Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

דוגמנות דלקת כבד B וירוס ב-t-הפטיטיס 293T-NE-3NRs תאים

Published: June 5, 2020 doi: 10.3791/61414
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3,5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College, 4Medical Research Center, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, 5Department of Nucleic Acid Researches, Genetic Engineering and Biotechnology Research Institute, General Autority - City of Scientific Researches and Technological Applications
* These authors contributed equally

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור הפטיטיס B וירוס (HBV) זיהום בתאי 293T מהונדסים הרומן (293T-NE-3NRs, הבעת NTCP אנושי, HNF4α, RXRα ו PPARα) ותאי הכבד המסורתית (HepG2-NE, ביטוי האדם NTCP).

Abstract

HBV מדביק בעיקר את הפטוציטים האנושית, אבל זה גם נמצא להדביק רקמות חוץ הכבד כגון כליות ובנות. עם זאת, מודלים מבוססי תא hbv מוגבלים לקווי התאים של hepatoma (כגון HepG2 ו Huh7) על-ידי הבעת קולטן hbv תפקודית, סודיום טאורוכולאט הובלת פוליפטידים (ntcp). כאן, השתמשנו 293T-NE-3NRs (293T ביטוי יתר של האדם NTCP, HNF4α, RXRα ו PPARα) ו HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) כמו קווי תא דגם.   הידבקות HBV בקווי תאים אלה בוצעה גם באמצעות חלקיקי וירוס HBV מרוכזים מ-HepG 2.2.15 או co-culturing HepG 2.2.15 עם קווי תא היעד. בוצעה כדי לאשר. זיהום של HBV שתי השיטות המוצגות כאן תסייע לנו ללמוד זיהום HBV בקווים שאינם תאי הכבד.

Introduction

צהבת B משפיע על חייהם של יותר מ-2,000,000,000 אנשים והוא אחד האיומים העיקריים לבריאות הציבור. כ 257,000,000 אנשים נגועים באופן כרוני עם צהבת B וירוס (HBV) ברחבי העולם, גרימת נטל גדול לחברה1. Hepatocytes הם לא התאים היחידים הנגועים על ידי hbv ותאים אחרים ברקמה שאינה הכבד, כגון כליות ובנות, הם נגועים גם על ידי וירוס זה2,3. כיום, מודלים תא הזיהום HBV מוגבלים האדם hepatocytes עם רק כמה מודלים שאינם הכבד קו התא. זה הסלים המחקר של זיהום HBV ו-HBV הקשורות הפתולוגיה של רקמות לא הכבד. כאן אנו מציגים פרוטוקולים כדי ללמוד זיהום HBV בתאי 293T שאינם הכבד, כמו גם בתאים hepatoma מבוססי.

סודיום טאורוכולאט שיתוף פוליפטידים (ntcp) הוא קולטן תפקודית עבור צהבת האדם B ו הפטיטיס D וירוס4. Hepatocyte גורם גרעיני 4α (HNF4α), קולטן X retinoid α (rxrα) ו פראוקסיזום המופעל מפיצים מופעל α (pparα) הם הכבד מועשר שעתוק גורמים הגבלת tropism ויראלי של hbv. הם אומתו לקדם את הסינתזה של HBV RNA ותמיכה ב-HBV בשכפול התאיםבתוךקו שאינו תא 5. בנינו שלושה קווי תא שונים, HepG2 התאים קווי המבטא NTCP (HepG2-NE), 293T התא t המבטא NTCP (293T-NE) ו 293T התא t להביע ארבעה גנים מארחים; NTCP, HNF4α, RXRα ו PPARα (293T-NE-3NRs). שתי שיטות לזיהום HBV פותחו על בסיס 293T-NE-3NRs (איור 1). השיטה הראשונה משתמשת בחיסונים ב-293T-NE-3NRs עם שקילות הגנום ויראלי גבוהה (GEq גבוה (150), DMSO ו PEG8000) עבור 24 h. השיטה השנייה מעסיקה co-culturing 293T-NE-3NRs עם HepG 2.2.15, אשר יכול לייצר חלקיקי HBV (GEq נמוך (על 1.83) ללא DMSO ו PEG8000), ובכך היטב מחקות את התנאים הטבעיים.

