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Immunology and Infection

गैर-हेपेटिक 293T-NE-3NRs कोशिकाओं में हेपेटाइटिस बी वायरस संक्रमण मॉडलिंग

Published: June 5, 2020 doi: 10.3791/61414
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3,5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College, 4Medical Research Center, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, 5Department of Nucleic Acid Researches, Genetic Engineering and Biotechnology Research Institute, General Autority - City of Scientific Researches and Technological Applications
* These authors contributed equally

Summary

यह पांडुलिपि मानव NTCP, HNF4α, RXRα और PPARα) और पारंपरिक हेपेटिक कोशिकाओं (HepG2-NE, मानव NTCP व्यक्त) को व्यक्त करते हुए, उपन्यास इंजीनियर 293T कोशिकाओं (293T-NE-3NRs) में हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।

Abstract

एचबीवी मुख्य रूप से मानव हेपेटोसाइट्स को संक्रमित करता है, लेकिन यह किडनी और टेस्टिस जैसे बाहरी ऊतकों को संक्रमित करने के लिए भी पाया गया है। फिर भी, सेल-आधारित एचबीवी मॉडल हेपेटोमा सेल लाइनों (जैसे हेपजी2 और हुह 7) तक सीमित हैं, जो एक कार्यात्मक एचबीवी रिसेप्टर, सोडियम तौरोकोटल सह-परिवहन पॉलीपेप्टाइड (एनटीसीपी) से अधिक है। यहां, हमने मॉडल सेल लाइनों के रूप में 293T-NE-3NRs (293T ओवरएक्सप्रेसिंग ह्यूमन एनटीसीपी, एचएनएफ4α, RXRα और PPARα) और हेपजी2-एनई (हेपजी2 ओवरएक्सप्रेसिंग एनटीसीपी) का उपयोग किया।   इन सेल लाइनों में एचबीवी संक्रमण या तो HepG2.2.15 से केंद्रित एचबीवी वायरस कणों का उपयोग करके या लक्ष्य सेल लाइनों के साथ सह-संस्कृति हेपजी2.2.15 द्वारा किया गया था। एचबीसीएज के लिए एचबीसीएज इम्यूनोफ्लोरेसेंस एचबीवी संक्रमण की पुष्टि के लिए किया गया था। यहां प्रस्तुत दो तरीकों से हमें गैर-हेपेटिक सेल लाइनों में एचबीवी संक्रमण का अध्ययन करने में मदद मिलेगी।

Introduction

हेपेटाइटिस बी 2 अरब से अधिक लोगों के जीवन को प्रभावित करता है और सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए प्रमुख खतरों में से एक है। लगभग 257 मिलियन लोग दुनिया भर में हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) से लंबे समय से संक्रमित हैं, जिससे समाज के लिए एक बड़ा बोझ पैदा हो रहा है1। हेपेटोसाइट्स एचबीवी और गैर-हेपेटिक ऊतकों में अन्य कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाएं नहीं हैं, जैसे गुर्दे और टेस्टिस, इस वायरस2,,3से भी संक्रमित हैं। वर्तमान में, एचबीवी संक्रमण सेल मॉडल केवल कुछ गैर-हेपेटिक सेल लाइन मॉडल के साथ मानव हेपेटोसाइट्स तक सीमित हैं। इससे एचबीवी इंफेक्शन और एचबीवी से संबंधित पैथोलॉजी नॉन हेपेटिक टिश्यू के अध्ययन में बाधा आती है। यहां हम गैर-हेपेटिक 293T कोशिकाओं के साथ-साथ हेपेटोमा-आधारित कोशिकाओं में एचबीवी संक्रमण का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

सोडियम तौरोरोलेट सह परिवहन पॉलीपेप्टाइड (एनटीसीपी) मानव हेपेटाइटिस बी और हेपेटाइटिस डी वायरस4के लिए एक कार्यात्मक रिसेप्टर है । हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4α (HNF4α), रेटिनोइड एक्स रिसेप्टर α (RXRα) और पेरोक्सिसोम प्रोलिफरेटर-सक्रिय रिसेप्टर α (PPARα) जिगर से समृद्ध प्रतिलेखन कारक हैं जो एचबीवी के वायरल ट्रॉपिज्म को प्रतिबंधित करते हैं। उन्हें एचबीवी प्रीजेनोमिक आरएनए संश्लेषण को बढ़ावा देने और नॉनहेपेटोमा सेल लाइन5में एचबीवी प्रतिकृति का समर्थन करने के लिए सत्यापित किया गया है । हमने एनटीसीपी (हेपजी2-एनई), 293T सेल लाइन को व्यक्त करते हुए एनटीसीपी (293T-NE) और 293T सेल लाइन को व्यक्त करते हुए तीन अलग-अलग सेल लाइनों का निर्माण किया; एनटीसीपी, एचएनएफ4α, आरएक्सआरα और पीपीएआर α (293T-NE-3NRs)। एचबीवी संक्रमण के लिए दो तरीके 293T-NE-3NRs(चित्रा 1) केआधार पर विकसित किए गए थे । पहली विधि 24 घंटे के लिए उच्च वायरल जीनोम तुल्यता (उच्च GEq (150), DMSO और PEG8000) के साथ 293T-NE-3NRs में टीका का उपयोग करता है। दूसरी विधि हेपजी2.2.15 के साथ 293T-NE-3NRs को सह-संस्कृति को नियोजित करती है, जो डीएमएसओ और PEG8000 के बिना एचबीवी कणों (कम जीईक्यू (लगभग 1.83) का उत्पादन कर सकती है, इस प्रकार प्राकृतिक स्थितियों का अनुकरण करती है।

