Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Hepatitis-B-Virus-Infektion (HBV) in neuartigen 293T-Zellen (293T-NE-3NRs, die menschliche NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und traditionelle Leberzellen (HepG2-NE, exzessizierenden menschlichen NTCP) exdrücken.
Abstract
HBV infiziert hauptsächlich menschliche Hepatozyten, aber es wurde auch gefunden, um extrahepatische Gewebe wie Niere und Hoden zu infizieren. Dennoch sind zellbasierte HBV-Modelle auf Hepatom-Zelllinien (wie HepG2 und Huh7) beschränkt, die einen funktionellen HBV-Rezeptor, Natrium-Taurochoat-Co-Transport-Polypeptid (NTCP), überausdrücken. Hier verwendeten wir 293T-NE-3NRs (293T überexpressing human NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) als Modellzellenlinien. Die HBV-Infektion in diesen Zelllinien wurde entweder unter Verwendung konzentrierter HBV-Viruspartikel aus HepG2.2.15 oder durch kokultivierende HepG2.2.15 mit den Zielzelllinien durchgeführt. HBcAg Immunfluoreszenz für HBcAg wurde durchgeführt, um HBV-Infektion zu bestätigen. Die beiden hier vorgestellten Methoden werden uns helfen, HBV-Infektionen in nicht-hepatischen Zelllinien zu untersuchen.
Introduction
Hepatitis B betrifft das Leben von mehr als 2 Milliarden Menschen und ist eine der größten Bedrohungen für die öffentliche Gesundheit. Weltweit sind rund 257 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) infiziert, was dieGesellschaftschwer belastet 1 . Hepatozyten sind nicht die einzigen Zellen, die von HBV und anderen Zellen in nicht-hepatischem Gewebe infiziert sind, wie Niere und Hoden, sind auch mit diesem Virus infiziert2,3. Derzeit sind HBV-Infektionszellmodelle auf menschliche Hepatozyten mit nur wenigen nicht-hepatischen Zelllinienmodellen beschränkt. Dies behindert die Untersuchung der HBV-Infektion und der HBV-bedingten Pathologie von nicht-hepatischen Geweben. Hier stellen wir Protokolle zur Untersuchung der HBV-Infektion in nicht-hepatischen 293T-Zellen sowie in Häpatom-basierten Zellen vor.
Natriumtaurocholat Co-Transporting Polypeptid (NTCP) ist ein funktioneller Rezeptor für menschliche Hepatitis B und Hepatitis D Virus4. Hepatozyten-Kernfaktor 4 (HNF4), Retinoid-X-Rezeptor (RXR) und Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR) sind leberangereicherte Transkriptionsfaktoren, die den viralen Tropismus von HBV einschränken. Sie wurden verifiziert, um die vorgenomische RNA-Synthese der HBV zu fördern und die HBV-Replikation in einer Nichthäpatom-Zelllinie5zu unterstützen. Wir konstruierten drei verschiedene Zelllinien, HepG2-Zelllinien, die NTCP (HepG2-NE), 293T-Zelllinie exzätsierend NTCP (293T-NE) und 293T Zelllinie, die vier Wirtsgene exizieren; NTCP, HNF4, RXR und PPAR (293T-NE-3NRs). Auf der Grundlage von 293T-NE-3NRs wurden zwei Methoden zur HBV-Infektion entwickelt (Abbildung 1). Die erste Methode verwendet die Impfung in 293T-NE-3NRs mit hoher viraler Genomäquivalenz (hohe GEq (150), DMSO und PEG8000) für 24 h. Die zweite Methode verwendet co-culturing 293T-NE-3NRs mit HepG2.2.15, die HBV-Partikel (niedrige GEq (ca. 1,83) ohne DMSO und PEG8000 produzieren können, wodurch die natürlichen Bedingungen eng nachgeahmt werden.
HepG2.2.15-Zellen werden aus der HepG2-Linie abgeleitet und seiteln chronisch infektiöse HBV sowie subvirale Partikel in das Kulturmedium6,7. Cyclosporin A (CsA) ist ein Immunsuppressivum, das klinisch zur Unterdrückung der Xenograft-Abstoßung verwendet wird. Studien haben gezeigt, dass CsA den HBV-Eintrag in kultivierte Hepatozyten hemmt, indem es die Transporteraktivität von NTCP hemmt und die Bindung von NTCP an große Hüllproteine blockiert8.