התאים hepg 2.2.15 נגזרים מהקו HepG2 ובאופן כרוני מפרישות hbv זיהומיות, כמו גם חלקיקים תת ויראלי לתוך מדיום התרבות6,7. ציקלוספורין A (CsA) הוא מדכא חיסוני קליני המשמש לדיכוי דחייה של השתל. מחקרים הראו כי CsA מעכב את כניסת HBV לתוך החלציטים תרבותית על ידי עיכוב פעילות הטרנספורטר של NTCP וחסימת האיגוד של NTCP כדי חלבונים מעטפה גדולה8.

HepG2-NE תאים שימשו שליטה חיובית ואילו תאים שטופלו CsA שימשו שליטה שלילית. על ידי השוואת עם קבוצות שליטה חיוביות ושליליות, אנחנו יכולים לגלות אילו גנים מארחים לשחק תפקיד קריטי בזיהום HBV. בנוסף, באמצעות מצב זה של זיהום HBV, אנחנו יכולים גם למצוא מנגנונים חדשניים אחרים או גנים מארחים המעורבים בזיהום HBV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תרבות, אוסף של סופרנטנים מן התאים hepg 2.2.15 ו הזיהום hbv יש לבצע ברמת בטיחות II (P2) או ביולוגי רמת בטיחות III (P3) המעבדה על פי ההדרכה אבטחה טיחות בארץ. שיטות בטיחות מעבדה צריך להיות בעקבות כדי להבטיח את הבטיחות של אנשי המעבדה, וכל צריך להיות חוסנו וזיהה HBsAb חיובי לפני ביצוע ניסויים HBV. התבונן במצב התאים בכל שלב לפני שתמשיך לשלב הבא. דגימות הנסיוב האנושי שימשו בהתאם לאישור שהושג על ידי מועצת הסקירה המוסדית של המכללה הרפואית של אוניברסיטת Shantou.

1. תרבות התאים ה2.2.15 של HepG

הערה: HepG 2.2.15 cell סופרנטאנט, העמוד השני מתרכז על כל הטיפים, הצלוחיות, הצלחות והצינורות שבאו במגע עם ה2.2.15 של HepG לאחר שהוא ספוג ב -2% ולבן לילה.

  1. הסר את המבחנה המכילה תאים HepG 2.2.15 מחנקן נוזלי והפשרה על ידי מתערבל בעדינות את הבקבוקון באמבט מים ב37 ° c.
    הערה: כדי להפחית את האפשרות של זיהום, לשמור את הכובע מחוץ למים. הפשרה צריכה להיות מהירה (כ 2 דקות).
  2. להסיר את המבחנה מאמבט מים ברגע התאים הם המופשלים ולחטא אותו עם 70% אתנול.
    הערה: מנקודה זו בצע את כל השלבים תחת תנאים אספטי קפדנית.
  3. להעביר את התאים לתוך 25 ס מ2 תרבית רקמה בקבוקון ולהוסיף 4 מ ל של בינונית תרבות שלמה (dmem המכיל 10% fbs, פניצילין 100 U/ml, סטרפטומיצין 0.1 Mg/ml). דגירה את התאים ב 37 ° c בתוך מחולל לחות עם 5% CO2.

2. אוסף של תרבות התאים ה2.2.15.

  1. 2.2.15 התרבות HepG התאים ב T25 מבחנות ב 37 ° c, 5% CO2 בתוך החממה מחולל לחות. . להחליף את המדיום כל 3 ימים
  2. לאסוף את התאים הסופר בשפופרת צנטריפוגה 50 mL. סגרו את המכסה בחוזקה ועטפו אותו בסרט פרפין.
  3. אחסן את HepG 2.2.15 supernatant ב-20 ° צ' כדי לשמור על וירוס HBV פעיל.