हेपजी 2.2.15 कोशिकाएं हेपजी 2 लाइन से प्राप्त होती हैं और लंबे समय से संक्रामक एचबीवी को स्रावित करती हैं, साथ ही संस्कृति माध्यम6,,7में उपवायरल कणों को भी स्रावित करती हैं। साइक्लोस्पोरिन ए (सीएसए) एक इम्यूनोसप्रेसेंट है जो चिकित्सकीय रूप से ज़ेनोबेड़ा अस्वीकृति के दमन के लिए उपयोग किया जाता है। अध्ययनों से पता चला है कि सीएसए एनटीसीपी की ट्रांसपोर्टर गतिविधि को बाधित करके और एनटीसीपी के बाइंडिंग को बड़े लिफाफे प्रोटीन8में अवरुद्ध करके सुसंस्कृत हेपेटोसाइट्स में एचबीवी प्रवेश को रोकता है ।

HepG2-NE कोशिकाओं को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था जबकि सीएसए का इलाज कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण समूहों के साथ तुलना करके, हम पता लगा सकते हैं कि एचबीवी संक्रमण में कौन सा मेजबान जीन महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अतिरिक्त, एचबीवी संक्रमण के इस तरीके के माध्यम से, हम एचबीवी संक्रमण में शामिल अन्य उपन्यास तंत्र या मेजबान जीन भी पा सकते हैं।

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Protocol

देश में जैवसेफ्टी मार्गदर्शन के अनुसार, हेपजी 2.2.15 कोशिकाओं और एचबीवी संक्रमण से सुपरनेटेंट का संग्रह जैवसंकर स्तर II (पी 2) या जैवसंकर्ष स्तर III (पी 3) प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए। प्रयोगशाला कर्मियों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगशाला सुरक्षा प्रथाओं का पालन किया जाना चाहिए, और सभी को एचबीवी प्रयोगों को करने से पहले एचबीएसएब सकारात्मक टीका लगाया जाना चाहिए और इसका पता लगाया जाना चाहिए । अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले हर कदम पर कोशिकाओं की स्थिति का निरीक्षण करें। मानव सीरम नमूनों का उपयोग शांतू विश्वविद्यालय मेडिकल कॉलेज के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा प्राप्त अनुमोदन के अनुसार किया गया था ।

1. HepG2.2.15 सेल संस्कृति

नोट: HepG2.2.15 सेल सुपरनैक्टेंट, HepG2.2.15 सेल सुपरनैक्टेंट ध्यान केंद्रित और हेपजी2.2.15 के संपर्क में आने वाले सभी टिप्स, फ्लैक्स, प्लेट्स और ट्यूब्स को रात भर 2% विरुसिड में भिगोने के बाद निपटाया जाना चाहिए।

  1. तरल नाइट्रोजन से हेपजी2.2.15 कोशिकाओं वाली शीशी को हटा दें और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में धीरे-धीरे शीशी को घूमता हुआ गल लें।
    नोट: संदूषण की संभावना को कम करने के लिए, टोपी को पानी से बाहर रखें। विगलन तेजी से होना चाहिए (लगभग 2 मिनट)।
  2. जैसे ही कोशिकाएं गल जाती हैं और 70% इथेनॉल के साथ इसे कीटाणुरहित करते हैं, पानी के स्नान से शीशी निकालें।
    नोट: इस बिंदु से सख्त aseptic शर्तों के तहत सभी कदम प्रदर्शन करते हैं ।
  3. कोशिकाओं को 25 सेमी2 ऊतक संस्कृति फ्लास्क में स्थानांतरित करें और पूर्ण संस्कृति माध्यम के 4 एमएल जोड़ें (डीएमईएम जिसमें 10% एफबीएस, पेनिसिलिन 100 यू/एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन 0.1 मिलीग्राम/एमएल) होता है। कोशिकाओं को 5% सीओ2के साथ आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

