Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per l'infezione da virus dell'epatite B (HBV) in nuove cellule 293T ingegnerizzate (293T-NE-3NRs, che esprime NTCP umana, HNF4, RXR e PPAR) e cellule epatiche tradizionali (HepG2-NE, che esprimono NTCP umani).
Abstract
L'HBV infetta principalmente gli epatociti umani, ma è stato anche trovato per infettare tessuti extraepatici come reni e testicoli. Ciò nonostante, i modelli HBV basati su cellule sono limitati alle linee cellulari dell'epatoma (come HepG2 e Huh7) sovraesprimendo un recettore HBV funzionale, il taurocholate di sodio co-trasportando polipeptide (NTCP). In questo caso, abbiamo utilizzato 293T-NE-3NRs (293T sovraesprimenti umani NTCP, HNF4, RXR e PPAR) e HepG2-NE (HepG2 sovraesprimendo NTCP) come linee cellulari del modello. L'infezione da HBV in queste linee cellulari è stata eseguita utilizzando particelle di virus HBV concentrate da HepG2.2.15 o co-culcolando HepG2.2.15 con le linee cellulari di destinazione. L'immunofluorescenza HBcAg per HBcAg è stata eseguita per confermare l'infezione da HBV. I due metodi qui presentati ci aiuteranno a studiare l'infezione da HBV nelle linee cellulari non epatiche.
Introduction
L'epatite B influisce sulla vita di oltre 2 miliardi di persone ed è una delle principali minacce per la salute pubblica. Circa 257 milioni di persone sono cronicamente infettate dal virus dell'epatite B (HBV) in tutto il mondo, causando un grande fardello per la società1. Gli epatociti non sono le uniche cellule infettate da HBV e altre cellule nel tessuto non epatico, come rene e testicoli, sono anche infettate da questo virus2,3. Attualmente, i modelli cellulari di infezione da HBV sono limitati agli epatociti umani con solo pochi modelli di linee cellulari non epatiche. Ciò ostacola lo studio dell'infezione da HBV e della patologia correlata all'HBV dei tessuti non epatici. Qui presentiamo protocolli per studiare l'infezione da HBV nelle cellule 293T non epatiche e nelle cellule a base di epatoma.
Il polipeptide co-trasporto del taurocholato di sodio (NTCP) è un recettore funzionale per l'epatite B umana e il virus dell'epatite D4. Il fattore nucleare di epatocita 4 (HNF4), il recettore X dei resinoidi ( ) e il recettore attivato dal proliferatore perossisoso (PPAR) sono fattori di trascrizione arricchiti di fegato che limitano il tropismo virale dell'HBV. Sono stati verificati per promuovere la sintesi dell'RNA pregenomico HBV e supportano la replicazione dell'HBV in una linea cellulare non epatoma5. Abbiamo costruito tre diverse linee cellulari, le linee cellulari HepG2 che esprimono NTCP (HepG2-NE), la linea cellulare 293T che esprime NTCP (293T-NE) e la linea cellulare 293T che esprime quattro geni ospiti; NTCP, HNF4, RXR e PPAR (293T-NE-3NRs). Sono stati sviluppati due metodi per l'infezione da HBV sulla base di 293T-NE-3NRs (Figura 1). Il primo metodo utilizza l'inoculazione in 293T-NE-3NR con elevata equivalenza genomica virale (alto GEq (150), DMSO e PEG8000) per 24 h. Il secondo metodo impiega la co-coltura 293T-NE-3NRs con HepG2.2.15, che può produrre particelle HBV (basso GEq (circa 1,83) senza DMSO e PEG8000), emulando così da vicino le condizioni naturali.
Le cellule HepG2.2.15 sono derivate dalla linea EpG2 e secernono cronicamente particelle infettive HBV, così come particelle subvirali nel mezzo di coltura6,7. La ciclosporina A (CsA) è un immunosoppressore clinicamente utilizzato per la soppressione del rifiuto dello xenotrapianto. Gli studi hanno dimostrato che la CA inibisce l'ingresso dell'HBV negli epotociti coltivati inibendo l'attività di trasporto di NTCP e bloccando il legame di NTCP a grandi proteine di inviluppo8.
Le cellule EpG2-NE sono state usate come controllo positivo, mentre le cellule trattate dalla CsA sono state usate come controllo negativo. Confrontandoci con i gruppi di controllo positivi e negativi, possiamo scoprire quali geni ospiti svolgono un ruolo fondamentale nell'infezione da HBV. Inoltre, attraverso questa modalità di infezione da HBV, possiamo anche trovare altri nuovi meccanismi o geni ospiti coinvolti nell'infezione da HBV.