3. ריכוז HepG 2.2.15 סופרנט

  1. הסירו את HepG 2.2.15 על-ידי-20 ° c והפשרת ב -4 ° c.
  2. כדי להסיר את שברי התא, לסנן את hepg 2.2.15 supernatant עם קרום מ0.45 יקרומטר לשפופרת צנטריפוגה חדשה 50 mL. תחילה, חסום את המסנן על-ידי סינון 10 מ ל של DMEM עם 10% FBS לפני סינון הווירוס, לאחר מכן לסנן את התרבות התא supernatant.
  3. הוסף 14 מ ל של סופרנטאנט מסונן לעמודת מרכז וירוס וסגור את המכסה. צנטריפוגה את העמודה ב 3,200 x g עבור 35 דקות בצנטריפוגה מסתובב אופקי. אסוף את הריכוז HepG 2.2.15 סופר (כ 200 μL) לתוך צינור 1.5 mL.
  4. שטוף את העמודה עם DMEM פעם אחת על-ידי הוספת 200 μL של DMEM ולאסוף אותו לתוך שפופרת 1.5 mL.

4. זיהוי של ה-DNA HBV בתרכיז הסופרנטאנט

  1. הפעל את מחמם הבלוק היבש והגדר את הטמפרטורה עד 100 ° c.
  2. כדי להבטיח את הריכוז של ה-DNA HBV בריכוז HepG 2.2.15 supernatant הוא בתוך טווח עקום סטנדרטי, לדלל את הריכוז 20-קיפול על-ידי הוספת 10 μL של HepG 2.2.15 supernatant להתרכז 190 μL של DMEM בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. הוסף 200 μL של HepG 2.2.15 סופרנט, שליטה שלילית (סרום HBV-שלילי מתורם בריא), HBV בקרה חיובית (סרום HBV-חיובית מחולה HBV) וארבע מדלל ההפניות הכמותיות המסופקות בערכה (2.0 x 106, 2.0 x 105, 2.0 x 104, 2.0 x 103 geq/ml), בהתאמה כדי להפריד בין הצינורות 1.5
  3. הוסף 450 μL של מאגר חילוץ ה-DNA HBV מתוך הקיט אל כל שמונה 1.5 מ"ל צינורות, מערבולת עבור 15 s ו ספין למטה עבור 10 ס מ. מארג ב 100 ° c עבור 10 דקות בתנור בלוק יבש. צנטריפוגה על 12, 000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הוסף 27 μL של מיקס מאסטר של PCR ו 3 μL של האנזים של Taq פולימראז לצינורות ה-PCR הממוקמים על הקרח.
    הערה: המיקס הראשי של ה-PCR המסופק בערכה כולל את התחל נגד האזור הניתן לשילוב של DNA HBV.
  5. הוסף 20 μL של נוזל centrifuged סופראנט לצינורות ה-PCR הממוקמים על הקרח. מכסים היטב ומסתובבים. במשך 10 ס מ
  6. השתמש בתנאים הבאים על מכונת PCR בזמן אמת: 93 ° צ' עבור 2 דקות, 10 מחזורים של 93 ° צ' עבור 45 s ואחריו 55 ° צ' עבור 60 s; אז 30 מחזורים של 93 ° c עבור 30 s ואחריו 55 ° צ' עבור 45 s לבצע PCR בזמן אמת.
    הערה: התמהיל הראשי המסופק בערכה המסחרית כולל התחל נגד האזור הכולל של ה-DNA HBV.
  7. יצא את ערכי ה-Ct שהתקבלו וצור עקומה סטנדרטית כפי שמוצג בטבלה 1 ובאיור 2.
  8. בהתבסס על עקומת סטנדרטי, לחשב את הריכוז ה-DNA HBV של HepG 2.2.15 supernatant להתרכז מדולל 20x כפי שמוצג בטבלה 2. לחשב את הריכוז ה-DNA HBV של ה2.2.15.Table 2
  9. מחלקים את מרכז HepG 2.2.15-סופרנט באליבטים ולאחסן ב-80 ° c עד השימוש.