HepG2-NE-Zellen wurden als Positivkontrolle verwendet, während CsA-behandelte Zellen als Negativkontrolle verwendet wurden. Im Vergleich zu den positiven und negativen Kontrollgruppen können wir herausfinden, welche Wirtsgene bei der HBV-Infektion eine entscheidende Rolle spielen. Darüber hinaus können wir durch diese Art der HBV-Infektion auch andere neuartige Mechanismen oder Wirtsgene finden, die an einer HBV-Infektion beteiligt sind.
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Protocol
Kultur, Sammlung von Überstandstoffen aus HepG2.2.15-Zellen und HBV-Infektion sollte in Biosicherheits-Level II (P2) oder Biosicherheits-Level III (P3) Labor nach der Biosicherheits-Anleitung im Land durchgeführt werden. Die Sicherheitspraktiken im Labor sollten befolgt werden, um die Sicherheit des Laborpersonals zu gewährleisten, und alle sollten geimpft und HBsAb-positiv nachgewiesen werden, bevor HBV-Experimente durchgeführt werden. Beobachten Sie den Zustand der Zellen bei jedem Schritt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Menschliche Serumproben wurden in Übereinstimmung mit der Genehmigung verwendet, die vom Institutional Review Board des Shantou University Medical College erhalten wurde.
1. HepG2.2.15 Zellkultur
HINWEIS: HepG2.2.15 Zellüberstand, HepG2.2.15 Zellüberstandkonzentrat und alle Spitzen, Kolben, Platten und Schläuche, die in Kontakt mit HepG2.2.15 kommen, sollten entsorgt werden, nachdem sie über Nacht in 2% Viruziden eingeweicht wurden.
- Entfernen Sie die Durchstechflasche mit HepG2.2.15-Zellen aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie auf, indem Sie die Durchstechflasche in einem 37 °C-Wasserbad sanft wirbeln.
HINWEIS: Um die Möglichkeit einer Kontamination zu reduzieren, halten Sie die Kappe aus dem Wasser. Das Auftauen sollte schnell erfolgen (ca. 2 min). - Entfernen Sie die Durchstechflasche aus dem Wasserbad, sobald die Zellen aufgetaut sind, und desinfizieren Sie sie mit 70% Ethanol.
HINWEIS: Führen Sie von diesem Punkt aus alle Schritte unter strengen aseptischen Bedingungen aus. - Übertragen Sie die Zellen in einen 25 cm2 Gewebekulturkolben und fügen Sie 4 ml komplettes Kulturmedium hinzu (DMEM mit 10% FBS, Penicillin 100 U/ml, Streptomycin 0,1 mg/ml). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2.
2. Sammlung von HepG2.2.15 Zellkultur Überstand
- Kultur HepG2.2.15 Zelle in T25-Flaschen bei 37 °C, 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.
- Sammeln Sie den Zellüberstand in einem 50 ml Zentrifugenrohr. Schließen Sie den Deckel fest und wickeln Sie ihn mit einem Paraffinfilm.
- Bewahren Sie den HepG2.2.15 Überstand bei -20 °C auf, um das HBV-Virus aktiv zu halten.
3. Konzentrierender HepG2.2.15 Überstand
- HepG2.2.15 Überstand von -20 °C entfernen und bei 4 °C auftauen.
- Um die Zellfragmente zu entfernen, filtern Sie den HepG2.2.15 Überstand mit einer 0,45 m Membran auf ein neues 50 ml Zentrifugenrohr. Blockieren Sie zunächst den Filter, indem Sie 10 ml DMEM mit 10 % FBS filtern, bevor Sie den Virus filtern, und filtern Sie dann den Zellkulturüberstand.
- Fügen Sie 14 ml gefilterten Überstand zu einer Viruskonzentratorsäule hinzu und schließen Sie den Deckel. Zentrifugieren Sie die Säule bei 3.200 x g für 35 min in einer horizontal enkreizten Zentrifuge. Sammeln Sie das HepG2.2.15 Überstandkonzentrat (ca. 200 l) in ein 1,5 ml Rohr.
