Summary
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV) em novas células 293T (293T-NE-3NRs, expressando NTCP humano, HNF4α, RXRα e PPARα) e células hepáticas tradicionais (HepG2-NE, expressando NTCP humano).
Abstract
O HBV infecta principalmente hepatócitos humanos, mas também foi encontrado para infectar tecidos extraháticos, como rim e testíase. No entanto, os modelos de HBV baseados em células estão limitados a linhas celulares hepatoma (como HepG2 e Huh7) superexpressando um receptor HBV funcional, polipeptídeo de taurocolato de sódio (NTCP). Aqui, usamos 293T-NE-3NRs (293T superexpressando NTCP humano, HNF4α, RXRα e PPARα) e HepG2-NE (HepG2 superexpressando NTCP) como linhas de célula modelo. A infecção por HBV nessas linhas celulares foi realizada utilizando partículas concentradas do vírus HBV de HepG2.2.15 ou co-culminando hepG2.2.15 com as linhas celulares-alvo. A imunofluorescência HBcAg para HBcAg foi realizada para confirmar a infecção pelo HBV. Os dois métodos aqui apresentados nos ajudarão a estudar a infecção pelo HBV em linhas celulares não hepáticas.
Introduction
A hepatite B afeta a vida de mais de 2 bilhões de pessoas e é uma das maiores ameaças à saúde pública. Aproximadamente 257 milhões de pessoas estão cronicamente infectadas com o vírus da hepatite B (HBV) em todo o mundo, causando um grande fardo para a sociedade1. Os hepatócitos não são as únicas células infectadas pelo HBV e outras células em tecido não hepático, como rim e testíase, também são infectados por este vírus2,,3. Atualmente, os modelos de células de infecção por HBV estão limitados a hepatócitos humanos com apenas poucos modelos de linha celular não hepática. Isso dificulta o estudo da infecção por HBV e da patologia relacionada ao HBV de tecidos não hepáticos. Aqui apresentamos protocolos para estudar a infecção por HBV em células 293T não hepáticas, bem como em células baseadas em hepatoma.
O polipeptídeo de co-transporte de taurocolato de sódio (NTCP) é um receptor funcional para hepatite B humana e vírus da hepatite D4. Fator nuclear hepatocito 4α (HNF4α), receptor X retinóide α (RXRα) e receptor ativado por proliferador peroxiso α (PPARα) são fatores de transcrição enriquecidos pelo fígado que restringem o tropismo viral do HBV. Eles foram verificados para promover a síntese de RNA pregenomic HBV e apoiar a replicação do HBV em uma linha celular não hepatoma5. Construímos três linhas celulares diferentes, linhas celulares HepG2 expressando NTCP (HepG2-NE), linha celular 293T expressando linha NTCP (293T-NE) e linha celular 293T expressando quatro genes hospedeiros; NTCP, HNF4α, RXRα e PPARα (293T-NE-3NRs). Dois métodos para infecção por HBV foram desenvolvidos com base em 293T-NE-3NRs(Figura 1). O primeiro método utiliza a inoculação em 293T-NE-3NRs com alta equivalência do genoma viral (GEq alto (150), DMSO e PEG8000) por 24 h. O segundo método emprega co-cultivar 293T-NE-3NRs com HepG2.2.15, que podem produzir partículas HBV (baixo GEq (cerca de 1,83) sem DMSO e PEG8000), assim emulando de perto as condições naturais.
As células hepG2.2.15 são derivadas da linha HepG2 e secretam cronicamente o HBV infeccioso, bem como partículas subvirais no meio da cultura6,,7. Ciclosporina A (CsA) é um imunossupressor clinicamente utilizado para a supressão da rejeição de xenoenxerto. Estudos têm demonstrado que a CSA inibe a entrada de HBV em hepatócitos cultivados inibindo a atividade de transporte do NTCP e bloqueando a vinculação do NTCP às grandes proteínas envelope8.
As células hepG2-NE foram utilizadas como controle positivo, enquanto as células tratadas com CIA foram utilizadas como controle negativo. Comparando-se com os grupos de controle positivos e negativos, podemos descobrir quais genes hospedeiros desempenham um papel crítico na infecção pelo HBV. Além disso, através deste modo de infecção por HBV, também podemos encontrar outros novos mecanismos ou genes de hospedagem envolvidos na infecção pelo HBV.
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Protocol
Cultura, coleta de supernacantes de células HepG2.2.15 e infecção por HBV devem ser realizadas no laboratório de biossegurança II (P2) ou biossegurança III (P3) de acordo com a orientação de biossegurança no país. As práticas de segurança laboratorial devem ser seguidas para garantir a segurança do pessoal do laboratório, e todos devem ser vacinados e detectados HBsAb positivo antes de realizar experimentos de HBV. Observe o estado das células a cada passo antes de prosseguir para o próximo passo. As amostras de soro humano foram utilizadas de acordo com a aprovação obtida pelo Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou.
1. HepG2.2.15 cultura celular
NOTA: Supernaca de células HepG2.2.15, concentrado supernacante de células HepG2.2.15 e todas as pontas, frascos, placas e tubos que entram em contato com HepG2.2.15 devem ser descartados após serem encharcados em 2% de virucida durante a noite.
- Remova o frasco contendo células HepG2.2.15 de nitrogênio líquido e descongele suavemente o frasco em um banho de água de 37 °C.