5. בזיהום חוץ גופית של HepG2-NE ו 293T-NE-3NRs תאים

  1. הכן את אמצעי ההדבקה הבאים ב-DMEM/F-12:10% FBS, 4 מילימטר גלוטמין תוסף, 0.1 mM NEAA, 1 מ"מ נתרן פירובט, 100 U/mL פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין, 1 μg/ml puromycin, 40 ng/mL דקאמת1, 20 μg/mL הידרוקורטיזון ו 5 μg/ml אינסולין. חנות ב -4 ° c.
    הערה: תאים חיוביים אלה של NTCP הם puromycin עמידים9.
  2. הוסף 0.1% ג'לטין ל 5 בארות של 48 היטב הצלחת, 200 μL לכל טוב. מודלת את הצלחת ב 37 ° c עבור 2 h, למחוק את הסופרנטאנט. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור עוד 2 h.
  3. Seed HepG2-NE בצפיפות של 1 x 104 תאים ב 2 בארות כל אחד. הזרע 293T-NE-3NRs תאים בצפיפות של 1 x 104 תאים ב 2 בארות כל (חומצה retinoic כל טרנס ב 1 μml/ליטר חומצה בתוך 1 ממול/l ריכוזי הסופי נוספו בינונית כדי להפעיל את rxrmpα וקולטנים גרעיניים הורמון גרעיני, בהתאמה). 293T זרע t-NE ב 1 גם בצפיפות של 1 x 104 תאים.
    הערה: מעבר התאים במפגש המשנה באמצעות 0.25% טריפסין. ספור את מספר התאים ולאחר מכן הזרע את התאים לצפיפות מתאימה.
  4. ממשיך את התא ב 37 ° c, 5% CO2 בתוך מחולל לחות עבור 24 שעות. שימו לב לתאים לאחר 24 שעות ולהמשיך עם זיהום אם התאים הם בריאים.
  5. הכינו את מתחם הזיהום כפי שהוזכר בטבלה 3, להוסיף Hbv (hepg 2.2.15 סופר להתרכז), DMSO, PEG8000 וזיהום בינונית כדי 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה. הכינו מלאי CsA על ידי המסת אותו ב DMSO לריכוז של 5 מ"מ ולשמור את המניה ב-20 º C. פתרון העבודה של CsA הוא 5 μM. זרעים 1 × 104 תאים לכל טוב של 48-ובכן צלחת. הוסף 100 μL של התמקד HepG 2.2.15 סופר (המכיל HBV 1.5063 × 107 Geq/mL) כדי להדביק תאים ב 150 geq/cell.
  6. הוסף 500 μL של מורכבות הזיהום לכל טוב ומארג את התאים ב 37 ° c, 5% CO2 בחממה לחות עבור 24 h.
  7. שטוף את התאים פעמיים עם 500 μL של PBS לפני שינוי המדיום. הוסף 1 מ ל של המדיום בכל באר. אם מצב התא עני ותאים מסוימים צפים, שנה את המדיום ישירות. . זה היום הראשון של זיהום לשנות את המדיום בעדינות כל יומיים.
  8. ביום 11, לשטוף את התאים פעמיים עם 500 μL של PBS ולתקן את התאים עם קרח קר מתנול עבור immunofluorescence.