2. HepG2.2.15 सेल संस्कृति सुपरनैंट का संग्रह

  1. संस्कृति HepG2.2.15 सेल में टी-25 फ्लास्क 37 डिग्री सेल्सियस पर, 5% सीओ2 एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटरमें। हर 3 दिन में माध्यम बदलें।
  2. 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में सेल सुपरनेट को ले लीजिए। ढक्कन को मजबूती से बंद करें और इसे पैराफिन फिल्म से लपेटें।
  3. एचबीवी वायरस को सक्रिय रखने के लिए हेपजी2.2.15 सुपरनिटेंट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. ध्यान केंद्रित HepG2.2.15 सुपरनैंट

  1. HepG2.2.15 सुपरनेट को -20 डिग्री सेल्सियस से निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर गल जाएं।
  2. सेल के टुकड़ों को हटाने के लिए, एक नई 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब के लिए 0.45 माइक्रोन झिल्ली के साथ हेपजी2.2.15 सुपरनेट को फ़िल्टर करें। सबसे पहले, वायरस को फ़िल्टर करने से पहले 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 10 एमएल को फ़िल्टर करके फ़िल्टर ब्लॉक करें, फिर सेल कल्चर सुपरनेटिटर को फ़िल्टर करें।
  3. एक वायरस सांद्रता कॉलम में फ़िल्टर किए गए सुपरनेट्टर के 14 एमएल जोड़ें और ढक्कन को बंद करें। एक क्षैतिज कताई अपकेंद्रित्र में 35 मिनट के लिए 3,200 x ग्राम पर कॉलम अपकेंद्रित्र। हेपजी2.2.15 सुपरनिटेंट कंसंट्रेट (लगभग 200 माइक्रोन) को 1.5 एमएल ट्यूब में ले लीजिए।
  4. डीएमईएम के 200 माइक्रोन जोड़कर एक बार डीएमईएम के साथ कॉलम धोएं और इसे 1.5 एमएल ट्यूब में एकत्र करें।

4. सुपरनैटिसेंट कंसंट्रेट में एचबीवी डीएनए का पता लगाना

  1. ड्राई ब्लॉक हीटर चालू करें और तापमान को 100 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि हेपजी 2.2.15 सुपरनेटेंट कंसंट्रेट में एचबीवी डीएनए की एकाग्रता मानक वक्र सीमा के भीतर है, 1.5 माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में डीएमईएम के 190 माइक्रोनट ध्यान केंद्रित करने के लिए हेपजी2.2.15 सुपरनटेंट ध्यान केंद्रित करके ध्यान को 20 गुना पतला करें। HepG2.2.15 सुपरनिटेंट, नकारात्मक नियंत्रण (स्वस्थ दाता से एचबीवी-निगेटिव सीरम), एचबीवी पॉजिटिव कंट्रोल (एचबीवी-पॉजिटिव सीरम से एचबीवी रोगी) और किट में दिए गए मात्रात्मक संदर्भों के चार कमजोर पड़ने (200 माइक्रोन जोड़ें 2.0 x 106,2.0 x 105,2.0 x10 4,2.0 x 103 जीईक्यू /एमएल) को अलग करने के लिए क्रमशः 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब।
  3. किट से एचबीवी डीएनए एक्सट्रैक्टिंग बफर के 450 माइक्रोन जोड़ें, 15 एस के लिए भंवर और 10 एस के लिए नीचे स्पिन करें। 100 डिग्री सेल्सियस पर 100 डिग्री सेल्सियस पर सूखी ब्लॉक हीटर में 10 मिनट के लिए। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 12, 000 x g पर सेंट्रलाइज।
  4. बर्फ पर रखी पीसीआर ट्यूबों में पीसीआर मास्टर मिक्स के 27 माइक्रोन और टाक पॉलीमरेज एंजाइम के 3 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: किट में प्रदान की गई पीसीआर मास्टर मिक्स में एचबीवी डीएनए के संरक्षित क्षेत्र के खिलाफ प्राइमर होते हैं।
  5. बर्फ पर रखी पीसीआर ट्यूबों में 20 माइक्रोनल अपकेंद्रित्र सुपरनेट लिक्विड डालें। कसकर कवर करें और 10 एस के लिए नीचे स्पिन करें।
  6. वास्तविक समय पीसीआर मशीन पर निम्नलिखित शर्तों का उपयोग करें: 2 मिनट के लिए 93 डिग्री सेल्सियस, 45 एस के लिए 93 डिग्री सेल्सियस के 10 चक्र और उसके बाद 60 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस; फिर 30 एस के लिए 93 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र और उसके बाद 45 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस वास्तविक समय पीसीआर को पूरा करने के लिए।
    नोट: वाणिज्यिक किट में प्रदान किए गए मास्टर मिक्स में एचबीवी डीएनए के संरक्षित क्षेत्र के खिलाफ प्राइमर हैं।
  7. प्राप्त सीटी मूल्यों का निर्यात करें और तालिका 1 और चित्रा 2में दिखाए गए मानक वक्र उत्पन्न करें।
  8. मानक वक्र के आधार पर, हेपजी2.2.15 सुपरनैट कंसंट्रेट के एचबीवी डीएनए एकाग्रता की गणना करें, जैसा कि तालिका 2में दिखाया गया है। HepG2.2.15 सुपरनैट्ट कंसंट्रेट(टेबल 2)के एचबीवी डीएनए एकाग्रता की गणना करें।
  9. HepG2.2.15 सुपरनेट अलीकोट में ध्यान केंद्रित करें और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. हेपजी2-एनई और 293T-NE-3NRs कोशिकाओं के इन विट्रो संक्रमण

