Summary
Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour l’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) dans de nouvelles cellules 293T (293T-NE-3NR, exprimant des NTCP humains, HNF4α, RXRα et PPARα) et des cellules hépatiques traditionnelles (PleG2-NE, exprimant le NTCP humain).
Abstract
Le VHB infecte principalement les hépatocytes humains, mais il a également été trouvé pour infecter les tissus extrahépatiques tels que les reins et les testicules. Néanmoins, les modèles de VHB à base de cellules sont limités aux lignées cellulaires d’hépatome (comme HepG2 et Huh7) surexprimant un récepteur fonctionnel du VHB, le polypeptide co-transport du taurocholate de sodium (NTCP). Ici, nous avons utilisé 293T-NE-3NRs (293T surexprimant NTCP humain, HNF4α, RXRα et PPARα) et HepG2-NE (HepG2 surexprimant NTCP) comme lignées cellulaires de modèle. L’infection par le VHB dans ces lignées cellulaires a été effectuée soit en utilisant des particules concentrées du virus du VHB provenant d’HepG2.2.15, soit en co-organisant des hepG2.2.15 avec les lignées cellulaires cibles. L’immunofluorescence de HBcAg pour HBcAg a été exécutée pour confirmer l’infection de VHB. Les deux méthodes présentées ici nous aideront à étudier l’infection par le VHB dans les lignées cellulaires non hépatiques.
Introduction
L’hépatite B affecte la vie de plus de 2 milliards de personnes et constitue l’une des principales menaces pour la santé publique. Environ 257 millions de personnes sont infectées de façon chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) dans le monde, ce qui représente un lourd fardeau pour la société1. Les hépatocytes ne sont pas les seules cellules infectées par le VHB et d’autres cellules dans les tissus non hépatiques, comme les reins et les testicules, sont également infectées par ce virus2,3. À l’heure actuelle, les modèles de cellules d’infection par le VHB sont limités aux hépatocytes humains avec seulement peu de modèles de lignée cellulaire non hépatique. Cela entrave l’étude de l’infection par le VHB et de la pathologie liée au VHB des tissus non hépatiques. Ici, nous présentons des protocoles pour étudier l’infection par le VHB dans les cellules non hépatiques 293T ainsi que dans les cellules à base d’hépatome.
Le polypeptide de co-transport du taurocholate de sodium (NTCP) est un récepteur fonctionnel de l’hépatite B humaine et du virus de l’hépatite D4. Le facteur nucléaire hépatocyte 4α (HNF4α), le récepteur X rétinoïde α (RXRα) et le récepteur α (PPARα) activé par proliférateur peroxisome sont des facteurs de transcription enrichis en foie qui limitent le tropisme viral du VHB. Ils ont été vérifiés pour promouvoir la synthèse prégénomique de l’ARN du VHB et soutenir la réplication du VHB dans une ligne de cellules non hépatomes5. Nous avons construit trois lignées cellulaires différentes, des lignées cellulaires HepG2 exprimant NTCP (HepG2-NE), une lignée cellulaire 293T exprimant NTCP (293T-NE) et une lignée cellulaire 293T exprimant quatre gènes hôtes; NTCP, HNF4α, RXRα et PPARα (293T-NE-3NR). Deux méthodes d’infection par le VHB ont été développées sur la base de 293T-NE-3NR (figure 1). La première méthode utilise l’inoculation dans 293T-NE-3NR avec une équivalence élevée du génome viral (GEq élevé (150), DMSO et PEG8000) pendant 24 h. La deuxième méthode utilise la co-culture 293T-NE-3NRs avec HepG2.2.15, qui peut produire des particules de VHB (faible GEq (environ 1,83) sans DMSO et PEG8000), imitant ainsi étroitement les conditions naturelles.
Les cellules hepG2.2.15 sont dérivées de la lignée HepG2 et sécrètent chroniquement le VHB infectieux, ainsi que les particules subvirales dans le milieu de culture6,7. La cyclosporine A (CsA) est un immunosuppresseur cliniquement utilisé pour la suppression du rejet de xénogreffe. Des études ont montré que le CsA inhibe l’entrée du VHB dans les hépatocytes cultivés en inhibant l’activité du transporteur du NTCP et en bloquant la liaison du NTCP aux protéines de grande enveloppe8.