- Waschen Sie die Säule einmal mit DMEM, indem Sie 200 L DMEM hinzufügen und in ein 1,5 ml-Rohr einsammeln.
4. Nachweis der HBV-DNA in Überstandkonzentrat
- Schalten Sie den Trockenblockheizer ein und stellen Sie die Temperatur auf 100 °C ein.
- Um sicherzustellen, dass die Konzentration der HBV-DNA im HepG2.2.15-Überstandkonzentrat innerhalb des Standardkurvenbereichs liegt, verdünnen Sie das Konzentrat 20-fach, indem Sie 10 l HepG2.2.15 Überstandkonzentrat zu 190 l DMEM in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr hinzufügen. Fügen Sie 200 L HepG2.2.15 Überstand hinzu, Negativkontrolle (HBV-negatives Serum von gesundem Spender), HBV-Positivkontrolle (HBV-positives Serum vom HBV-Patienten) und vier Verdünnungen der im Kit enthaltenen quantitativen Referenzen (2,0 x 106, 2,0 x 105, 2,0 x 104, 2,0 x 103 GEq /ml) bzw. 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren zu trennen.
- Fügen Sie 450 l HBV DNA-Extraktionspuffer aus dem Kit zu allen oben genannten acht 1,5 ml-Röhren, Wirbel für 15 s und Spin-down für 10 s. Inkubieren bei 100 °C für 10 min in trockenen Blockheizung. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie den auf Eis platzierten PCR-Röhren 27 L PCR-Master-Mix und 3 l Taq-Polymerase-Enzym hinzu.
HINWEIS: Der im Kit enthaltene PCR-Master-Mix enthält die Primer gegen den konservierten Bereich der HBV-DNA. - Fügen Sie den auf Eis platzierten PCR-Röhren 20 L zentrifugierte übergroße Flüssigkeit hinzu. Decken Sie fest und drehen Sie nach unten für 10 s.
- Verwenden Sie die folgenden Bedingungen auf einer Echtzeit-PCR-Maschine: 93 °C für 2 min, 10 Zyklen von 93 °C für 45 s gefolgt von 55 °C für 60 s; dann 30 Zyklen von 93 °C für 30 s gefolgt von 55 °C für 45 s, um Echtzeit-PCR durchzuführen.
HINWEIS: Der Im kommerziellen Kit enthaltene Master-Mix hat Primer gegen die konservierte Region der HBV-DNA. - Exportieren Sie die erhaltenen Ct-Werte und erzeugen Sie eine Standardkurve, wie in Tabelle 1 und Abbildung 2dargestellt.
- Berechnen Sie auf Basis der Standardkurve die HBV-DNA-Konzentration von HepG2.2.15 Überstandkonzentrat verdünnt 20x, wie in Tabelle 2dargestellt. Berechnen Sie die HBV-DNA-Konzentration von HepG2.2.15 Überstandkonzentrat (Tabelle 2).
- Das HepG2.2.15 Überstandkonzentrat in Aliquots aufteilen und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
5. In-vitro-Infektion von HepG2-NE- und 293T-NE-3NRs-Zellen
- Bereiten Sie das folgende Infektionsmedium in DMEM/F-12 vor: 10% FBS, 4 mM Glutamin-Ergänzung, 0,1 mM NEAA, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin, 1 g/ml Puromycin, 40 ng/ml Dexamethason, 20 g/ml Hydrocortison und 5 g/ml Insulin. Bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Diese NTCP-positiven Zellen sind puromycinresistent9. - Fügen Sie 0,1% Gelatine zu 5 Brunnen von 48 Well-Platte, 200 l zu jedem Brunnen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h, entsorgen Sie den Überstand. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für weitere 2 h.
- Seed HepG2-NE mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen in je 2 Brunnen. Samen 293T-NE-3NRs-Zellen mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen in jeweils 2 Brunnen (Alltrans-Retinsäure bei 1 mol/L und Clofibricsäure bei 1 mmol/L Endkonzentrationen wurden dem Medium zugesetzt, um die RXR- bzw. PPAR-Kernhormonrezeptoren zu aktivieren). Samen 293T-NE in 1 Brunnen mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen.