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Protocol
Coltura, raccolta di supernatanti da cellule HepG2.2.15 e infezione da HBV devono essere eseguite nel laboratorio di livello di biosicurezza II (P2) o di livello di biosicurezza III (P3) secondo le linee guida sulla biosicurezza nel paese. Le pratiche di sicurezza di laboratorio devono essere seguite per garantire la sicurezza del personale di laboratorio e tutte devono essere vaccinate e rilevate HBsAb positive prima di eseguire esperimenti HBV. Osservare lo stato delle cellule ad ogni passo prima di procedere al passaggio successivo. Campioni di siero umano sono stati utilizzati in conformità con l'approvazione ottenuta dal Institutional Review Board di Shantou University Medical College.
1. EpG2.2.15 coltura cellulare
NOTA: HepG2.2.15 cell supernatant, HepG2.2.15 cell supernatant concentrate e tutte le punte, fiasche, piastre e tubi che vengono in contatto con HepG2.2.15 devono essere disposti dopo essere stati immersi nel 2% di virucide durante la notte.
- Togliere la fiala contenente le cellule HepG2.2.15 dall'azoto liquido e scongelare delicatamente la fiala in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi.
NOTA: Per ridurre la possibilità di contaminazione, tenere il tappo fuori dall'acqua. Lo scongelamento deve essere rapido (circa 2 min). - Togliere la fiala dal bagno d'acqua non appena le cellule vengono scongelate e disinfettarla con il 70% di etanolo.
NOTA: da questo punto eseguire tutti i passaggi in condizioni asettiche rigorose. - Trasferire le cellule in un pallone di coltura tissutale di 25 cme aggiungere 4 mL di mezzo di coltura completo (DMEM contenente 10% FBS, penicillina 100 U/mL, streptomicina 0,1 mg/mL). Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata con 5% di CO2.
2. Collezione di EpG2.2.15 coltura cellulare supernatante
- Cultura HepG2.2.15 cellule in flaconi T25 a 37 gradi centigradi, 5% CO2 in un'incubatrice umidificata. Cambiare il mezzo ogni 3 giorni.
- Raccogliere il supernatante cellulare in un tubo di centrifuga di 50 mL. Chiudere saldamente il coperchio e avvolgerlo con una pellicola di paraffina.
- Conservare il supernatale EpG2.2.15 a -20 gradi centigradi per mantenere attivo il virus HBV.
3. Concentrare HepG2.2.15 supernatante
- Rimuovere l'EpG2.2.15 supernata da -20 gradi centigradi e scongelare a 4 gradi centigradi.
- Per rimuovere i frammenti cellulari, filtrare il supernatore HepG2.2.15 con una membrana di 0,45 m su un nuovo tubo di centrifugatura da 50 mL. In primo luogo, bloccare il filtro filtrando 10 mL di DMEM con 10% FBS prima di filtrare il virus, quindi filtrare il supernatante di coltura cellulare.
- Aggiungere 14 mL di supernatali filtrati a una colonna concentratore di virus e chiudere il coperchio. Centrifugare la colonna a 3.200 x g per 35 min in una centrifuga rotante orizzontale. Raccogliere il concentrato supernatante EpG2.2.15 (circa 200 -L) in un tubo da 1,5 mL.
- Lavare la colonna con DMEM una volta aggiungendo 200 L di DMEM e raccoglierla in un tubo da 1,5 mL.
4. Rilevamento del DNA HBV nel concentrato supernatante
- Accendere il riscaldatore a blocchi asciutti e impostare la temperatura a 100 gradi centigradi.
- Per garantire che la concentrazione del DNA HBV nel concentrato supernatante HepG2.2.15 rientri nell'intervallo di curve standard, diluire il concentrato di 20 volte aggiungendo 10 litri di concentrato supernata HepG2.2.15 a 190 .L di DMEM in un tubo di microcentrizzazione da 1,5 ml. Aggiungere 200 -L di EpG2.2.15 supernatante, controllo negativo (siero negativo HBV da donatore sano), controllo positivo HBV (HBV-positivo controllo dal paziente HBV) e quattro diluizioni dei riferimenti quantitativi forniti nel kit (2,0 x 106, 2,0 x 105, 2,0 x 104, 2,0 x 103 GEq /mL), rispettivamente per separare 1,5 mL microcentrifuga tubi.