Les cellules d’hepG2-NE ont été employées comme commande positive tandis que les cellules traitées de CsA ont été employées comme contrôle négatif. En comparant avec les groupes témoins positifs et négatifs, nous pouvons savoir quels gènes hôtes jouent un rôle critique dans l’infection par le VHB. En outre, grâce à ce mode d’infection par le VHB, nous pouvons également trouver d’autres mécanismes nouveaux ou des gènes hôtes impliqués dans l’infection par le VHB.
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Protocol
La culture, la collecte de supernatants provenant des cellules HepG2.2.15 et l’infection par le VHB doivent être effectuées en laboratoire de niveau BIOSécurité II (P2) ou de biosécurité III (P3), selon les directives de biosécurité dans le pays. Les pratiques de sécurité en laboratoire devraient être suivies pour assurer la sécurité du personnel de laboratoire, et tous devraient être vaccinés et détectés HBsAb positif avant d’effectuer des expériences VHB. Observez l’état des cellules à chaque étape avant de passer à l’étape suivante. Des échantillons de sérum humain ont été utilisés conformément à l’approbation obtenue par le Comité d’examen institutionnel du Shantou University Medical College.
1. Culture cellulaire HepG2.2.15
NOTE: HepG2.2.15 supernatant cellulaire, HepG2.2.15 concentré de supernatant de cellule et tous les bouts, flacons, plaques, et tubes qui entrent en contact avec HepG2.2.15 devrait être éliminé après avoir été trempé dans 2% virucide pendant la nuit.
- Retirer le flacon contenant des cellules HepG2.2.15 de l’azote liquide et décongeler en faisant glisser doucement le flacon dans un bain d’eau de 37 °C.
REMARQUE : Pour réduire les risques de contamination, gardez le bouchon hors de l’eau. Le dégel doit être rapide (environ 2 min). - Retirer le flacon du bain d’eau dès que les cellules sont décongelées et désinfecter avec 70 % d’éthanol.
REMARQUE : À partir de ce moment, effectuez toutes les étapes dans des conditions aseptiques strictes. - Transférer les cellules dans une fiole de culture tissulaire de25 cm 2 et ajouter 4 ml de milieu de culture complète (DMEM contenant 10 % de FBS, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 0,1 mg/mL). Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.
2. Collection de hepG2.2.15 supernatant de culture cellulaire
- Culture HepG2.2.15 cellule dans les flacons T25 à 37 °C, 5% CO2 dans un incubateur humidifié. Changer le milieu tous les 3 jours.
- Recueillir le supernatant cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Fermez fermement le couvercle et enveloppez-le d’un film de paraffine.
- Stockez le supernatant HepG2.2.15 à -20 °C pour maintenir le virus du VHB actif.
3. Concentré HepG2.2.15 supernatant
- Retirer le supernatant HepG2.2.15 de -20 °C et décongeler à 4 °C.
- Pour enlever les fragments de cellules, filtrer le supernatant HepG2.2.15 avec une membrane de 0,45 μm à un nouveau tube de centrifugeuse de 50 mL. Tout d’abord, bloquez le filtre en filtrant 10 mL de DMEM avec 10% FBS avant de filtrer le virus, puis filtrez le supernatant de culture cellulaire.
- Ajoutez 14 mL de supernatant filtré à une colonne de concentrateur de virus et fermez le couvercle. Centrifuge la colonne à 3 200 x g pendant 35 min dans une centrifugeuse à rotation horizontale. Recueillir le concentré de supernatant HepG2.2.15 (environ 200 μL) dans un tube de 1,5 mL.
- Laver la colonne avec DMEM une fois en ajoutant 200 μL de DMEM et de le recueillir dans un tube de 1,5 mL.
4. Détection de l’ADN du VHB dans le concentré de supernatant
- Allumez le chauffe-bloc sec et réglez la température à 100 °C.
- Pour s’assurer que la concentration d’ADN du VHB dans le concentré de supernatant HepG2.2.15 se situe dans la courbe standard, diluer le concentré 20 fois en ajoutant 10 μL de concentré de supernatant HepG2.2.15 à 190 μL de DMEM dans un tube microcentrifique de 1,5 mL. Ajouter 200 μL de HepG2.2.15 supernatant, contrôle négatif (sérum VHB-négatif du donneur sain), contrôle positif du VHB (sérum HBV positif du patient atteint du VHB) et quatre dilutions des références quantitatives fournies dans le kit (2.0. 0 x 106, 2,0 x 105, 2,0 x 104, 2,0 x 103 GEq /mL), respectivement pour séparer les tubes de microcentrifuge de 1,5 m L.