6. HepG 2.2.15 שיתוף תרבות עם HepG2-NE/293T-NE-3NRs/293T-NE

  1. הוסף 1 מ ל/טוב של 0.1% ג'לטין ל 5 בארות של 6 היטב צלחת. מודלת את הצלחת ב 37 ° c עבור 2 h ולמחוק את הסופרנטאנט. מודקת את הצלחת שוב 2 h ב 37 ° צ' כדי לייבש לחלוטין את הבאר.
  2. זרע 1 x 105 תאים/טוב של HEPG-ne לתוך 2 בארות, 293T-Ne-3NRs לתוך 2 בארות, ו 293t-ne לתוך 1 טוב של צלחת. זרע 1 x 105 תאים/גם של hepg 2.2.15 על חמש מוסיף ממברנה (24 מ"מ, 0.4 יקרומטר בקוטר הנקבוביות, uncoated צופה) בצלחת נפרדת 6 היטב. מודטה את התאים ב 37 ° c, 5% CO2 בחממה לחות לאחר 24 שעות.
  3. לאחר 24 שעות, אם התאים הם חסיד ובמצב טוב, להתכונן לשיתוף התרבות. להיפטר המדיום בתוך 6-היטב-צלחת ומוסיף קרום התא. מניחים את הקרום מוסיף עם HepG 2.2.15 לתוך 6 צלחת היטב הנזרע עם HepG-NE, 293T-NE-3NRs ו 293T-NE על ידי מלקחיים. מודטה את התא ב 37 ° צ', 5% CO2 בתוך החממה לחות, לשנות את המדיום כל 3-4 ימים.
    הערה: הגדר קבוצות כדלקמן: ובכן 1:293T-NE שיתוף תרבות עם HepG 2.2.15; ובכן 2: HepG2-NE שיתוף תרבות עם HepG 2.2.15; טוב 3:293T-NE-3NRs שיתוף תרבות עם HepG 2.2.15; ובכן 4: HepG2-NE שיתוף תרבות עם HepG 2.2.15 (להוסיף CsA); טוב 5:293T-NE-3NRs שיתוף תרבות עם HepG 2.2.15 (להוסיף CsA); להוסיף את המדיום השלם למספר טוב מספר 1, 2 ו-3, להוסיף את המדיום עם 5 μM CsA גם מספר 4 ו 5 טוב, על 9 מ ל עבור כל טוב, לוודא את התקשורת הם בקשר כדי חלקיקי וירוס להגר מ transwells להדביק תאים.
  4. לאחר 10 ימים, להסיר את מוסיף קרום, להוסיף PBS ל 6-היטב-צלחת ולשטוף בעדינות פעמיים, לתקן את התאים עם קרח קר מתנול עבור immunofluorescence.

7. לבצע מאימונולואוורבורנציה עבור HBcAg קאג

  1. תקן את התאים עם קרח קר מתנול ב-20 ° c עבור יותר מ 3 h. למחוק את המתנול. לשטוף את התאים עם PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר, חוזר על 3 פעמים.
  2. להוסיף 5% BSA (100 μL/48-טוב-צלחת, 500 μL/6-היטב-צלחת), ללחוץ על שייקר אופקי עבור 1 h ב 40 rpm וטמפרטורת החדר.
  3. להוסיף את הפתרון העיקרי של הנוגדן HBcAg קאג (נוגדן ראשוני: 5% BSA פתרון = 1:200, 100 μL/48-ובכן-צלחת, 500 μL/6-היטב-צלחת), לנער לילה ב 4 ° c.
  4. לשטוף את הבארות עם PBST (PBS עם 0.1% רצף 20), עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר, חוזר על 3 פעמים.
  5. להוסיף את פתרון הנוגדן השני (594 התווית נוגדן מוגבה עז נגד הארנב IgG: PBS = 1:1000, 100 μL/48-טוב-צלחת, 500 μL/6-היטב-צלחת), לכסות את הצלחת עם רדיד כסף ולנער עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
  6. לשטוף שוב עם PBST עבור שלוש פעמים, לנער עבור 10 דקות כל אחד.
  7. הוסף 1 μg/mL DAPI, לנער עבור 2 דקות. לשטוף פעמיים עם PBST על שייקר עבור 5 דקות כל אחד. התעלם מPBST. הוסף את הערוץ הPBS והתבונן. תחת מיקרוסקופ אימונולוורנציה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בנינו pSIN-NTCP-EGFP ביטוי במבטא NTCP ו EGFP היתוך עם puromycin התנגדות. הפלבאמצע היה מנוכר לתוך HepG2 ו 293T תאים לבניית קווי תאים יציבים HepG2-NE 293T-NE ביטוי NTCP ו EGFP. פלמידים (pSIN-HNF4α, pSIN-Rxra, pLV-PPARα-puro-דגל) עם puromycin התנגדות וביטוי היו מזוהמים לתוך 293T-NE תאים לבניית קו תא יציב המבטא 4 גנים מארחים9. הביטוי של NTCP-EGFP יכול להיות נצפה על ידי זריחה ירוקה, ואומת על ידי qPCR ואבן חשופה מערבית (נתונים לא מוצגים, אבל לראות את העבודה הקודמת 9).