  1. डीएमईएम/एफ-12 में निम्नलिखित संक्रमण माध्यम तैयार करें: 10% एफबीएस, 4 एमएम ग्लूटामीन पूरक, 0.1 m NEAA, 1 m सोडियम पायरुवेट, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमामाइसिन, 1 μg/mL puromycin, 40 एनजी/एमएल डेक्सामेथासोन, 20 μg/mL हाइड्रोकॉर्टिकोन और 5 μg/ml इंसुलिन। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: ये एनटीसीपी पॉजिटिव कोशिकाएं प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी9हैं ।
  2. 48 अच्छी तरह से प्लेट के 5 कुओं में 0.1% जिलेटिन जोड़ें, प्रत्येक कुएं में 200 माइक्रोन। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें, सुपरनैंट को त्यागें। एक और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट इनक्यूबेट।
  3. बीज HepG2-NE 2 कुओं में 1 x 104 कोशिकाओं के घनत्व पर प्रत्येक । बीज 293T-NE-3NRs कोशिकाओं के एक घनत्व पर 1 x 104 कोशिकाओं में प्रत्येक (1 μmol/L पर सभी ट्रांस रेटिनोइक एसिड और 1 mmol/L पर क्लोफिब्रिक एसिड क्रमशः RXRα और PPARα परमाणु हार्मोन रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए माध्यम में जोड़ा गया था) । बीज 293T-NE 1 अच्छी तरह से 1 x 104 कोशिकाओं के घनत्व पर ।
    नोट: 0.25% ट्राइप्सिन का उपयोग करके उप-संगम में कोशिकाओं को पारित करना। सेल संख्या की गणना करें और फिर कोशिकाओं को उचित घनत्व में बीज करें।
  4. कोशिका को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें,5% सीओ 2 24 घंटे के लिए आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में। 24 घंटे के बाद कोशिकाओं का निरीक्षण करें और यदि कोशिकाएं स्वस्थ हैं तो संक्रमण के साथ आगे बढ़ें।
  5. टेबल 3में उल्लिखित संक्रमण परिसर तैयार करें, एचबीवी (हेपजी2.2.15 सुपरनेट कंसंट्रेट), डीएमएसओ, PEG8000 और संक्रमण माध्यम को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब जोड़ें। सीएसए स्टॉक को डीएमएसओ में 5 एमएम की सांद्रता में घोलकर तैयार करें और स्टॉक को -20 डिग्री पर रखें। सीएसए का वर्किंग सॉल्यूशन 5 माइक्रोन है। बीज 1 × 104 कोशिकाओं को अच्छी तरह से 48-अच्छी तरह से थाली के प्रति। 150 जीईक्यू/सेल में कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए हेपजी2.2.15 सुपरनैटसंट्रेंट्रेट (एचबीवी 1.5063 ×10 7 जीईक्यू/एमएल युक्त) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  6. प्रत्येक कुएं में संक्रमण परिसर के 500 माइक्रोन जोड़ें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें,24 घंटे के लिए आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2।
  7. माध्यम बदलने से पहले पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। प्रत्येक कुएं में माध्यम का 1 एमएल जोड़ें। यदि कोशिका राज्य खराब है और कुछ कोशिकाएं तैर रही हैं, तो सीधे माध्यम बदलें। यह संक्रमण का दिन 1 है। हर 2 दिन में धीरे-धीरे माध्यम बदलें।
  8. 11 दिन, कोशिकाओं को पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए बर्फ ठंड मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।