- Ajouter 450 μL de tampon d’extraction d’ADN du VHB du kit à tous les huit tubes de 1,5 m L ci-dessus, vortex pendant 15 s et tourner vers le bas pendant 10 s. Incuber à 100 °C pendant 10 min dans le chauffage à bloc sec. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 27 μL de mélange principal pcr et 3 μL d’enzyme de la polymérase de Taq aux tubes PCR placés sur la glace.
REMARQUE : Le mélange principal de PCR fourni dans le kit contient les amorces contre la région conservée de l’ADN de VHB. - Ajouter 20 μL de liquide supernatant centrifuge aux tubes PCR placés sur la glace. Couvrir hermétiquement et tourner vers le bas pendant 10 s.
- Utiliser les conditions suivantes sur une machine PCR en temps réel : 93 °C pendant 2 min, 10 cycles de 93 °C pour 45 s suivis de 55 °C pour 60 s; puis 30 cycles de 93 °C pour 30 s suivis de 55 °C pour 45 s pour effectuer pcr en temps réel.
REMARQUE : Le mélange principal fourni dans le kit commercial a des amorces contre la région conservée de l’ADN du VHB. - Exporter les valeurs ct obtenues et générer une courbe standard comme indiqué dans les tableaux 1 et figure 2.
- Sur la base de la courbe standard, calculer la concentration d’ADN du VHB du concentré de supernatant HepG2.2.15 dilué 20x comme indiqué au tableau 2. Calculer la concentration d’ADN du VHB du concentré de supernatant HepG2.2.15 (Tableau 2).
- Diviser le concentré de supernatant HepG2.2.15 dans les aliquots et conserver à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
5. Infection in vitro des cellules HepG2-NE et 293T-NE-3NRs
- Préparer le milieu d’infection suivant dans DMEM/F-12 : 10 % FBS, Supplément de glutamine de 4 mM, 0,1 mM NEAA, 1 mM pyruvate de sodium, 100 pénéticilline U/mL, 100 μg/mL streptomycine, 1 μg/mL puromycine, 40 ng/mL dexaméthasone, 20 μg/mL hydrocortisone et 5 μg/mL insuline. Conserver à 4 °C.
REMARQUE : Ces cellules positives NTCP sont résistantes à la puromycine9. - Ajouter 0,1 % de gélatine à 5 puits de 48 bien-plaque, 200 μL à chaque puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 2 h, jeter le supernatant. Incuber la plaque à 37 °C pendant 2 h.
- Semence HepG2-NE à une densité de 1 x 104 cellules dans 2 puits chacun. Des cellules de semences 293T-NE-3NR à une densité de 1 x 104 cellules dans 2 puits chacune (acide rétinoïque trans à 1 μmol/L et acide clofibrique à 1 mmol/L concentrations finales ont été ajoutées au milieu pour activer les récepteurs nucléaires de l’hormone RXRα et PPARα, respectivement). Graine 293T-NE dans 1 puits à une densité de 1 x 104 cellules.
REMARQUE : Passez les cellules à la sous-confluence à l’aide de la trypsie à 0,25 %. Comptez le numéro de cellule, puis ensemencer les cellules à une densité appropriée. - Incuber la cellule à 37 °C, 5% de CO2 dans un incubateur humidifié pendant 24 h. Observez les cellules après 24 h et procédez à l’infection si les cellules sont saines.
- Préparer le complexe d’infection tel que mentionné dans le tableau 3, ajouter le VHB (concentré de supernatant HepG2.2.15), le DMSO, le PEG8000 et le tube de microcentrifuge de 1,5 mL. Préparer le stock de CsA en le dissolvant en DMSO à une concentration de 5 mM et maintenir le stock à -20 ºC. La solution de travail de CsA est de 5 μM. Graine 1×104 cellules par puits de la plaque de 48 puits. Ajouter 100 μL de concentré de supernatant hepG2.2.15 (contenant le VHB 1.5063 ×107 GEq/mL) pour infecter les cellules à 150 GEq/cellule.
- Ajouter 500 μL du complexe d’infection à chaque puits et incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO2 dans un incubateur humidifié pendant 24 h.
- Laver les cellules deux fois avec 500 μL de PBS avant de changer le milieu. Ajouter 1 mL du milieu dans chaque puits. Si l’état cellulaire est pauvre et que certaines cellules flottent, changez directement le milieu. C’est le premier jour de l’infection. Changer le milieu doucement tous les 2 jours.