הנוגדן העיקרי של HBcAg קאג ו DAPI מודבטים עם תאים קבועים הראה מכתים ברורים כאשר נצפתה באמצעות מטרה 10x על מיקרוסקופ הפוך פלורסנט. לוקליזציה גרעינית אושרה על ידי הצביעת עם DAPI (איור 3 ואיור 4-העמודה השלישית). NTCP-EGFP מתבטא על קרום התא והוא יכול להיות ממוקם על ידי הזריחה הירוקה (איור 3 ואיור 4-העמודה השנייה). אתרי הביטוי של HBcAg קאג יכולים להיות ממוקמים על ידי פלואורסצנטית אדום (איור 3 ואיור 4-העמודה הראשונה). כאשר DAPI, NTCP ו-HBcAg קאג נמצאים באותו תא, זה אומר כי התא הושפע בהצלחה עם HBV (איור 3 ואיור 4-העמודה האחרונה).

קבוצת CsA היתה השליטה השלילית. CsA מנע HBV להזין תאים על-ידי חסימת NTCP. כפקד חיובי, הנגועים HepG2-NTCP-EGFP תאים יכול לבטא HBcAg קאג. HBcAg קאג זוהה בתאים 293T-NE-3NRs אבל לא 293T-NE תאים, המציין NTCP הוא לא הגורם היחיד חיוני עבור זיהום HBV ב 293T. החיסונית של התאים נגועים הריכוז HepG 2.2.15 supernatant היה זהה לזה של תאים שיתוף התרבותי עם תא HepG 2.2.15. הוא הראה כי HBcAg קאג התבטא ב-293T-NE-3NRs ו HepG2-NE תאים, זה מרמז כי ארבעת הגנים המארחים (NTCP, HNF4α, RXRα ו PPARα) מסייע הזיהום HBV. אבל אותות עבור HBcAg קאג ב 293T-NE-3NRs היו נמוכים יותר לעומת HepG2-NE, המציין זיהום HBV יכול להיות מושפע גם על ידי גורמים מארחים אחרים.

אסמכתא כמותית אסמכתא כמותית אסמכתא כמותית אסמכתא כמותית שליטה שלילית שליטה חיובית של HBV
1 2 3 4
Ct 20.1527 17.6647 14.5816 12.0409 לא 12.3865
GEq/mL 2 * 10 ^ 3 2 * 10 ^ 4 2 * 10 ^ 5 2 * 10 ^ 6 —— ——

טבלה 1: ערכי Ct עבור ההפניות הכמותיות.

2.2.15 ההדפ
מיכל סופר		 1/20 HepG 2.2.15
התרכז		 2.2.15 ההדפ
התרכז
Ct 17.716 13.1556 ——
GEq/mL 1.65 * 10 ^ 4 7.53 * 10 ^ 5 1.5 * 10 ^ 7

שולחן 2: ערכי Ct עבור ה-DNA HBV המתקבל מהpg 2.2.15-סופרנט. ערכים מייצגים ערכי Ct עבור ה-DNA HBV שהתקבלו מן supernatant המקורי, 1/20 דילול או הריכוז שלה.

293T-NE HepG2-NE 293T-NE-3NRs
HBV HBV HBV + CsA HBV HBV + CsA
הגברה/תא 150 150 150 150 150
HBV μL 100 100 100 100 100
CsA μL (5 μM) 0 0 0.5 0 0.5
מיכל ביטר 10 10 9.5 10 9.5
40% PEG8000 μL 50 50 50 50 50
זיהום בינוני μL 340 340 340 340 340
סה כ μL 500 500 500 500 500

שולחן 3: מורכבות זיהום. הנפח הכולל שהיה בשימוש היה 500 μL. ציקלוספורן א שימש כשליטה שלילית.