HINWEIS: Durchfluss der Zellen bei Derkonfluss mit 0,25% Trypsin. Zählen Sie die Zellenzahl, und säen Sie die Zellen dann auf eine entsprechende Dichte. - Inkubieren Sie die Zelle bei 37 °C, 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 24 h. Beobachten Sie die Zellen nach 24 h und setzen Sie die Infektion fort, wenn die Zellen gesund sind.
- Bereiten Sie den Infektionskomplex wie in Tabelle 3erwähnt, fügen HBV (HepG2.2.15 Überstand konzentrat), DMSO, PEG8000 und Infektionsmedium bis 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr hinzu. Bereiten Sie den CsA-Bestand vor, indem Sie ihn in DMSO auf eine Konzentration von 5 mM auflösen und den Bestand bei -20 oC halten. Die Arbeitslösung von CsA beträgt 5 m. Samen 1 x 104 Zellen pro Brunnen der 48-Well-Platte. Fügen Sie 100 l HepG2.2.15 Überstandkonzentrat (mit HBV 1.5063 bei 107 GEq/ml) hinzu, um Zellen bei 150 GEq/Zelle zu infizieren.
- Fügen Sie jedem Brunnen 500 l des Infektionskomplexes hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 %CO2 im befeuchteten Inkubator für 24 h.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 l PBS, bevor Sie das Medium wechseln. Fügen Sie 1 ml des Mediums in jedem Brunnen hinzu. Wenn der Zellenzustand schlecht ist und einige Zellen schweben, ändern Sie das Medium direkt. Dies ist Tag 1 der Infektion. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage sanft.
- Waschen Sie die Zellen am 11. Tag zweimal mit 500 l PBS und fixieren Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol zur Immunfluoreszenz.
6. HepG2.2.15 Co-Kultur mit HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE
- 1 ml/Gut von 0,1% Gelatine zu 5 Brunnen von 6 Well-Platte hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h und entsorgen Sie den Überstand. Die Platte noch mal für weitere 2 h bei 37 °C bebrüten, um den Brunnen vollständig zu trocknen.
- Samen 1 x 105 Zellen/Brunnen von HepG-NE in 2 Brunnen, 293T-NE-3NRs in 2 Bohrungen und 293T-NE in 1 Bohrgut der Platte. Samen 1 x 105 Zellen/Gut von HepG2.2.15 auf fünf Membraneinsätze (24 mm, 0,4 m Porendurchmesser, unbeschichtet) in einer separaten 6-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 24 h.
- Nach 24 h, wenn die Zellen alle anhaftend und in gutem Zustand sind, bereiten Sie sich auf die Co-Kultur vor. Entsorgen Sie das Medium in den 6-Well-Platten- und Zellmembraneinsätzen. Legen Sie die Membraneinsätze mit HepG2.2.15 in die 6 Wellplatte, die mit HepG-NE, 293T-NE-3NRs und 293T-NE durch Pinzette gesät ist. Inkubieren Sie die Zelle bei 37 °C, 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator, ändern Sie das Medium alle 3-4 Tage.
HINWEIS: Stellen Sie Gruppen wie folgt ein: Nun 1: 293T-NE Co-Kultur mit HepG 2.2.15; Gut 2: HepG2-NE Co-Kultur mit HepG 2.2.15; Gut 3: 293T-NE-3NRs Co-Kultur mit HepG2.2.15; Gut 4: HepG2-NE Co-Kultur mit HepG 2.2.15 (CsA hinzufügen); Gut 5: 293T-NE-3NRs Co-Kultur mit HepG2.2.15 (CsA hinzufügen); Fügen Sie das komplette Medium zu gut Nummer 1, 2 und 3 hinzu, fügen Sie das Medium mit 5 'M CsA zu gut 4 und 5 gut hinzu, ca. 9 ml für jeden Brunnen, stellen Sie sicher, dass die Medien in Kontakt sind, damit Viruspartikel von Transwells migrieren, um Zellen zu infizieren. - Nach 10 Tagen die Membraneinsätze entfernen, PBS auf die 6-Well-Platte geben und zweimal sanft waschen, die Zellen mit eiskaltem Methanol zur Immunfluoreszenz fixieren.