- Le jour 11, laver les cellules deux fois avec 500 μL de PBS et fixer les cellules avec du méthanol glacé pour l’immunofluorescence.
6. Co-culture hepG2.2.15 avec HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE
- Ajouter 1 mL/puits de gélatine de 0,1 % à 5 puits de 6 assiettes de puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 2 h et jeter le supernatant. Incuber la plaque à nouveau pendant encore 2 h à 37 °C pour sécher complètement le puits.
- Seed 1 x 105 cellules/well of HepG-NE dans 2 puits, 293T-NE-3NRs dans 2 puits, et 293T-NE dans 1 puits de la plaque. Graines 1 x 105 cellules/puits d’HepG2.2.15 sur cinq inserts membranaires (24 mm, 0,4 μm de diamètre des pores, non couchés) dans une plaque séparée de 6 puits. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO2 dans un incubateur humidifié pendant 24 h.
- Après 24 h, si les cellules sont toutes adhérentes et en bon état, préparez-vous à la co-culture. Jetez le milieu dans les inserts de membrane cellulaire et à 6 biens. Placez les inserts membranaires avec hepG2.2.15 dans la plaque de 6 puits ensemencée avec hepG-NE, 293T-NE-3NRs et 293T-NE par pince à épiler. Incuber la cellule à 37 °C, 5% de CO2 dans un incubateur humidifié, changer le milieu tous les 3-4 jours.
NOTE: Définir les groupes comme suit: Eh bien 1: 293T-NE co-culture avec HepG 2.2.15; Eh bien 2: HepG2-NE co-culture avec HepG 2.2.15; Eh bien 3: 293T-NE-3NRs co-culture avec HepG2.2.15; Eh bien 4: HepG2-NE co-culture avec HepG 2.2.15 (ajouter CsA); Eh bien 5: 293T-NE-3NRs co-culture avec HepG2.2.15 (ajouter CsA); Ajouter le milieu complet au bien numéro 1, 2 et 3, ajouter le milieu avec 5 μM CsA au bien numéro 4 et 5 bien, environ 9 mL pour chaque puits, assurez-vous que les médias sont en contact afin que les particules virales migrent des transwells pour infecter les cellules. - Après 10 jours, retirer les inserts membranaires, ajouter pbs à la plaque de 6 puits et laver doucement deux fois, fixer les cellules avec du méthanol glacé pour l’immunofluorescence.
7. Effectuer l’immunofluorescence pour HBcAg
- Fixer les cellules avec du méthanol glacé à -20 °C pendant plus de 3 h. Jeter le méthanol. Laver les cellules avec pbs pendant 10 min à température ambiante sur shaker, répéter 3 fois.
- Ajouter 5 % de BSA (100 μL/48-bien-plaque, 500 μL/6-bien-plaque), secouer sur shaker horizontal pendant 1 h à 40 tr/min et température ambiante.
- Ajouter la solution d’anticorps primaires HBcAg (anticorps primaire : 5% solution BSA =1:200, 100 μL / 48-bien-plaque, 500 μL / 6-bien-plaque), secouer pendant la nuit à 4 °C.
- Laver les puits avec pbst (PBS avec 0,1% d’interpolation 20), pendant 10 min à température ambiante sur shaker, répéter 3 fois.
- Ajouter la deuxième solution d’anticorps (594 anticorps étiquetés élevés en chèvre contre le lapin IgG: PBS = 1:1,000, 100 μL /48-bien-plaque, 500 μL / 6-bien-plaque), couvrir la plaque avec du papier d’aluminium et secouer pendant 2 h à température ambiante.
- Laver à nouveau avec PBST pendant trois fois, secouer pendant 10 min chacun.
- Ajouter 1 μg/mL DAPI, secouer pendant 2 min. Laver deux fois avec pbst sur un shaker pendant 5 min chacun. Jeter PBST. Ajouter le PBS et observer au microscope d’immunofluorescence.
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Representative Results
Nous avons construit le plasmide pSIN-NTCP-EGFP exprimant la fusion NTCP et EGFP et avec la résistance à la puromycine. Le plasmide a été transfecté en cellules HepG2 et 293T pour construire des lignées cellulaires stables HepG2-NE et 293T-NE exprimant NTCP et EGFP. Les plasmides (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-flag) avec résistance et expression de puromycine ont été transfectés en cellules 293T-NE pour construire une lignée cellulaire stable exprimant 4 gènes hôtes9. L’expression de NTCP-EGFP peut être observée par fluorescence verte, et vérifiée par qPCR et tache occidentale (données non montrées, mais voir le travail précédent 9).