Figure 1
איור 1: ייצוג גרפי של הפרוטוקול. HepG 2.2.15 היו או שיתוף תרבותי עם 293T-NE-3NRs וזיהום נצפתה באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence או supernatant המכיל חלקיקים ויראלי היה מרוכז והציג לתוך 293T-NE-3NRs מתורבת תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עקום סטנדרטי HBV מחושב מתוך ערכי ה-Ct. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הריכוז HepG 2.2.15 סופר שימש להדביק 293T-ne, 293T-ne-3NRs ו HepG2-ne תאים עם 150 GEq לכל תא. ביטוי הקאג זוהה על ידי. שיטת החיסונית של האימונולוורנציה HBcAg קאג התבטא ב-293T-NE-3NRs ו HepG2-NE תאים, ואילו, ביטוי לא נצפתה בתאים אלה מטופלים עם CsA (המעכב כניסה HBV) ו 293T-NE תאים. סרגל בקנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4:293T-ne, 293T-ne-3NRs ו HepG2-NE שיתוף תרבותי עם HepG 2.2.15 תאים. ביטוי הקאג זוהה על ידי. שיטת החיסונית של האימונולוורנציה HBcAg קאג התבטא ב-293T-NE-3NRs ו HepG2-NE תאים, ואילו, ביטוי לא נצפתה בתאים אלה מטופלים עם CsA (המעכב כניסה HBV) ו 293T-NE תאים. סרגל בקנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור זיהום HBV בתוך 293T-NE-3NRs-מבוססי hepatoma תאים HepG2-NE. 293T-NE-3NRs היו מתאימים לזיהום HBV בשני גבוה ונמוך GEq. יש לקחת בחשבון את הצעדים הקריטיים הבאים תוך שימוש בפרוטוקול שלנו. מצב התא הוא גורם חשוב להידבקות מוצלחת. בינוני זיהום חייב להשתנות בזמן לאחר התקופה הראשונית של זיהום HBV. 293T-NE-3NRs תאים הם בדרך כלל שברירי בעקבות זיהום עם titers ויראלי גבוהה. לכן, תאים אלה יש לשטוף בעדינות כדי למנוע ניתוק התאים לאחר 24 שעות של זיהום. כאשר משתמשים בתוספות ממברנה לתרבות, עלינו לוודא שצפיפות הזריעה הראשונית מתאימה, והחדר ממוקם במידה מספקת במדיה כדי להבטיח חיבור יעיל של חלקיקים ויראליים לתאים 293T-NE-3NRs. כדי לזהות את HBcAg קאג, אנחנו חייבים לשטוף את התאים בעדינות לפני הקיבעון כדי למנוע אותות חיוביים שווא. הטיפול חייב להילקח במהלך שטיפת כאשר התאים 293T נוטים להתנתק מלמטה.

הדבקה 293T-NE-3NRs על ידי HBV היא לא קלה כמו NTCP-הביע HepG2. בניגוד HepG2, תאים אלה קל להתנתק מהחלק התחתון של הלוח במהלך התרבות. תאים אלה הם שבירים יותר מאשר HepG2 לאחר זיהום באמצעות DMSO ו PEG8000 או שיתוף התרבות עם HepG 2.2.15 במשך 10 ימים ללא הזדקנות. לכן, אנחנו צריכים לעיל את הצלחת על ידי 0.1% ג'לטין וזרע מספר התאים המתאימים לתוך הצלחת. טיפול נוסף יש לנקוט כדי למנוע את התאים להתנתק במהלך שינוי המדיום, כביסה או תיקון התאים.