6. HepG2.2.15 सह संस्कृति के साथ HepG2-NE/293T-NE-3NRs/293T-NE

  1. 6 अच्छी तरह से थाली के 5 कुओं के लिए 0.1% जिलेटिन के 1 एमएल/वेल जोड़ें। प्लेट को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और सुपरनेट को त्यागें। अच्छी तरह से सूखने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 2 घंटे के लिए फिर से प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  2. बीज 1 x 105 कोशिकाओं/हेपजी के अच्छी तरह से-NE 2 कुओं में, 293T-NE-3NRs 2 कुओं में, और 293T-NE थाली के 1 अच्छी तरह से । बीज 1 x 105 कोशिकाओं/HepG2.2.15 के कुएं पर पांच झिल्ली आवेषण (24 मिमी, 0.4 माइक्रोन पोर व्यास, अनकोटेड) एक अलग 6 अच्छी तरह से थाली में । कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें,24 घंटे के लिए आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2।
  3. 24 घंटे के बाद, यदि कोशिकाएं सभी अनुयायी हैं और अच्छी स्थिति में हैं, तो सह-संस्कृति के लिए तैयार करें। 6-अच्छी तरह से प्लेट और सेल झिल्ली आवेषण में माध्यम त्यागें। हेपजी-एनई, 293T-NE-3NRs और चिमटी द्वारा 293T-NE-NE के साथ वरीयता प्राप्त 6 अच्छी तरह से प्लेट में हेपजी2.2.15 के साथ झिल्ली सम्मिलित रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल इनक्यूबेट, 5% सीओ2 एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में, हर 3-4 दिन में मीडियम बदलें।
    नोट: निम्नलिखित के रूप में समूहों को सेट करें: ठीक है 1: हेपजी 2.2.15 के साथ 293T-NE सह-संस्कृति; खैर 2: हेपजी 2-NE सह-संस्कृति हेपजी 2.2.15 के साथ; खैर 3: 293T-NE-3NRs सह-संस्कृति HepG2.2.15 के साथ; खैर 4: हेपजी 2-NE सह-संस्कृति हेपजी 2.2.15 (सीएसए जोड़ें); खैर 5: 293T-NE-3NRs सह संस्कृति HepG2.2.15 के साथ (सीएसए जोड़ें); अच्छी तरह से संख्या 1, 2 और 3 के लिए पूरा माध्यम जोड़ें, अच्छी तरह से संख्या 4 और 5 अच्छी तरह से 5 μM सीएसए के साथ माध्यम जोड़ें, प्रत्येक अच्छी तरह के लिए लगभग 9 एमएल, सुनिश्चित करें कि मीडिया के संपर्क में है ताकि वायरस कणों के लिए ट्रांसवेल से संक्रमित कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए ।
  4. 10 दिनों के बाद, झिल्ली आवेषण को हटा दें, पीबीएस को 6-अच्छी तरह से प्लेट में जोड़ें और धीरे-धीरे दो बार धोएं, इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए बर्फ ठंड मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।

7. एचबीसीएजी के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस करें

  1. 3 घंटे से अधिक के लिए बर्फ ठंड मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को -20 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें। मेथनॉल को छोड़ दें। शेकर पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, 3 बार दोहराएं।
  2. 5% बीएसए जोड़ें (१०० μL/48-अच्छी थाली, ५०० μL/6-अच्छी तरह से थाली), ४० आरपीएम और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए क्षैतिज शेखर पर हिला ।
  3. एचबीसीएज प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (प्राथमिक एंटीबॉडी: 5% बीएसए समाधान = 1:200, 100 माइक्रोल/ 48-वेल-प्लेट, 500 माइक्रोन / 6-वेल-प्लेट जोड़ें), रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं।
  4. पीबीएसटी (पीबीएस के साथ कुओं को 0.1% ट्वीन 20) के साथ धोएं, शेकर पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए, 3 बार दोहराएं।
  5. दूसरा एंटीबॉडी समाधान जोड़ें (५९४ खरगोश IgG के खिलाफ बकरी में उठाया एंटीबॉडी लेबल: PBS = 1:1,000, १०० μL/४८-अच्छी तरह से थाली, ५०० μL/6 अच्छी तरह से थाली), पन्नी के साथ थाली को कवर और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए हिला ।
  6. तीन बार के लिए PBST के साथ फिर से धोएं, प्रत्येक 10 मिनट के लिए हिलाएं।
  7. 1 μg/mL DAPI जोड़ें, 2 मिनट के लिए हिलाएं । 5 मिनट प्रत्येक के लिए एक शेखर पर PBST के साथ दो बार धोएं । पीबीएएसटी को छोड़ दें। पीबीएस जोड़ें और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।