L’anticorps primaire de HBcAg et de DAPI incubé avec des cellules fixes a montré une coloration distincte lorsqu’il a été observé en utilisant l’objectif 10x sur un microscope inversé fluorescent. La localisation nucléaire a été confirmée par coloration avec DAPI(figure 3 et figure 4- la troisième colonne). NTCP-EGFP est exprimé sur la membrane cellulaire et peut être localisé par la fluorescence verte(figure 3 et figure 4-la deuxième colonne). Les sites d’expression de HBcAg peuvent être localisés par fluorescence rouge(figure 3 et figure 4-la première colonne). Lorsque DAPI, NTCP et HBcAg sont dans la même cellule, cela signifie que la cellule a été infectée avec succès par le VHB(figure 3 et figure 4- la dernière colonne).
Le groupe CsA était le contrôle négatif. CsA a empêché le VHB d’entrer dans les cellules en bloquant le NTCP. En tant que contrôle positif, les cellules hepG2-NTCP-EGFP infectées peuvent exprimer HBcAg. HBcAg a été détecté dans les cellules 293T-NE-3NRs, mais pas dans les cellules 293T-NE, ce qui indique que le NTCP n’est pas le seul facteur essentiel pour l’infection par le VHB dans 293T. L’immunofluorescence des cellules infectées par le concentré de supernatant HepG2.2.15 était la même que celle des cellules co-cultivées avec la cellule hepG2.2.15. Il a montré que le HBcAg a été exprimé dans les cellules 293T-NE-3NR et HepG2-NE, ce qui suggère que les quatre gènes hôtes (NTCP, HNF4α, RXRα et PPARα) facilite l’infection par le VHB. Mais les signaux pour HBcAg dans 293T-NE-3NR étaient plus faibles par rapport à HepG2-NE, indiquant l’infection par le VHB peut également être affectée par d’autres facteurs d’hôte.
| Référence quantitative | Référence quantitative | Référence quantitative | Référence quantitative | Contrôle négatif | Contrôle positif du VHB | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | Aucun | 12.3865 |
| GEq/mL | 2*10^3 | 2*10^4 | 2*10^5 | 2*10^6 | —— | —— |
Tableau 1 : Valeurs ct pour les références quantitatives.
| HepG 2.2.15 Surnageant |
1/20 HepG 2.2.15 Concentrer |
HepG 2.2.15 Concentrer |
|
| Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
| GEq/mL | 1.65*10^4 | 7.53*10^5 | 1.5*10^7 |
Tableau 2 : Valeurs ct pour l’ADN du VHB obtenus à partir du supernatant HepG2.2.15. Les valeurs représentent les valeurs ct pour l’ADN du VHB obtenu à partir du supernatant d’origine, de la dilution 1/20 ou de son concentré.
| 293T-NE | HepG2-NE | 293T-NE-3NRs | |||
| Vhb | Vhb | VHB+CsA | Vhb | VHB+CsA | |
| HBV GEq/cellule | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| VHB μL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CsA μL (5 μM) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| DMSO μL | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
| 40 % PEG8000 μL | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Infection moyenne μL | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
| Total μL | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
Tableau 3 : Complexe d’infection. Le volume total utilisé était de 500 μL. La cyclosporine A a été utilisée comme contrôle négatif.