- Aggiungete dal kit 450 l di buffer di estrazione del DNA HBV a tutti gli otto tubi da 1,5 mL di cui sopra, vortice per 15 s e girare verso il basso per 10 s. Incubare a 100 gradi centigradi per 10 min nel riscaldatore a blocchi asciutti. Centrifuga a 12.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Aggiungete 27 -L di miscela master PCR e 3 l di enzima di polimerasi Taq ai tubi PCR posti sul ghiaccio.
NOTA: il mix master PCR fornito nel kit contiene i primer contro la regione conservata del DNA HBV. - Aggiungere 20 l di liquido supernato centrifugato ai tubi PCR posti sul ghiaccio. Coprire saldamente e girare verso il basso per 10 s.
- Utilizzare le seguenti condizioni su una macchina PCR in tempo reale: 93 s per 2 min, 10 cicli di 93 s per 45 s seguiti da 55 s per 60 s; poi 30 cicli di 93 gradi centigradi per 30 s sono stati di 55 gradi centigradi per 45 s per effettuare la PCR in tempo reale.
NOTA: Il master mix fornito nel kit commerciale ha primer contro la regione conservata del DNA HBV. - Esportare i valori Ct ottenuti e generare una curva standard, come illustrato nella tabella 1 e nella figura 2.
- Sulla base della curva standard, calcolare la concentrazione di DNA HBV di HepG2.2.15 concentrazione supernatante diluita 20x come mostrato nella tabella 2. Calcolare la concentrazione di DNA HBV di EpG2.2.15 concentrazione supernatante (Tabella 2).
- Dividere il Supernatante EpG2.2.15 concentrarsi in aliquote e conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso.
5. Infezione in vitro delle cellule HepG2-NE e 293T-NE-3NRs
- Preparare il seguente mezzo di infezione in DMEM/F-12: 10% FBS, 4 mM di integratore di glutammina, 0,1 mM NEAA, 1 mM di pyruvate di sodio, 100 penicillina U/mL, 100 streptomicina, 1g/m puroLmycin, 40 ng/mL dexamethasone, 20 g/mL di idrocortisione e 5 g/mL di insulina. Conservare a 4 gradi centigradi.
NOTA: queste cellule positive NTCP sono resistenti alla puromycina9. - Aggiungere lo 0,1% di gelatina a 5 pozze di 48 pozzetto, 200 gradi a ogni pozzo. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 2 ore, scartare il supernatante. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per altri 2 h.
- Seme HepG2-NE ad una densità di 1 x 104 cellule in 2 pozze ciascuna. Seme 293T-NE-3NRs cellule ad una densità di 1 x 104 cellule in 2 pozzetti ciascuno (all-trans acido retinoico a 1 acido mol /l e clofibrico a 1 mmol /L concentrazioni finali sono stati aggiunti al mezzo per attivare i recettori dell'ormone nucleare RXR e PPAR, rispettivamente). Seme 293T-NE in 1 bene ad una densità di 1 x 104 cellule.
NOTA: Passaggio delle celle alla sottoconfluenza utilizzando 0,25% trypsin. Contare il numero di cella e quindi eseguire il seedo delle celle in una densità appropriata. - Incubare la cellula a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 in un'incubatrice umidificata per 24 h. Osservare le cellule dopo 24 h e procedere con l'infezione se le cellule sono sane.
- Preparare il complesso di infezione come indicato nella tabella 3, aggiungere HBV (HepG2.2.15 supernatant concentrate), DMSO, PEG8000 e infezione medio a 1,5 mL tubo di microcentrifuga. Preparare lo stock di CsA sciogliendolo in DMSO a una concentrazione di 5 mM e mantenere lo stock a -20 oC. La soluzione di lavoro di CsA è 5 M. Seme 1x104 celle per pozzo della piastra 48-bene. Aggiungere 100 L di Concentrato supernata 2.2.15 (contenente HBV 1.5063 x 107 GEq/mL) per infettare le cellule a 150 GEq/cella.
- Aggiungete 500 l del complesso di infezione in ogni pozzo e incubate le cellule a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 in incubatrice obibbificata per 24 h.
- Lavare le cellule due volte con 500 gradi di PBS prima di cambiare il mezzo. Aggiungere 1 mL del mezzo in ogni pozzo. Se lo stato della cella è scarso e alcune celle sono mobili, modificare direttamente il mezzo. Questo è il giorno 1 dell'infezione. Cambiare il mezzo delicatamente ogni 2 giorni.