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Representative Results

हमने एनटीसीपी और ईजीएफपी फ्यूजन और प्यूरोमाइसिन प्रतिरोध के साथ पीसिन-एनटीसीपी-ईजीएफपी प्लाज्मिड का निर्माण किया। प्लाज्मिड को स्थिर सेल लाइनों हेपजी 2-एनई और 293T-NE व्यक्त करने के लिए हेपजी2 और 293T कोशिकाओं में संक्रमित किया गया था। प्लाज्मिड्स (PSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-फ्लैग) puromycin प्रतिरोध और अभिव्यक्ति के साथ 293T-NE कोशिकाओं में संक्रमित करने के लिए एक स्थिर सेल लाइन का निर्माण करने के लिए 4 मेजबान जीन9व्यक्त किया गया । एनटीसीपी-ईजीएफपी की अभिव्यक्ति को ग्रीन फ्लोरेसेंस द्वारा देखा जा सकता है, और क्यूपीसीआर और पश्चिमी दाग द्वारा सत्यापित किया जा सकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है, लेकिन पिछले काम 9देखें)।

एचबीसीएज और दापी की प्राथमिक एंटीबॉडी को निश्चित कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था, जब फ्लोरोसेंट उल्टे माइक्रोस्कोप पर 10x उद्देश्य का उपयोग करके मनाया जाता है। डीएपीआई(चित्रा 3 और चित्रा 4 -तीसरेकॉलम) के साथ धुंधला करके परमाणु स्थानीयकरण की पुष्टि की गई थी। एनटीसीपी-ईजीएफपी कोशिका झिल्ली पर व्यक्त किया जाता है और हरे रंग की फ्लोरेसेंस(चित्र 3 और चित्रा 4 -दूसराकॉलम) द्वारा स्थित किया जा सकता है। एचबीसीएज की अभिव्यक्ति साइटें लाल फ्लोरेसेंस(चित्रा 3 और चित्रा 4-पहला कॉलम) द्वारा स्थित की जा सकती हैं। जब DAPI, NTCP और HBcAg एक ही सेल में हैं, इसका मतलब है कि सेल सफलतापूर्वक HBV(चित्रा 3 और चित्रा 4-अंतिमकॉलम) से संक्रमित किया गया है ।

सीएसए ग्रुप निगेटिव कंट्रोल था । सीएसए ने एचबीवी को एनटीसीपी को ब्लॉक कराकर कोशिकाओं में प्रवेश करने से रोक दिया । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, संक्रमित HepG2-NTCP-EGFP कोशिकाओं HBcAg व्यक्त कर सकते हैं । HBcAg 293T-NE-3NRs कोशिकाओं में पता चला था, लेकिन 293T-NE कोशिकाओं में नहीं, NTCP का संकेत 293T में एचबीवी संक्रमण के लिए आवश्यक ही कारक नहीं है । हेपजी 2.2.15 सुपरनेट कंसंट्रेट से संक्रमित कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस हेपजी2.2.15 सेल के साथ सह-संस्कारी कोशिकाओं के समान था। इससे पता चला कि एचबीसीएज को 293T-NE-3NRs और HepG2-NE कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था, इससे पता चलता है कि चार मेजबान जीन (एनटीसीपी, एचएनएफ4α, RXRα और PPARα) एचबीवी संक्रमण की सुविधा प्रदान करते हैं । लेकिन 293T-NE-3NRs में HBcAg के लिए संकेत HepG2-NE की तुलना में कम थे, एचबीवी संक्रमण का संकेत भी अंय मेजबान कारकों से प्रभावित हो सकता है ।

मात्रात्मक संदर्भ मात्रात्मक संदर्भ मात्रात्मक संदर्भ मात्रात्मक संदर्भ नकारात्मक नियंत्रण एचबीवी सकारात्मक नियंत्रण
1 2 3 4
सीटी 20.1527 17.6647 14.5816 12.0409 कोई नहीं 12.3865
GEq/एमएल 2*10 ^3 2*10 ^4 2*10 ^5 2*10 ^6 —— ——

तालिका 1: मात्रात्मक संदर्भों के लिए सीटी मान।

हेपजी 2.2.15
सुपरनैंट		 1/20 हेपजी 2.2.15
ध्यान केंद्रित		 हेपजी 2.2.15
ध्यान केंद्रित
सीटी 17.716 13.1556 ——
GEq/एमएल 1.65*10 ^4 7.53*10 ^5 1.5 *10 ^7

तालिका 2: HpG2.2.15 सुपरनिटेंट से प्राप्त एचबीवी डीएनए के लिए सीटी मान। मान मूल सुपरनैटिन, 1/20 कमजोर पड़ने या इसके ध्यान से प्राप्त एचबीवी डीएनए के लिए सीटी मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