7. Durchführen der Immunfluoreszenz für HBcAg
- Fixieren Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol bei -20 °C für mehr als 3 h. Entsorgen Sie das Methanol. Waschen Sie die Zellen mit PBS für 10 min bei Raumtemperatur auf Shaker, wiederholen Sie für 3 Mal.
- 5% BSA (100 l/48-Well-Platte, 500 l/6-Well-Platte) hinzufügen, auf horizontalem Shaker für 1 h bei 40 Rpm und Raumtemperatur schütteln.
- Fügen Sie die HBcAg Primärantikörperlösung (Primärantikörper: 5% BSA-Lösung =1:200, 100 l / 48-Well-Platte, 500 l / 6-Well-Platte) hinzu, über Nacht bei 4 °C schütteln.
- Waschen Sie Brunnen mit PBST (PBS mit 0,1% Tween 20), für 10 min bei Raumtemperatur auf Shaker, wiederholen Sie für 3 mal.
- Fügen Sie die zweite Antikörperlösung (594 beschrifteter Antikörper, der in Ziege gegen Kaninchen IgG aufgezogen wird: PBS = 1:1.000, 100 l /48-Well-Platte, 500 l / 6-Well-Platte), bedecken Sie die Platte mit Folie und schütteln Sie für 2 h bei Raumtemperatur.
- Dreimal mit PBST waschen, jeweils 10 min schütteln.
- Fügen Sie 1 g/ml DAPI hinzu, schütteln Sie 2 min. Zweimal mit PBST auf einem Shaker für jeweils 5 min waschen. PBST verwerfen. PBS hinzufügen und unter Immunfluoreszenzmikroskop beobachten.
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Representative Results
Wir konstruierten pSIN-NTCP-EGFP Plasmid, das NTCP und EGFP Fusion und mit Puromycin-Resistenz ausdrückt. Das Plasmid wurde in HepG2- und 293T-Zellen transfiziert, um stabile Zelllinien HepG2-NE und 293T-NE zu konstruieren, die NTCP und EGFP exzättieren. Plasmide (pSIN-HNF4, pSIN-RXR, pLV-PPAR-puro-flag) mit Puromycinresistenz und Expression wurden in 293T-NE-Zellen transfiziert, um eine stabile Zelllinie zu konstruieren, die 4 Wirtsgene9exektiert. Die Expression von NTCP-EGFP kann durch grüne Fluoreszenz beobachtet und durch qPCR und Western Blot überprüft werden (Daten nicht angezeigt, aber siehe vorherige Arbeit 9).
Primärer Antikörper von HBcAg und DAPI, die mit festen Zellen inkubiert wurden, zeigten eine deutliche Färbung, wenn sie mit einem 10-fachen Objektiv auf einem fluoreszierenden invertierten Mikroskop beobachtet wurden. Die Kernlokalisierung wurde durch Färbung mit DAPI bestätigt(Abbildung 3 und Abbildung 4- die dritte Spalte). NTCP-EGFP wird auf der Zellmembran ausgedrückt und kann durch die grüne Fluoreszenz lokalisiert werden(Abbildung 3 und Abbildung 4- die zweite Spalte). Die Expressionsstellen von HBcAg können durch rote Fluoreszenz lokalisiert werden(Abbildung 3 und Abbildung 4- die erste Spalte). Wenn sich DAPI, NTCP und HBcAg in derselben Zelle befinden, bedeutet dies, dass die Zelle erfolgreich mit HBV infiziert wurde(Abbildung 3 und Abbildung 4-die letzte Spalte).