Figure 1 : Représentation graphique du protocole. Les hepG2.2.15 ont été co-cultivés avec 293T-NE-3NRs et l’infection a été observée à l’aide de la microscopie d’immunofluorescence ou le supernatant contenant des particules virales a été concentré et introduit dans les cellules cultivées 293T-NE-3NR. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : courbe standard du VHB calculée à partir des valeurs ct. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Le concentré de supernatants HepG2.2.15 a été utilisé pour infecter les cellules 293T-NE, 293T-NE-3NR et HepG2-NE avec 150 GEq par cellule. L’expression de HBcAg a été identifiée par essai d’immunofluorescence. HBcAg a été exprimé dans 293T-NE-3NRs et cellules HepG2-NE, tandis que, aucune expression n’a été observée dans ces cellules traitées avec CsA (inhibiteur d’entrée du VHB) et 293T-NE cellules. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : 293T-NE, 293T-NE-3NRs et HepG2-NE co-cultivé avec des cellules HepG2.2.15. L’expression de HBcAg a été identifiée par essai d’immunofluorescence. HBcAg a été exprimé dans 293T-NE-3NRs et cellules HepG2-NE, tandis que, aucune expression n’a été observée dans ces cellules traitées avec CsA (inhibiteur d’entrée du VHB) et 293T-NE cellules. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici, nous introduisons des protocoles pour l’infection par le VHB dans les cellules 293T-NE-3NR non hépatiques et les cellules hepG2-NE à base d’hépatome. 293T-NE-3NRs étaient appropriés pour l’infection de VHB à la fois haut et bas GEq. Les étapes critiques suivantes doivent être prises en considération lors de l’utilisation de notre protocole. Le statut cellulaire est un facteur important pour une infection réussie. Le milieu d’infection doit être modifié en temps opportun après la période initiale d’infection par le VHB. Les cellules 293T-NE-3NR sont généralement fragiles à la suite d’une infection par des titres viraux élevés. Par conséquent, ces cellules doivent être lavées doucement pour éviter de détacher les cellules après 24 h d’infection. Lors de l’utilisation d’inserts membranaires pour la culture, nous devons nous assurer que la densité initiale d’ensemencement est appropriée, et la chambre est suffisamment immergée dans les milieux pour assurer un attachement efficace des particules virales aux cellules 293T-NE-3NRs. Pour détecter HBcAg, nous devons laver les cellules doucement avant la fixation pour éviter les faux signaux positifs. Il faut faire attention pendant l’étape de lavage car les cellules 293T ont tendance à se détacher du fond.
Infecter 293T-NE-3NRs par le VHB n’est pas aussi facile que l’hepG2 exprimant NTCP. Contrairement à HepG2, ces cellules sont faciles à détacher du fond de la plaque pendant la culture. Et ces cellules sont plus fragiles que HepG2 après l’infection en utilisant DMSO et PEG8000 ou co-culture avec HepG2.2.15 pendant 10 jours sans passer. Par conséquent, nous devons enrober la plaque de 0,1% de gélatine et de graines nombre de cellules appropriées dans la plaque. Il faut faire plus attention à prévenir le détachement des cellules pendant le changement du milieu, le lavage ou la fixation des cellules.
Par rapport aux méthodes traditionnelles d’infection par le VHB, nous avons adopté une lignée cellulaire 293T conçue, 293T-NE-3NRs, comme modèle d’infection et l’avons co-cultivé avec HepG2.2.15. Fait intéressant, les cellules 293T-NE-3NRs ont été infectées avec succès par le VHB, même à faible GEq qui imite les conditions physiologiques naturelles avec plus de précision. La modélisation de l’infection par le VHB dans 293T-NE-3NR est un complément utile à la infection traditionnelle en raison de l’arrière-plan non hépatique de ces cellules. L’application de la méthode peut nous aider à identifier les nouveaux facteurs d’hôte, bien que l’efficacité de l’infection de cette méthode ne soit pas aussi élevée que la méthode traditionnelle. Nous croyons que les modèles in vitro présentés dans ce manuscrit aideront à faciliter de nouvelles découvertes dans le domaine.
Une limitation à cette méthode est l’efficacité de l’infection. L’infection in vitro du VHB n’est pas aussi facile que celle in vivo. Les modèles in vitro actuels pour le VHB sont limités en raison de leur faible susceptibilité à l’infection par le VHB, où des inocules extrêmement élevées sont nécessaires pour initier l’infection et il n’y a pas de propagation virale évidente10. Cela contraste fortement avec les observations in vivo où une seule virion du VHB peut infecter une grande partie des hépatocytes en quelques semainesseulement 11,12. Ainsi, l’identification de nouveaux facteurs d’hôte qui affectent la réplication du VHB est grandement bénéfique pour améliorer notre compréhension du VHB et des interactions avec l’hôte. En outre, en imitant le développement in vivo du foie ou des reins, des organoïdes fonctionnels peuvent être générés qui récapituleraient plus étroitement le fonctionnement physiologique d’un foie humain ou d’un rein13,14. Cela améliorerait grandement notre compréhension de l’infection par le VHB.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (no 81870432 et 81570567 à X.L.Z.), (no 81571994 à P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (no 81950410640 à W.I.); La Fondation de l’Université Li Ka Shing Shantou (No. L1111 2008 à P.N.S.). Nous tenons à remercier le Professeur Stanley Lin du Shantou University Medical College pour ses conseils utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
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