293T-NE हेपजी2-एनई 293T-NE-3NRs
एचबीवी एचबीवी एचबीवी + सीएसए एचबीवी एचबीवी + सीएसए
एचबीवी जीईक्यू/सेल 150 150 150 150 150
एचबीवी माइक्रोल 100 100 100 100 100
सीएसए माइक्रोन (5 माइक्रोन) 0 0 0.5 0 0.5
डीएमएसओ माइक्रोन 10 10 9.5 10 9.5
40% PEG8000μl 50 50 50 50 50
संक्रमण माध्यम माइक्रोन 340 340 340 340 340
कुल माइक्रोन 500 500 500 500 500

तालिका 3: संक्रमण जटिल। कुल मात्रा 500 माइक्रोन थी। साइक्लोस्पोरीन ए का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का एक चित्रमय प्रतिनिधित्व। HepG2.2.15 या तो 293T-NE-3NRs के साथ सह-संस्कारी थे और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके संक्रमण देखा गया था या वायरल कणों वाले सुपरनाटेंट को केंद्रित किया गया था और 293T-NE-3NRs सुसंस्कृत कोशिकाओं में पेश किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एचबीवी मानक वक्र सीटी मानों से गणना की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: HepG2.2.15 सुपरनिटेंट ध्यान 293T-NE, 293T-NE-3NRs और HepG2-NE कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था १५० GEq प्रति सेल के साथ । एचबीसीएज अभिव्यक्ति की पहचान इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख से हुई थी । एचबीसीएज को 293T-NE-3NRs और HepG2-NE कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था, जबकि सीएसए (एचबीवी प्रवेश अवरोधक) और 293T-NE कोशिकाओं के साथ इलाज की गई इन कोशिकाओं में कोई अभिव्यक्ति नहीं देखी गई थी । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: 293T-NE, 293T-NE-3NRs और HepG2-NE सह HepG2.2.15 कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत । एचबीसीएज अभिव्यक्ति की पहचान इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख से हुई थी । एचबीसीएज को 293T-NE-3NRs और HepG2-NE कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था, जबकि सीएसए (एचबीवी प्रवेश अवरोधक) और 293T-NE कोशिकाओं के साथ इलाज की गई इन कोशिकाओं में कोई अभिव्यक्ति नहीं देखी गई थी । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां, हम गैर-हेपेटिक 293T-NE-3NRs और हेपेटोमा आधारित हेपजी2-एनई कोशिकाओं में एचबीवी संक्रमण के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। 293T-NE-3NRs उच्च और निम्न दोनों GEq पर एचबीवी संक्रमण के लिए उपयुक्त थे। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदमों पर विचार किए जाने की आवश्यकता है । कोशिका की स्थिति एक सफल संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। एचबीवी संक्रमण की प्रारंभिक अवधि के बाद संक्रमण माध्यम को समय पर बदलना होगा। 293T-NE-3NRs कोशिकाओं को आम तौर पर उच्च वायरल titers के साथ संक्रमण के बाद नाजुक हैं । इसलिए, इन कोशिकाओं को संक्रमण के 24 घंटे के बाद कोशिकाओं को अलग करने से बचने के लिए धीरे से धोया जाना चाहिए। संस्कृति के लिए झिल्ली आवेषण का उपयोग करते समय, हमें यह सुनिश्चित करना चाहिए कि प्रारंभिक सीडिंग घनत्व उपयुक्त है, और कक्ष 293T-NE-3NRs कोशिकाओं के लिए वायरल कणों की कुशल लगाव सुनिश्चित करने के लिए मीडिया में पर्याप्त रूप से जलमग्न है । HBcAg का पता लगाने के लिए, हमें झूठे सकारात्मक संकेतों से बचने के लिए निर्धारण से पहले कोशिकाओं को धीरे से धोना चाहिए। देखभाल धोने के कदम के दौरान लिया जाना चाहिए के रूप में 293T कोशिकाओं को नीचे से अलग करते हैं ।

एचबीवी द्वारा 293T-NE-3NRs को संक्रमित करना एनटीसीपी-एक्सप्रेसिंग हेपजी2 जितना आसान नहीं है। HepG2 के विपरीत, इन कोशिकाओं को संस्कृति के दौरान थाली के नीचे से अलग करने के लिए आसान कर रहे हैं । और इन कोशिकाओं को PASSSO और PEG8000 या सह के साथ HepG2.2.15 के साथ सह संस्कृति का उपयोग कर संक्रमण के बाद HepG2 से अधिक नाजुक है 10 दिनों के लिए पासिंग । इसलिए, हमें प्लेट में 0.1% जिलेटिन और बीज उपयुक्त सेल नंबर द्वारा प्लेट को कोट करने की आवश्यकता है। माध्यम बदलने, धोने या कोशिकाओं को ठीक करने के दौरान अलग होने वाली कोशिकाओं को रोकने के लिए अधिक ध्यान रखा जाना चाहिए।