Die CsA-Gruppe war die negative Kontrolle. CsA verhinderte, dass HBV Zellen eindrang, indem NTCP blockiert wurde. Als positivzu steuern, infizierte HepG2-NTCP-EGFP-Zellen können HBcAg exprimieren. HBcAg wurde in 293T-NE-3NRs-Zellen, aber nicht in 293T-NE-Zellen nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass NTCP nicht der einzige Faktor ist, der für eine HBV-Infektion bei 293T unerlässlich ist. Die Immunfluoreszenz von Zellen, die mit HepG2.2.15 Überstandkonzentrat infiziert waren, war die gleiche wie die von Zellen, die mit HepG2.2.15-Zellen kokultiviert wurden. Es zeigte sich, dass HBcAg in 293T-NE-3NRs und HepG2-NE-Zellen exprimiert wurde, dies deutet darauf hin, dass die vier Wirtsgene (NTCP, HNF4, RXR" und PPAR) die HBV-Infektion erleichtern. Aber die Signale für HBcAg in 293T-NE-3NRs waren niedriger als HepG2-NE, was darauf hindeutet, dass eine HBV-Infektion auch von anderen Wirtsfaktoren beeinflusst werden kann.
| Quantitative Referenz | Quantitative Referenz | Quantitative Referenz | Quantitative Referenz | Negative Kontrolle | HBV-Positivkontrolle | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | nichts | 12.3865 |
| GEq/ml | 2 *10,3 | 2 *10,4 | 2 *10,5 | 2 *10-6 | —— | —— |
Tabelle 1: Ct-Werte für die quantitativen Referenzen.
| HepG 2.2.15 Überstand |
1/20 HepG 2.2.15 Konzentrieren |
HepG 2.2.15 Konzentrieren |
|
| Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
| GEq/ml | 1,65 * 10,4 | 7,53 * 10,5 € | 1,5 * 10,7 |
Tabelle 2: Ct-Werte für HBV-DNA aus HepG2.2.15 Überstand. Die Werte stellen Ct-Werte für HBV-DNA dar, die aus dem ursprünglichen Überstand, 1/20 Verdünnung oder dessen Konzentrat gewonnen wurde.
| 293T-NE | HepG2-NE | 293T-NE-3NRs | |||
| Hbv | Hbv | HBV+CsA | Hbv | HBV+CsA | |
| HBV GEq/Zelle | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| HBV-L | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CsA -L (5 m) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| DMSO -L | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
| 40 % PEG8000 l | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Infektionsmedium L | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
| Gesamt -L | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
Tabelle 3: Infektionskomplex. Das Gesamtvolumen betrug 500 l. Cyclosporin A wurde als Negativkontrolle verwendet.
Abbildung 1: Eine grafische Darstellung des Protokolls. HepG2.2.15 wurden entweder mit 293T-NE-3NRs kokultiviert und eine Infektion wurde mittels Immunfluoreszenzmikroskopie beobachtet oder der überstande Viruspartikel wurde konzentriert und in 293T-NE-3NRs kultivierte Zellen eingeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: HBV-Standardkurve, berechnet aus den Ct-Werten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: HepG2.2.15 Überstandkonzentrat wurde verwendet, um 293T-NE, 293T-NE-3NRs und HepG2-NE-Zellen mit 150 GEq pro Zelle zu infizieren. Die HBcAg-Expression wurde durch Immunfluoreszenz-Assay identifiziert. HBcAg wurde in 293T-NE-3NRs und HepG2-NE-Zellen exprimiert, während in diesen Zellen, die mit CsA (HBV-Eintrittshemmer) und 293T-NE-Zellen behandelt wurden, keine Expression beobachtet wurde. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: 293T-NE, 293T-NE-3NRs und HepG2-NE co-kultiviert mit HepG2.2.15 Zellen. Die HBcAg-Expression wurde durch Immunfluoreszenz-Assay identifiziert. HBcAg wurde in 293T-NE-3NRs und HepG2-NE-Zellen exprimiert, während in diesen Zellen, die mit CsA (HBV-Eintrittshemmer) und 293T-NE-Zellen behandelt wurden, keine Expression beobachtet wurde. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier führen wir Protokolle für HBV-Infektionen in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs und Hepatom-basierten HepG2-NE-Zellen ein. 293T-NE-3NRs waren sowohl bei hohen als auch niedrigen GEq-Infektionen für HBV-Infektionen geeignet. Bei der Verwendung unseres Protokolls müssen die folgenden kritischen Schritte berücksichtigt werden. Der Zellstatus ist ein wichtiger Faktor für eine erfolgreiche Infektion. Das Infektionsmedium muss rechtzeitig nach der Anfangsperiode der HBV-Infektion gewechselt werden. 293T-NE-3NRs-Zellen sind nach einer Infektion mit hohen viralen Titern in der Regel zerbrechlich. Daher müssen diese Zellen sanft gewaschen werden, um zu vermeiden, dass sich die Zellen nach 24 h Infektion lösen. Bei der Verwendung von Membraneinsätzen für Kultur müssen wir sicherstellen, dass die anfängliche Saatdichte angemessen ist und die Kammer ausreichend in Medien getaucht ist, um eine effiziente Anhaftung von Viruspartikeln an die 293T-NE-3NRs-Zellen zu gewährleisten. Um HBcAg zu erkennen, müssen wir die Zellen vor der Fixierung sanft waschen, um falsch positive Signale zu vermeiden. Beim Waschen ist Vorsicht geboten, da sich die 293T-Zellen tendenziell von unten lösen.