- Il giorno 11, lavare le cellule due volte con 500 gradi l di PBS e fissare le cellule con metanolo freddo ghiaccio per l'immunofluorescenza.
6. Co-cultura HepG2.2.15 con HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE
- Aggiungere 1 mL/pozzetto di 0,1% di gelatina a 5 pozze di 6 pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 2 ore e scartare il supernatante. Incubare nuovamente la piastra per altri 2 h a 37 gradi centigradi per asciugare completamente il pozzo.
- Seme 1 x 105 cellule / podio di EpG-NE in 2 pozzi, 293T-NE-3NRs in 2 pozzi, e 293T-NE in 1 pozzetto della piastra. Seme 1 x 105 celle/po di HepG2.2.15 su cinque inserti a membrana (24 mm, diametro dei pori, senza strato) in una piastra 6 po separata. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 in un'incubatrice umidificata per 24 h.
- Dopo 24 h, se le cellule sono tutte aderenti e in buono stato, prepararsi per la co-coltura. Eliminare il mezzo negli inserti a 6 piastra e membrana cellulare. Posizionare gli inserti a membrana con HepG2.2.15 nella piastra 6 pozzo seminato con HepG-NE, 293T-NE-3NRs e 293T-NE da pinzette. Incubare la cellula a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 in un'incubatrice umidificata, cambiare il mezzo ogni 3-4 giorni.
NOTA: Impostare i gruppi come segue: Ben 1: 293T-NE co-cultura con HepG 2.2.15; 2: Co-cultura HepG2-NE con HepG 2.2.15; Bene 3: 293T-NE-3NRs co-cultura con HepG2.2.15; Pozzo 4: Co-cultura HepG2-NE con HepG 2.2.15 (aggiungi CsA); Bene 5: 293T-NE-3NRs co-cultura con HepG2.2.15 (aggiungi CsA); Aggiungere il mezzo completo al numero 1, 2 e 3, aggiungere il mezzo con 5 SM CsA al pozzo numero 4 e 5, circa 9 mL per ogni pozzo, assicurarsi che i supporti siano in contatto affinché le particelle di virus migrano dai transwell per infettare le cellule. - Dopo 10 giorni, rimuovere gli inserti a membrana, aggiungere PBS alla piastra 6 e lavare delicatamente due volte, fissare le cellule con il metanolo freddo ghiaccio per l'immunofluorescenza.
7. Eseguire l'immunofluorescenza per HBcAg
- Fissare le cellule con metanolo freddo ghiaccio a -20 gradi centigradi per più di 3 h. Scartare il metanolo. Lavare le celle con PBS per 10 min a temperatura ambiente su shaker, ripetere per 3 volte.
- Aggiungete il 5% di BSA (100 a 48 piani, 500 l/6-pozzetti), agitare sullo shaker orizzontale per 1 h a 40 giri e temperatura ambiente.
- Aggiungere la soluzione anticorpale primaria HBcAg (anticorpo primario: soluzione BSA del 5%: 1:200, 100 L / 48-well-plate, 500 l / 6-well-plate), agitare durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Lavare i pozzi con PBST (PBS con 0,1% tween 20), per 10 min a temperatura ambiente su shaker, ripetere per 3 volte.
- Aggiungere la seconda soluzione anticorpale (594 anticorpi etichettati sollevati nella capra contro il coniglio IgG: PBS - 1:1.000, 100 L /48-well-plate, 500 - L / 6-well-plate), coprire la piastra con un foglio e agitare per 2 h a temperatura ambiente.
- Lavare di nuovo con PBST per tre volte, agitare per 10 min ciascuno.
- Aggiungere 1 g/mL DAPI, agitare per 2 min. Lavare due volte con PBST su uno shaker per 5 min ciascuno. Eliminare PBST. Aggiungere PBS e osservare al microscopio immunofluorescenza.
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Representative Results
Abbiamo costruito pSIN-NTCP-EGFP plasmid esprimendo la fusione NTCP ed EGFP e con resistenza puromycina. Il plasmide è stato trasincato nelle cellule HepG2 e 293T per costruire linee cellulari stabili HepG2-NE e 293T-NE esprimendo NTCP ed EGFP. Plasmids (pSIN-HNF4, pSIN-RXR, pLV-PPAR-puro-flag) con resistenza ed espressione sono stati transinfettati in cellule 293T-NE per costruire una linea cellulare stabile che esprime 4 geni host9. L'espressione di NTCP-EGFP può essere osservata dalla fluorescenza verde e verificata da qPCR e western blot (dati non mostrati, ma vedi il lavoro precedente 9).