पारंपरिक एचबीवी संक्रमण विधियों की तुलना में, हमने संक्रमण मॉडल के रूप में एक इंजीनियर 293T सेल लाइन, 293T-NE-3NRs को अपनाया और हेपजी2.2.15 के साथ इसे सह-सुसंस्कृत किया। दिलचस्प बात यह है कि 293T-NE-3NRs कोशिकाओं को कम GEq पर भी एचबीवी से सफलतापूर्वक संक्रमित किया गया था जो प्राकृतिक शारीरिक स्थितियों की अधिक सटीकता से नकल करता है। 293T-NE-3NRs में मॉडलिंग एचबीवी संक्रमण इन कोशिकाओं की गैरहेपेटिक पृष्ठभूमि के कारण पारंपरिक एक के लिए एक उपयोगी पूरक है। विधि के आवेदन से हमें उपन्यास मेजबान कारकों की पहचान करने में मदद मिल सकती है, हालांकि इस विधि की संक्रमण दक्षता पारंपरिक के रूप में अधिक नहीं है। हमारा मानना है कि इस पांडुलिपि में प्रस्तुत इन विट्रो मॉडल क्षेत्र में नई खोजों को सुगम बनाने में मदद करेंगे ।

इस विधि की एक सीमा संक्रमण दक्षता है। वीवो में इन विट्रो एचबीवी इंफेक्शन उतना आसान नहीं है। एचबीवी संक्रमण के लिए उनकी खराब संवेदनशीलता के कारण एचबीवी के लिए वर्तमान इन विट्रो मॉडल सीमित हैं, जहां संक्रमण शुरू करने के लिए बेहद उच्च इनोकुला की आवश्यकता होती है और कोई स्पष्ट वायरल स्प्रेड10नहीं है। यह वीवो टिप्पणियों के विपरीत है जहां एक एचबीवी विषाणु मात्र11,12सप्ताह में हेपेटोसाइट्स के एक बडे हिस्से को संक्रमित कर सकता है . इस प्रकार, एचबीवी प्रतिकृति को प्रभावित करने वाले उपन्यास मेजबान कारकों की पहचान एचबीवी और मेजबान बातचीत की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए बहुत फायदेमंद है। इसके अलावा, वीवो लिवर या गुर्दे के विकास में नकल करके, कार्यात्मक ऑर्गेनॉइड उत्पन्न किए जा सकते हैं जो मानव यकृत या गुर्दे13, 14,14के शारीरिक कामकाज को अधिक बारीकी से पुन: कृतित करेंगे। इससे एचबीवी संक्रमण के बारे में हमारी समझ में काफी वृद्धि होगी ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 81870432 और 81570567 से X.L.Z.), (नंबर 81571994 से पी.एन.एस.), इंटरनेशनल यंग साइंटिस्ट्स के लिए रिसर्च फंड (नंबर 81950410640 से डब्ल्यूआई) द्वारा समर्थित किया गया था; ली का शिंग शांतोउ यूनिवर्सिटी फाउंडेशन (नहीं । L1111 2008 से P.N.S.) । हम शंतू यूनिवर्सिटी मेडिकल कॉलेज के प्रो स्टेनली लिन को उपयोगी सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45μm membrane filter Millex-HV SLHU033RB Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate BIOFIL TCP010006 For co-culture
Amicon Ultra 15 ml Millipore UFC910008 For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA Beyotime ST023 For immunofluorescence assay
Cyclosporin A Sangon biotech 59865-13-3 inhibitor of HBV infection
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) DAAN GENE 7265-2013 For HBV DNA detection
DMEM HyClong SH30243.01 For culture medium
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS) CLARK Bioscience FB25015 For culture medium
Fluorescence microscope ZEISS Axio observer Z1 For immunofluorescence assay
HepG2-NE Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
HBcAg antibody ZSGB-BIO ZA-0121 For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS ZSGB-BIO ZLI-9062 For cell wash
PEG8000 Merck P8260 For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine Thermo Fisher 10378016 For culture medium
Transwell CORNING 3412 For co-culture
Tween 20 sigma-Aldrich WXBB7485V For PBST
Virkon Douban 6971728840012 Viruside

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References

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JoVE में इस महीने अंक १६० एचबीवी संक्रमण मॉडल HepG2.2.15 हेपजी-NE 293T-NE-3NRs NTCP परमाणु हार्मोन रिसेप्टर्स
गैर-हेपेटिक 293T-NE-3NRs कोशिकाओं में हेपेटाइटिस बी वायरस संक्रमण मॉडलिंग
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Sun, X., Yang, X., Zeng, C., Attia… More

Sun, X., Yang, X., Zeng, C., Attia Koutb Megahed, F., Zhou, Q., Liu, T., Iqbal, W., Sun, P., Zhou, X. Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells. J. Vis. Exp. (160), e61414, doi:10.3791/61414 (2020).

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