Die Infektion von 293T-NE-3NRs durch HBV ist nicht so einfach wie NTCP-expressing HepG2. Im Gegensatz zu HepG2 sind diese Zellen während der Kultur leicht von der Unterseite der Platte zu lösen. Und diese Zellen sind zerbrechlicher als HepG2 nach einer Infektion mit DMSO und PEG8000 oder Co-Kultur mit HepG2.2.15 für 10 Tage ohne Passaging. Daher müssen wir die Platte um 0,1% Gelatine und Samen geeignete Zellnummer in die Platte zu beschichten. Es sollte mehr darauf geachtet werden, dass sich die Zellen beim Wechseln des Mediums, Waschen oder Fixieren der Zellen nicht lösen.
Im Vergleich zu herkömmlichen HBV-Infektionsmethoden haben wir eine entwickelte 293T-Zelllinie, 293T-NE-3NRs, als Infektionsmodell angenommen und mit HepG2.2.15 kokultiviert. Interessanterweise wurden 293T-NE-3NRs-Zellen auch bei niedrigem GEq erfolgreich mit HBV infiziert, was natürliche physiologische Bedingungen genauer imitiert. Die Modellierung einer HBV-Infektion in 293T-NE-3NRs ist aufgrund des nicht hepatischen Hintergrunds dieser Zellen eine nützliche Ergänzung zur traditionellen. Die Anwendung der Methode kann uns helfen, die neuartigen Wirtsfaktoren zu identifizieren, obwohl die Infektionseffizienz dieser Methode nicht so hoch ist wie die traditionelle. Wir glauben, dass die in diesem Manuskript vorgestellten In-vitro-Modelle dazu beitragen werden, neue Entdeckungen auf diesem Gebiet zu erleichtern.
Eine Einschränkung dieser Methode ist die Infektionseffizienz. Die In-vitro-HBV-Infektion ist nicht so einfach wie die in vivo. Aktuelle In-vitro-Modelle für HBV sind aufgrund ihrer geringen Anfälligkeit für HBV-Infektionen begrenzt, wo extrem hohe Inokula erforderlich sind, um eine Infektion zu initiieren, und es keine offensichtliche virale Ausbreitung10gibt. Dies steht in krassem Gegensatz zu In-vivo-Beobachtungen, bei denen ein einzelnes HBV-Virion einen großen Teil der Hepatozyten in nur wenigen Wochen infizieren kann11,12. Daher ist die Identifizierung neuartiger Wirtsfaktoren, die die HBV-Replikation beeinflussen, von großem Vorteil, um unser Verständnis von HBV- und Host-Interaktionen zu fördern. Darüber hinaus können durch nachahmung der In-vivo-Leber- oder Nierenentwicklung funktionelle Organoide erzeugt werden, die die physiologische Funktion einer menschlichen Leber oder Niere genauer rekapitulieren würden13,14. Dies würde unser Verständnis von HBV-Infektionen erheblich verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 und 81570567 bis X.L.Z.), (Nr. 81571994 bis P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (Nr. 81950410640 bis W.I.) unterstützt. Die Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 bis P.N.S.). Wir danken Prof. Stanley Lin vom Shantou University Medical College für ihre sachdienliche Beratung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
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