voorzichtig worden gewassen om te voorkomen dat de cellen na 24 uur infectie worden losgemaakt. Bij het gebruik van membraaninsert voor cultuur, moeten we ervoor zorgen dat de initiële zaaidichtheid geschikt is, en de kamer is voldoende ondergedompeld in media om een efficiënte bevestiging van virale deeltjes aan de 293T-NE-3NRs cellen te garanderen. Om HBcAg te detecteren, moeten we de cellen voorzichtig wassen voordat fixatie om vals-positieve signalen te voorkomen. Zorg moet worden genomen tijdens het wassen stap als de 293T cellen hebben de neiging om los te maken van de bodem.
Het infecteren van 293T-NE-3NRs door HBV is niet zo eenvoudig als NTCP-expressing HepG2. In tegenstelling tot HepG2, deze cellen zijn gemakkelijk los te maken van de onderkant van de plaat tijdens de cultuur. En deze cellen zijn kwetsbaarder dan HepG2 na infectie met dmso en PEG8000 of co-cultuur met HepG2.2.15 gedurende 10 dagen zonder te passeren. Daarom moeten we de plaat met 0,1% gelatine en zaad geschikt celnummer in de plaat coaten. Er moet meer zorg worden genomen om te voorkomen dat de cellen loskomen tijdens het veranderen van het medium, het wassen of repareren van de cellen.
Vergeleken met traditionele HBV-infectiemethoden hebben we een 293T-cellijn, 293T-NE-3NRs, als infectiemodel en co-kweekte met HepG2.2.15. Interessant is dat 293T-NE-3NRs cellen met succes werden geïnfecteerd met HBV, zelfs bij lage GEq die natuurlijke fysiologische omstandigheden nauwkeuriger nabootst. Modellering HBV infectie in 293T-NE-3NRs is een nuttige aanvulling op de traditionele als gevolg van de niet-leverische achtergrond van deze cellen. Toepassing van de methode kan ons helpen om de nieuwe host factoren te identificeren, hoewel de infectie-efficiëntie van deze methode is niet zo hoog als de traditionele. Wij geloven dat de in vitro modellen gepresenteerd in dit manuscript zal helpen vergemakkelijken nieuwe ontdekkingen in het veld.
Een beperking van deze methode is de infectie-efficiëntie. De in vitro HBV-infectie is niet zo eenvoudig als die in vivo. Huidige in vitro modellen voor HBV zijn beperkt vanwege hun slechte gevoeligheid voor HBV-infectie, waar extreem hoge inocula nodig zijn om infectie te starten en er is geen duidelijke virale verspreiding10. Dit staat in schril contrast met in vivo waarnemingen waarbij één HBV virion een groot deel van de hepatocyten in slechts enkele weken11,12kan infecteren . Zo is de identificatie van nieuwe hostfactoren die HBV-replicatie beïnvloeden, zeer gunstig voor het bevorderen van ons begrip van HBV en hostinteracties. Bovendien kunnen functionele organoïden worden gegenereerd door de in vivo lever- of nierontwikkeling na te bootsen die de fysiologische werking van een menselijke lever of nier13,14beter zouden samenvatten. Dit zou sterk verbeteren ons begrip van HBV infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81870432 en 81570567 tot X.L.Z.), (nr. 81571994 tot P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (nr. 81950410640 tot W.I.); De Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 aan P.N.S.). Wij willen prof. Stanley Lin van het Shantou University Medical College bedanken voor nuttig advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