L'anticorpo primario di HBcAg e DAPI incubato con cellule fisse ha mostrato una colorazione distinta quando è stato osservato utilizzando un obiettivo 10x su un microscopio invertito fluorescente. La localizzazione nucleare è stata confermata dalla colorazione con DAPI(Figura 3 e Figura 4-la terza colonna). NTCP-EGFP è espresso sulla membrana cellulare e può essere individuato dalla fluorescenza verde(Figura 3 e Figura 4-la seconda colonna). I siti di espressione di HBcAg possono essere individuati in base alla fluorescenza rossa(Figura 3 e Figura 4-la prima colonna). Quando DAPI, NTCP e HBcAg si trovano nella stessa cella, significa che la cella è stata infettata correttamente con HBV (Figura 3 e Figura 4-l'ultima colonna).
Il gruppo CsA era il controllo negativo. CsA ha impedito all'HBV di entrare nelle celle bloccando NTCP. Come controllo positivo, le cellule HepG2-NTCP-EGFP infette possono esprimere HBcAg. HBcAg è stato rilevato in 293T-NE-3NRs cellule ma non in 293T-NE cellule, che indica NTCP non è l'unico fattore essenziale per l'infezione da HBV in 293T. L'immunofluorescenza delle cellule infettate da concentrato epG2.2.15 supernatale era la stessa di quella delle cellule co-coltivate con cellule HepG2.2.15. Ha mostrato che l'HBcAg è stato espresso in 293T-NE-3NRs e cellule HepG2-NE, questo suggerisce che i quattro geni dell'host (NTCP, HNF4, RXR e PPAR) facilitano l'infezione da HBV. Ma i segnali per HBcAg in 293T-NE-3NRs erano inferiori rispetto a HepG2-NE, indicando che l'infezione da HBV può essere influenzata anche da altri fattori ospiti.
| Riferimento quantitativo | Riferimento quantitativo | Riferimento quantitativo | Riferimento quantitativo | Controllo negativo | Controllo positivo HBV | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | Nessuno | 12.3865 |
| GEq/mL | N. 10/3 | N. 10/4 | N. 10/5 | N. 10/6 | —— | —— |
Tabella 1: valori Ct per i riferimenti Quantitativi.
| HepG 2.2.15 Supernatante |
1/20 EpG 2.2.15 Concentrarsi |
HepG 2.2.15 Concentrarsi |
|
| Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
| GEq/mL | 1,65 x 10, 4 | ORE5,53/5 | 1,5 x 10/7 |
Tabella 2: Valori Ct per il DNA HBV ottenuti da EpG2.2.15 supernatante. I valori rappresentano i valori Ct per il DNA HBV ottenuti dal supernatante originale, 1/20 di diluizione o il suo concentrato.
| 293T-NE | HepG2-NE | 293T-NE-3NRs | |||
| Hbv | Hbv | HBV-CsA (CsA) | Hbv | HBV-CsA (CsA) | |
| HBV GEq/cella | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| HBV (L) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CsA (5 M) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| DMSO -L | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
| 40 % PEG8000 LL | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Mezzo di infezione L | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
| Totale : L | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
Tabella 3: Complesso di infezioni. Il volume totale utilizzato è stato di 500. Ciclosporina A è stato utilizzato come controllo negativo.
Figura 1: Rappresentazione grafica del protocollo. HepG2.2.15 sono stati co-coltivati con 293T-NE-3NRs e l'infezione è stata osservata utilizzando la microscopia immunofluorescenza o il supernatante contenente particelle virali è stato concentrato e introdotto nelle cellule coltivate 293T-NE-3NRs. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: curva standard HBV calcolata dai valori Ct. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il concentrato supernata EpG2.2.15 è stato utilizzato per infettare le cellule 293T-NE, 293T-NE-3NRs e HepG2-NE con 150 GEq per cellula. Espressione HBcAg è stata identificata da un'espressione di immunofluorescenza. HBcAg è stato espresso in 293T-NE-3NRs e cellule HepG2-NE, mentre, nessuna espressione è stata osservata in queste cellule trattate con CsA (inibitore di ingresso HBV) e 293T-NE cellule. Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: 293T-NE, 293T-NE-3NRs e HepG2-NE co-coltivati con cellule HepG2.2.15. Espressione HBcAg è stata identificata da un'espressione di immunofluorescenza. HBcAg è stato espresso in 293T-NE-3NRs e cellule HepG2-NE, mentre, nessuna espressione è stata osservata in queste cellule trattate con CsA (inibitore di ingresso HBV) e 293T-NE cellule. Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, introduciamo protocolli per l'infezione da HBV in 293T-NE-3NR non epatici e cellule HepG2-NE basate sull'epatoma. 293T-NE-3NRs erano adatti per l'infezione da HBV sia ad alto che a basso GEq. I seguenti passaggi critici devono essere presi in considerazione durante l'utilizzo del nostro protocollo. Lo stato della cellula è un fattore importante per un'infezione di successo. Il mezzo di infezione deve essere cambiato tempestivamente dopo il periodo iniziale dell'infezione da HBV. Le cellule 293T-NE-3NRs sono tipicamente fragili a seguito dell'infezione con alti tipi virali. Pertanto, queste cellule devono essere lavate delicatamente per evitare di staccare le cellule dopo 24 h di infezione. Quando si utilizzano inserti di membrana per la coltura, dobbiamo assicurarci che la densità di semina iniziale sia appropriata e che la camera sia sufficientemente sommersa dai supporti per garantire un efficiente attaccamento delle particelle virali alle cellule 293T-NE-3NRs. Per rilevare HBcAg, dobbiamo lavare delicatamente le cellule prima della fissazione per evitare falsi segnali positivi. Attenzione deve essere presa durante la fase di lavaggio come le 293T cellule tendono a staccare dal basso.
Infettare 293T-NE-3NRs da HBV non è così facile come EpG2 che esprime NTCP. A differenza di HepG2, queste cellule sono facili da staccare dal fondo della piastra durante la coltura. E queste cellule sono più fragili di HepG2 dopo l'infezione utilizzando DMSO e PEG8000 o co-cultura con HepG2.2.15 per 10 giorni senza passare. Pertanto, abbiamo bisogno di rivestire la piastra di 0.1% gelatina e seme numero di cellulare appropriato nella piastra. Occorre prestare maggiore attenzione per evitare che le cellule si stacchino durante il cambiamento del mezzo, il lavaggio o il fissaggio delle cellule.
Rispetto ai tradizionali metodi di infezione da HBV, abbiamo adottato una linea cellulare 293T ingegnerizzata, 293T-NE-3NRs, come modello di infezione e co-coltivato con HepG2.2.15. È interessante notare che 293T-NE-3NRs cellule sono state infettate con successo con HBV anche a basso GEq che imita le condizioni fisiologiche naturali in modo più accurato. Modellare l'infezione da HBV in 293T-NE-3NRs è un complemento utile a quello tradizionale a causa dello sfondo non epatico di queste cellule. L'applicazione del metodo può aiutarci a identificare i nuovi fattori ospiti, anche se l'efficienza dell'infezione di questo metodo non è così alta come quella tradizionale. Crediamo che i modelli in vitro presentati in questo manoscritto contribuiranno a facilitare nuove scoperte nel campo.
Una limitazione a questo metodo è l'efficienza dell'infezione. L'infezione da HBV in vitro non è così facile come quella in vivo. Gli attuali modelli in vitro per HBV sono limitati a causa della loro scarsa suscettibilità all'infezione da HBV, dove sono necessari inocula estremamente elevati per avviare l'infezione e non vi è alcuna diffusione virale evidente10. Questo è in netto contrasto con le osservazioni in vivo in cui un singolo virione HBV può infettare una grande porzione di epatociti in poche settimane11,12. Pertanto, l'identificazione di nuovi fattori host che influiscono sulla replica HBV è molto utile per migliorare la nostra comprensione delle interazioni HBV e host. Inoltre, imitando lo sviluppo epatico o renale in vivo, possono essere generati organoidi funzionali che ricapitolerebbero più da vicino il funzionamento fisiologico di un fegato o di un rene umano13,14. Questo migliorerebbe notevolmente la nostra comprensione dell'infezione da HBV.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81870432 e 81570567 a X.L.) (da n. 81571994 a P.N.S.), Fondo di ricerca per giovani scienziati internazionali (n. 81950410640 a W.I.); La Li Ka Shing Shantou University Foundation (n. Da L1111 2008 a P.N.S.). Ringraziamo il prof.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
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