לעומת שיטות הזיהום HBV המסורתית, אימצנו קו תא 293T מהונדסים, 293T-NE-3NRs, כמו מודל זיהום ושיתוף תרבותי זה עם HepG 2.2.15. מעניין, 293T-NE-3NRs תאים נדבקו בהצלחה עם HBV אפילו ב-GEq נמוך אשר מחקה מצבים פיזיולוגיים טבעיים באופן מדויק יותר. דוגמנות HBV זיהום ב 293T-NE-3NRs הוא שימושי להשלים את אחד מסורתי בשל הרקע הלא הכבד של תאים אלה. יישום השיטה עשוי לסייע לנו לזהות את הגורמים המארחים הרומן למרות יעילות הזיהום של שיטה זו אינה גבוהה כמו המסורתי. אנו מאמינים כי במודלים של מבחנה שהוצגו בכתב יד זה יסייעו להקל על תגליות חדשות בתחום.

מגבלה לשיטה זו היא יעילות הזיהום. הזיהום HBV מחוץ לגופית הוא לא קל כמו זה בvivo. זרם מודלים מחוץ גופית עבור HBV הם מוגבלים בשל הרגישות המסכנה שלהם לזיהום HBV, שם מאוד מאוד מאוד האירוולה נדרשים ליזום זיהום ואין התפשטות ויראלי ברור10. זה בניגוד שחור בתצפיות vivo שבהן הוbv היחיד יכול להדביק חלק גדול של הפטציטים בתוך שבועות בלבד11,12. כך, הזיהוי של גורמי מארח הרומן המשפיעים על שכפול HBV הוא מועיל מאוד לקדם את ההבנה שלנו של HBV ואינטראקציות מארחים. יתר על כן, על ידי חיקוי של vivo בכבד או פיתוח כליות, אורגנואידים תפקודית ניתן לייצר כי היה מקרוב יותר לכידה של התפקוד הפיזיולוגי של כבד אדם או כליה13,14. זה יהיה מאוד לשפר את ההבנה שלנו של זיהום HBV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 81870432 ו 81570567 X.L.Z.), (No. 81571994 כדי P.N.S.), קרן מחקר למדענים צעירים בינלאומיים (No. 81950410640 ל-W.I.); הקרן האוניברסיטאי לShantou לי קה (לא. L1111 2008 לP.N.S.). ברצוני להודות לפרופ ' סטנלי לין מהמכללה לרפואה של אוניברסיטת Shantou לקבלת עצות שימושיות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45μm membrane filter Millex-HV SLHU033RB Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate BIOFIL TCP010006 For co-culture
Amicon Ultra 15 ml Millipore UFC910008 For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA Beyotime ST023 For immunofluorescence assay
Cyclosporin A Sangon biotech 59865-13-3 inhibitor of HBV infection
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) DAAN GENE 7265-2013 For HBV DNA detection
DMEM HyClong SH30243.01 For culture medium
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS) CLARK Bioscience FB25015 For culture medium
Fluorescence microscope ZEISS Axio observer Z1 For immunofluorescence assay
HepG2-NE Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
HBcAg antibody ZSGB-BIO ZA-0121 For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS ZSGB-BIO ZLI-9062 For cell wash
PEG8000 Merck P8260 For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine Thermo Fisher 10378016 For culture medium
Transwell CORNING 3412 For co-culture
Tween 20 sigma-Aldrich WXBB7485V For PBST
Virkon Douban 6971728840012 Viruside

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2017).
  2. Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
  3. Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
  4. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
  5. Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
  6. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
  7. Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
  8. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
  9. Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
  10. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  11. Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
  12. Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
  13. Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
  14. Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).

Tags

החודש יופיטר סוגיה 160 זיהום HBV מודל HepG 2.2.15 HepG-NE 293T-NE-3NRs NTCP קולטני הורמונים גרעיניים
דוגמנות דלקת כבד B וירוס ב-t-הפטיטיס 293T-NE-3NRs תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, X., Yang, X., Zeng, C., Attia… More

Sun, X., Yang, X., Zeng, C., Attia Koutb Megahed, F., Zhou, Q., Liu, T., Iqbal, W., Sun, P., Zhou, X. Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells. J. Vis. Exp. (160), e61414, doi:10.3791/61414 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter