Summary
Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for hepatitt B-virus (HBV) infeksjon i nye konstruerte 293T-celler (293T-NE-3NRs, uttrykker menneskelig NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα) og tradisjonelle leverceller (HepG2-NE, uttrykker menneskelig NTCP).
Abstract
HBV infiserer hovedsakelig humane hepatocytter, men det har også blitt funnet å infisere ekstrahepatisk vev som nyre og testis. Likevel er cellebaserte HBV-modeller begrenset til hepatomacellelinjer (som HepG2 og Huh7) som overutså en funksjonell HBV-reseptor, natriumtaurocholate co-transport polypeptid (NTCP). Her brukte vi 293T-NE-3NRs (293T overexpressing human NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα) og HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) som modellcellelinjer. HBV-infeksjon i disse cellelinjene ble utført enten ved hjelp av konsentrerte HBV-viruspartikler fra HepG2.2.15 eller samtidig hepG2.2.15 med målcellelinjene. HBcAg immunofluorescens for HBcAg ble utført for å bekrefte HBV-infeksjon. De to metodene som presenteres her vil hjelpe oss med å studere HBV-infeksjon i ikke-levercellelinjer.
Introduction
Hepatitt B påvirker livene til mer enn 2 milliarder mennesker og er en av de store truslene mot folkehelsen. Omtrent 257 millioner mennesker er kronisk smittet med hepatitt B-virus (HBV) over hele verden, noe som forårsaker en stor byrde for samfunnet1. Hepatocytter er ikke de eneste cellene som er infisert av HBV og andre celler i ikke-levervev, som nyre og testis, er også smittet av dette viruset2,3. For tiden er HBV infeksjoncellemodeller begrenset til humane hepatocytter med bare få ikke-levercellelinjemodeller. Dette hindrer studien av HBV-infeksjon og HBV-relatert patologi av ikke-levervev. Her presenterer vi protokoller for å studere HBV-infeksjon i ikke-lever-293T-celler, så vel som i hepatomabaserte celler.
Natriumtaurolitt samtidig transport av polypeptid (NTCP) er en funksjonell reseptor for human hepatitt B og hepatitt D-virus4. Hepatocyt kjernefaktor 4α (HNF4α), retinoid X reseptor α (RXRα) og peroksisom proliferator-aktivert reseptor α (PPARα) er leverberikede transkripsjonsfaktorer som begrenser viral tropisme av HBV. De har blitt verifisert for å fremme HBV pregenomic RNA syntese og støtte HBV replikering i en nonhepatoma celle linje5. Vi konstruerte tre forskjellige cellelinjer, HepG2-cellelinjer som uttrykte NTCP (HepG2-NE), 293T cellelinje som uttrykker NTCP (293T-NE) og 293T cellelinje som uttrykker fire vertsgener; NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα (293T-NE-3NR). To metoder for HBV-infeksjon ble utviklet basert på 293T-NE-3NRs (figur 1). Den første metoden bruker inokulasjon i 293T-NE-3NRs med høy viral genom ekvivalens (høy GEq (150), DMSO og PEG8000) for 24 timer. Den andre metoden benytter co-culturing 293T-NE-3NRs med HepG2.2.15, som kan produsere HBV partikler (lav GEq (ca 1,83) uten DMSO og PEG8000), og dermed tett emulere naturlige forhold.
HepG2.2.15 celler er avledet fra HepG2-linjen og kronisk utskiller smittsomme HBV, samt subvirale partikler i kulturmediet6,7. Cyklosporin A (CsA) er et immunsuppressivt middel som er klinisk brukt til undertrykkelse av xenograft-avvisning. Studier har vist at CsA hemmer HBV-inntreden i kultiverte hepatocytter ved å hemme transportøraktiviteten til NTCP og blokkere bindingen av NTCP til store konvoluttproteiner8.
HepG2-NE-celler ble brukt som positiv kontroll, mens CsA-behandlede celler ble brukt som negativ kontroll. Ved å sammenligne med de positive og negative kontrollgruppene, kan vi finne ut hvilke vertsgener som spiller en kritisk rolle i HBV-infeksjon. I tillegg, gjennom denne modusen for HBV-infeksjon, kan vi også finne andre nye mekanismer eller vertsgener involvert i HBV-infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kultur, samling av supernatanter fra HepG2.2.15 celler og HBV-infeksjon bør utføres i biosikkerhetsnivå II (P2) eller biosikkerhetsnivå III (P3) laboratorium i henhold til biosikkerhetsveiledningen i landet. Laboratoriesikkerhetspraksis bør følges for å sikre sikkerheten til laboratoriepersonell, og alle bør vaksineres og oppdages HBsAb positivt før de utfører HBV-eksperimenter. Følg tilstanden til cellene på hvert trinn før du går videre til neste trinn. Human serum prøver ble brukt i samsvar med godkjenning innhentet av Institutional Review Board of Shantou University Medical College.
1. HepG2.2.15 celle kultur
MERK: HepG2.2.15 cellesupernatant, HepG2.2.15 celle supernatant konsentrat og alle tips, flasker, plater og rør som kommer i kontakt med HepG2.2.15 bør kastes etter å ha blitt gjennomvåt i 2% virucide over natten.
- Fjern hetteglasset som inneholder HepG2.2.15-celler fra flytende nitrogen og tin ved å forsiktig virvle hetteglasset i et vannbad på 37 °C.
MERK: For å redusere muligheten for kontaminering, hold hetten ute av vannet. Tining bør være rask (ca. 2 min). - Fjern hetteglasset fra vannbadet så snart cellene tines og desinfiserer det med 70% etanol.
MERK: Fra dette punktet utfører du alle trinnene under strenge aseptiske forhold. - Overfør cellene til en 25 cm2 vevskulturflaske og tilsett 4 ml komplett kulturmedium (DMEM inneholder 10 % FBS, penicillin 100 E/ml, streptomycin 0,1 mg/ml). Inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5 % CO2.
2. Samling av HepG2.2.15 celle kultur supernatant
- Kultur HepG2.2.15 celle i T25 kolber ved 37 °C, 5% CO2 i en fuktet inkubator. Endre mediet hver tredje dag.
- Samle cellen supernatant i en 50 ml sentrifuge rør. Lukk lokket godt og pakk det med en parafinfilm.
- Oppbevar HepG2.2.15 supernatant ved -20 °C for å holde HBV-viruset aktivt.
3. Konsentrere HepG2.2.15 supernatant
- Fjern HepG2.2.15 supernatant fra -20 °C og tine ved 4 °C.
- For å fjerne cellefragmentene, filtrer HepG2.2.15 supernatant med en 0,45 μm membran til et nytt 50 ml sentrifugerør. Først blokkerer du filteret ved å filtrere 10 ml DMEM med 10% FBS før filtrering av viruset, og filtrer deretter cellekulturen supernatant.
- Tilsett 14 ml filtrert supernatant i en viruskonsentratorkolonne og lukk lokket. Sentrifuger kolonnen ved 3200 x g i 35 min i en horisontal roterende sentrifuge. Samle HepG2.2.15 supernatant konsentrat (ca 200 μL) i et 1,5 ml rør.
- Vask kolonnen med DMEM én gang ved å legge til 200 μL DMEM og samle den inn i et 1,5 ml rør.
4. Påvisning av HBV DNA i supernatant konsentrat
- Slå på tørrblokkvarmeren og sett temperaturen på 100 °C.
- For å sikre at konsentrasjonen av HBV DNA i HepG2.2.15 supernatantkonsentratet er innenfor standard kurveområdet, fortynn konsentratet 20 ganger ved å tilsette 10 μL HepG2.2.15 supernatant konsentrat til 190 μL DMEM i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsett 200 μL HepG2.2.15 supernatant, negativ kontroll (HBV-negativ serum fra sunn donor), HBV positiv kontroll (HBV-positiv serum fra HBV-pasient) og fire fortynninger av de kvantitative referansene som er gitt i settet (2.0 x 106, henholdsvis 2,0 x 105, 2,0 x 104, 2,0 x 103 GEq /ml), for å skille 1,5 ml mikrosyblyrør.
- Tilsett 450 μL HBV DNA-ekstraksjonsbuffer fra settet til alle de ovennevnte 1,5 ml rørene, vortex i 15 s og spinn ned i 10 s. Inkuber ved 100 °C i 100 min i tørrblokkvarmer. Sentrifuge ved 12, 000 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Tilsett 27 μL PCR master mix og 3 μL Taq polymerase enzym til PCR rør plassert på is.
MERK: PCR-hovedmiks som følger med i settet inneholder primere mot det bevarte området hbv DNA. - Tilsett 20 μL sentrifugert supernatant væske til PCR-rørene som er plassert på is. Dekk tett og spinn ned i 10 s.
- Bruk følgende forhold på en PCR-maskin i sanntid: 93 °C i 2 min, 10 sykluser på 93 °C i 45 s etterfulgt av 55 °C i 60 s; deretter 30 sykluser på 93 °C i 30 s etterfulgt av 55 °C i 45 s for å utføre PCR i sanntid.
MERK: Hovedmiksen som følger med i det kommersielle settet har primere mot den bevarte regionen HBV DNA. - Eksporter ct-verdiene som er oppnådd, og generer en standardkurve som vist i tabell 1 og figur 2.
- Basert på standardkurven beregner du HBV DNA-konsentrasjonen av HepG2.2.15 supernatant konsentrat fortynnet 20x som vist i tabell 2. Beregn HBV DNA-konsentrasjonen av HepG2.2.15 supernatantkonsentrat (tabell 2).
- Del HepG2.2.15 supernatantkonsentrat i aliquots og oppbevar ved -80 °C til bruk.
5. In vitro infeksjon av HepG2-NE og 293T-NE-3NRs celler
- Forbered følgende infeksjonsmedium i DMEM/F-12: 10 % FBS, 4 mM glutamin supplement, 0,1 mM NEAA, 1 mM Natriumpyuvat, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 1 μg/ml puromycin, 40 ng/ml deksametason, 20 μg/ml hydrokortison og 5 μg/ml insulin. Oppbevars ved 4 °C.
MERK: Disse NTCP-positive cellene er puromycinresistente9. - Tilsett 0,1% gelatin til 5 brønnplater, 200 μL til hver brønn. Inkuber platen ved 37 °C i 2 timer, kast supernatanten. Inkuber platen ved 37 °C i ytterligere 2 timer.
- Seed HepG2-NE med en tetthet på 1 x 104 celler i 2 brønner hver. Frø 293T-NE-3NRs celler med en tetthet på 1 x 104 celler i 2 brønner hver (all-trans retinsyre ved 1 μmol / L og clofibric syre ved 1 mmol / L endelige konsentrasjoner ble lagt til mediet for å aktivere RXRα og PPARα kjernefysiske hormonreseptorer, henholdsvis). Seed 293T-NE i 1 brønn med en tetthet på 1 x 104 celler.
MERK: Passer cellene ved sub-samløpet ved hjelp av 0,25% trypsin. Telle cellenummeret og deretter frø cellene til en passende tetthet. - Inkuber cellen ved 37 °C, 5 % CO2 i en fuktet inkubator i 24 timer. Følg cellene etter 24 timer og fortsett med infeksjon hvis cellene er friske.
- Forbered infeksjonskomplekset som nevnt i tabell 3, tilsett HBV (HepG2.2.15 supernatant konsentrat), DMSO, PEG8000 og infeksjonsmedium til 1,5 ml mikrocentrifugerør. Forbered CsA lager ved å oppløse den i DMSO til en konsentrasjon på 5 mM og holde aksjen på -20 ºC. Arbeidsløsningen til CsA er 5 μM. Seed 1 × 104 celler per brønn av 48-brønnplaten. Tilsett 100 μL HepG2.2.15 supernatantkonsentrat (som inneholder HBV 1.5063 ×107 GEq/ml) for å infisere celler ved 150 GEq/celle.
- Tilsett 500 μL av infeksjonskomplekset til hver brønn og inkuber cellene ved 37 °C, 5 % CO2 i fuktet inkubator i 24 timer.
- Vask cellene to ganger med 500 μL PBS før du endrer mediet. Tilsett 1 ml av mediet i hver brønn. Hvis celletilstanden er dårlig og noen celler flyter, endrer du mediet direkte. Dette er dag 1 av infeksjon. Bytt mediet forsiktig annenhver dag.
- På dag 11, vask cellene to ganger med 500 μL PBS og fest cellene med iskald metanol for immunfluorescens.
6. HepG2.2.15 co-kultur med HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE
- Tilsett 1 ml/brønn på 0,1 % gelatin til 5 brønner med 6 brønnplater. Inkuber platen ved 37 °C i 2 timer og kast supernatanten. Inkuber platen igjen i ytterligere 2 timer ved 37 °C for å tørke brønnen helt.
- Frø 1 x 10 5 celler /brønn av HepG-NE i 2 brønner, 293T-NE-3NRs i 2 brønner, og 293T-NE i 1 brønn av platen. Frø 1 x10 5 celler / brønn av HepG2.2.15 på fem membraninnlegg (24 mm, 0,4 μm porediameter, ubestrøket) i en separat 6-brønnplate. Inkuber cellene ved 37 °C, 5 % CO2 i en fuktet inkubator i 24 timer.
- Etter 24 timer, hvis cellene er alle tilhenger og i god tilstand, forberede seg på co-kultur. Kast mediet i 6-brønnplate- og cellemembraninnleggene. Plasser membraneinnsatsene med HepG2.2.15 i 6 brønnplaten seeded med HepG-NE, 293T-NE-3NRs og 293T-NE av pinsett. Inkuber cellen ved 37 °C, 5 % CO2 i en fuktet inkubator, endre mediet hver 3-4.
MERK: Sett grupper som følger: Brønn 1: 293T-NE co-kultur med HepG 2.2.15; Vel 2: HepG2-NE co-kultur med HepG 2.2.15; Vel 3: 293T-NE-3NRs co-kultur med HepG2.2.15; Vel 4: HepG2-NE co-kultur med HepG 2.2.15 (legge CsA); Vel 5: 293T-NE-3NRs co-kultur med HepG2.2.15 (legge CsA); Legg til hele mediet til brønn nummer 1, 2 og 3, legg til mediet med 5 μM CsA til godt nummer 4 og 5 godt, ca 9 ml for hver brønn, sørg for at mediet er i kontakt for at viruspartikler skal migrere fra transbrønner for å infisere celler. - Etter 10 dager, fjern membraninnleggene, tilsett PBS til 6-brønnplaten og vask forsiktig to ganger, fest cellene med iskald metanol for immunfluorescens.
7. Utfør immunofluorescens for HBcAg
- Fest cellene med iskald metanol ved -20 °C i mer enn 3 timer. Kast metanol. Vask cellene med PBS i 10 min ved romtemperatur på shaker, gjenta i 3 ganger.
- Tilsett 5% BSA (100 μL/48-brønnplate, 500 μL/6-brønnplate), rist på horisontal shaker i 1 t ved 40 rpm og romtemperatur.
- Tilsett HBcAg primær antistoffoppløsning (primært antistoff: 5% BSA-løsning =1:200, 100 μL / 48-brønnplate, 500 μL / 6-brønnplate), rist over natten ved 4 °C.
- Vask brønner med PBST (PBS med 0,1% tween 20), i 10 min ved romtemperatur på shaker, gjenta i 3 ganger.
- Tilsett den andre antistoffoppløsningen (594 merket antistoff hevet i geit mot kanin IgG: PBS = 1:1,000, 100 μL /48-well-plate, 500 μL / 6-brønnplate), dekk platen med folie og rist i 2 timer ved romtemperatur.
- Vask igjen med PBST i tre ganger, rist i 10 min hver.
- Tilsett 1 μg/ml DAPI, rist i 2 min. Vask to ganger med PBST på en shaker i 5 min hver. Kast PBST. Tilsett PBS og observere under immunfluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi konstruerte pSIN-NTCP-EGFP plasmid som uttrykte NTCP- og EGFP-fusjon og med puromycinresistens. Plasmid ble transfected inn i HepG2 og 293T celler for å konstruere stabile cellelinjer HepG2-NE og 293T-NE uttrykker NTCP og EGFP. Plasmids (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-flagg) med puromycin resistens og uttrykk ble transfected inn i 293T-NE-celler for å konstruere en stabil cellelinje som uttrykker 4 vertsgener9. Uttrykket for NTCP-EGFP kan observeres ved grønn fluorescens, og verifisert av qPCR og western blot (data ikke vist, men se tidligere arbeid 9).
Primær antistoff av HBcAg og DAPI inkubert med faste celler viste en tydelig farging ved bruk av 10x mål på et fluorescerende invertert mikroskop. Kjernefarging ble bekreftet ved farging med DAPI (figur 3 og figur 4-den tredje kolonnen). NTCP-EGFP uttrykkes på cellemembranen og kan plasseres av den grønne fluorescensen (figur 3 og figur 4-den andre kolonnen). Uttrykksområdene til HBcAg kan plasseres etter rød fluorescens (figur 3 og figur 4-den første kolonnen). Når DAPI, NTCP og HBcAg er i samme celle, betyr det at cellen er infisert med HBV (figur 3 og figur 4-den siste kolonnen).
CsA-gruppen var den negative kontrollen. CsA forhindret HBV fra å komme inn i celler ved å blokkere NTCP. Som en positiv kontroll kan infiserte HepG2-NTCP-EGFP-celler uttrykke HBcAg. HBcAg ble påvist i 293T-NE-3NRs celler, men ikke i 293T-NE-celler, noe som indikerer NTCP er ikke den eneste faktoren som er avgjørende for HBV-infeksjon i 293T. Immunofluorescensen av celler infisert med HepG2.2.15 supernatant konsentrat var det samme som for celler som er co-dyrket med HepG2.2.15 celle. Det viste at HBcAg ble uttrykt i 293T-NE-3NRs og HepG2-NE celler, dette tyder på at de fire vertsgenene (NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα) letter HBV infeksjon. Men signaler for HBcAg i 293T-NE-3NRs var lavere sammenlignet med HepG2-NE, noe som indikerer HBV infeksjon kan også påvirkes av andre vertsfaktorer.
| Kvantitativ referanse | Kvantitativ referanse | Kvantitativ referanse | Kvantitativ referanse | Negativ kontroll | HBV positiv kontroll | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | Ingen | 12.3865 |
| GEq/ml | 2*10^3 | 2*10^4 | 2*10^5 | 2*10^6 | —— | —— |
Tabell 1: Ct-verdier for kvantitative referanser.
| HepG 2.2.15 supernatant |
1/20 HepG 2.2.15 Konsentrere seg |
HepG 2.2.15 Konsentrere seg |
|
| Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
| GEq/ml | 1.65*10^4 | 7.53*10^5 | 1.5*10^7 |
Tabell 2: Ct-verdier for HBV DNA hentet fra HepG2.2.15 supernatant. Verdier representerer CT-verdier for HBV DNA hentet fra original supernatant, 1/20 fortynning eller konsentrat.
| 293T-NE (andre) | HepG2-NE (andre) | 293T-NE-3NRs (andre) | |||
| Hbv | Hbv | HBV+CsA | Hbv | HBV+CsA | |
| HBV GEq/celle | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| HBV μL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CsA μL (5 μM) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| DMSO μL | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
| 40 % PEG8000 μL | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Infeksjon medium μL | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
| Totalt μL | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
Tabell 3: Infeksjonskompleks. Det totale volumet som ble brukt var 500 μL. Ciklosporin A ble brukt som negativ kontroll.
Figur 1: En grafisk representasjon av protokollen. HepG2.2.15 var enten co-dyrket med 293T-NE-3NRs og infeksjon ble observert ved hjelp av immunofluorescensmikroskopi eller supernatanten som inneholder viruspartikler ble konsentrert og introdusert i 293T-NE-3NRs kultiverte celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: HBV standardkurve beregnet fra Ct-verdiene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: HepG2.2.15 supernatant konsentrat ble brukt til å infisere 293T-NE, 293T-NE-3NRs og HepG2-NE-celler med 150 GEq per celle. HBcAg-uttrykket ble identifisert av immunofluorescensanalyse. HBcAg ble uttrykt i 293T-NE-3NRs og HepG2-NE celler, mens ingen uttrykk ble observert i disse cellene behandlet med CsA (HBV entry inhibitor) og 293T-NE celler. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: 293T-NE, 293T-NE-3NRs og HepG2-NE co-dyrket med HepG2.2.15 celler. HBcAg-uttrykket ble identifisert av immunofluorescensanalyse. HBcAg ble uttrykt i 293T-NE-3NRs og HepG2-NE celler, mens ingen uttrykk ble observert i disse cellene behandlet med CsA (HBV entry inhibitor) og 293T-NE celler. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introduserer vi protokoller for HBV-infeksjon i ikke-hepatiske 293T-NE-3NRs og hepatomabaserte HepG2-NE-celler. 293T-NE-3NRs var egnet for HBV-infeksjon ved både høy og lav GEq. Følgende kritiske tiltak må tas i betraktning mens du bruker protokollen vår. Cellestatusen er en viktig faktor for en vellykket infeksjon. Infeksjonsmediet må endres i tide etter den første perioden med HBV-infeksjon. 293T-NE-3NRs celler er vanligvis skjøre etter infeksjon med høye virale titers. Derfor må disse cellene vaskes forsiktig for å unngå å løsne cellene etter 24 timers infeksjon. Når du bruker membraninnlegg for kultur, må vi sørge for at den første såingstettheten er hensiktsmessig, og kammeret er tilstrekkelig nedsenket i media for å sikre effektiv feste av viruspartikler til 293T-NE-3NRs-cellene. For å oppdage HBcAg må vi vaske cellene forsiktig før fiksering for å unngå falske positive signaler. Det må utvises forsiktighet under vasketrinnet, da 293T-cellene har en tendens til å løsne fra bunnen.
Infisere 293T-NE-3NRs av HBV er ikke så lett som NTCP-uttrykkende HepG2. I motsetning til HepG2 er disse cellene enkle å løsne fra bunnen av platen under kulturen. Og disse cellene er mer skjøre enn HepG2 etter infeksjon ved hjelp av DMSO og PEG8000 eller co-kultur med HepG2.2.15 for 10 dager uten passaging. Derfor må vi belegge platen med 0,1% gelatin og frø passende cellenummer i platen. Mer forsiktighet bør tas for å hindre at cellene løsner under endring av mediet, vasker eller fester cellene.
Sammenlignet med tradisjonelle HBV infeksjonsmetoder, vedtok vi en konstruert 293T cellelinje, 293T-NE-3NRs, som infeksjonsmodell og co-dyrket den med HepG2.2.15. Interessant, 293T-NE-3NRs celler ble vellykket infisert med HBV selv ved lav GEq som etterligner naturlige fysiologiske forhold mer nøyaktig. Modellering HBV infeksjon i 293T-NE-3NRs er et nyttig supplement til den tradisjonelle på grunn av nonhepatic bakgrunn av disse cellene. Anvendelse av metoden kan hjelpe oss med å identifisere de nye vertsfaktorene, selv om infeksjonseffektiviteten til denne metoden ikke er så høy som den tradisjonelle. Vi tror at in vitro-modellene som presenteres i dette manuskriptet, vil bidra til å legge til rette for nye funn på feltet.
En begrensning til denne metoden er infeksjonseffektiviteten. In vitro HBV-infeksjonen er ikke så lett som in vivo. Nåværende in vitro modeller for HBV er begrenset på grunn av deres dårlige mottakelighet for HBV infeksjon, der ekstremt høy inocula er nødvendig for å initiere infeksjon og det er ingen åpenbar viral spredning10. Dette står i sterk kontrast til in vivo observasjoner der en enkelt HBV virion kan infisere en stor del av hepatocytter i bare uker11,12. Dermed er identifisering av nye vertsfaktorer som påvirker HBV-replikering svært gunstig for å fremme vår forståelse av HBV og vertsinteraksjoner. Videre, ved å etterligne in vivo lever- eller nyreutvikling, funksjonelle organoider kan genereres som ville nærmere rekapitulere fysiologisk funksjon av en menneskelig lever eller nyre13,14. Dette vil i stor grad forbedre vår forståelse av HBV-infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 81870432 og 81570567 til X.L.Z.), (nr. 81571994 til P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (nr. 81950410640 til W.I.); Stiftelsen Li Ka Shing Shantou University (nr. L1111 2008 til P.N.S.). Vi vil gjerne takke prof. Stanley Lin fra Shantou University Medical College for nyttige råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