NOTA: Para reduzir a possibilidade de contaminação, mantenha a tampa fora da água. O degelo deve ser rápido (aproximadamente 2 min). - Retire o frasco do banho de água assim que as células forem descongeladas e desinfetá-lo com 70% de etanol.
NOTA: A partir deste ponto, execute todas as etapas sob estritas condições assépticas. - Transfira as células para um frasco de cultura tecidual de25 cm 2 e adicione 4 mL de meio de cultura completa (DMEM contendo 10% FBS, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 0,1 mg/mL). Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
2. Coleção de HepG2.2.15 cultura celular supernadante
- Cultura HepG2.2.15 célula em frascos T25 a 37 °C, 5% CO2 em uma incubadora umidificada. Troque o meio a cada 3 dias.
- Colete a célula supernante em um tubo de centrífuga de 50 mL. Feche a tampa com firmeza e enrole-a com um filme de parafina.
- Armazene o supernanato HepG2.2.15 a -20 °C para manter o vírus HBV ativo.
3. Concentrando HepG2.2.15 supernadante
- Remova hepG2.2.15 supernadante de -20 °C e descongele a 4 °C.
- Para remover os fragmentos celulares, filtre o supernatante HepG2.2.15 com uma membrana de 0,45 μm para um novo tubo de centrífuga de 50 mL. Primeiro, bloqueie o filtro filtrando 10 mL de DMEM com 10% de FBS antes de filtrar o vírus e, em seguida, filtrar a cultura celular sobrenatante.
- Adicione 14 mL de supernascido filtrado a uma coluna concentradora de vírus e feche a tampa. Centrifugar a coluna a 3.200 x g por 35 min em uma centrífuga giratória horizontal. Colete o concentrado de supernasal HepG2.2.15 (cerca de 200 μL) em um tubo de 1,5 mL.
- Lave a coluna com DMEM uma vez adicionando 200 μL de DMEM e colete-a em um tubo de 1,5 mL.
4. Detecção de DNA HBV em concentrado supernante
- Ligue o aquecedor do bloco seco e afina a temperatura para 100 °C.
- Para garantir que a concentração de DNA HBV no concentrado supernacido HepG2.2.15 esteja dentro da faixa de curva padrão, diluir o concentrado 20 vezes adicionando 10 μL de concentrado supernacante HepG2.2.15 a 190 μL de DMEM em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 200 μL de HepG2.2.15 supernante, controle negativo (soro HBV-negativo de doador saudável), controle positivo hbv (soro HBV positivo do paciente HBV) e quatro diluições das referências quantitativas fornecidas no kit (2..2.0 x 106, 2.0 x 105, 2.0 x 104, 2.0 x 103 GEq /mL), respectivamente para separar tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL.
- Adicione 450 μL de tampão de extração de DNA HBV do kit a todos os oito tubos acima de 1,5 mL, vórtice para 15 s e gire para baixo por 10 s. Incubar a 100 °C por 10 minutos no aquecedor de bloco seco. Centrifugar a 12.000 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Adicione 27 μL de mix mestre PCR e 3 μL de enzima de polimerase Taq aos tubos PCR colocados no gelo.
NOTA: A mistura mestre pcr fornecida no kit contém os primers contra a região conservada do DNA HBV. - Adicione 20 μL de líquido supernante centrifusado aos tubos PCR colocados no gelo. Cubra bem e gire para baixo por 10 s.
- Use as seguintes condições em uma máquina PCR em tempo real: 93 °C para 2 min, 10 ciclos de 93 °C para 45 s seguido de 55 °C para 60 s; em seguida, 30 ciclos de 93 °C para 30 s seguido de 55 °C para 45 s para realizar PCR em tempo real.
NOTA: O mix mestre fornecido no kit comercial possui primers contra a região conservada do DNA HBV. - Exporte os valores de TC obtidos e gere uma curva padrão, conforme mostrado na Tabela 1 e Figura 2.
- Com base na curva padrão, calcule a concentração de DNA HBV de Concentrado de sobrenasciante HepG2.2.15 diluído 20x como mostrado na Tabela 2. Calcule a concentração de DNA HBV de concentrado supernante HepG2.2.15(Tabela 2).
- Divida o concentrado de supernasteante HepG2.2.15 em alíquotas e armazene a -80 °C até usar.
5. Infecção in vitro de células HepG2-NE e 293T-NE-3NRs
- Prepare o seguinte meio de infecção no DMEM/F-12: 10% FBS, suplemento de glutamina de 4 mM, 0,1 mM NEAA, 1 mM piruvato de sódio, penicilina U/mL, 100 μg/mL streptomicina, 1 μg/mL puramicina, 40 ng/mL dexametasona, 20 μg/mL hidrocortisona e 5 μg/mL insulina. Armazenar a 4 °C.
NOTA: Estas células positivas NTCP são resistentes à puramicina9. - Adicione 0,1% de gelatina a 5 poços de 48 bem-placas, 200 μL a cada poço. Incubar a placa a 37 °C por 2h, descartar o supernaspeso. Incubar a placa a 37 °C por mais 2 h.
- Seed HepG2-NE a uma densidade de 1 x 104 células em 2 poços cada. Sementes 293T-NE-3NRs células a uma densidade de 1 x 104 células em 2 poços cada (ácido retinóico totalmente trans a 1 μmol/L e ácido clofibric a 1 mmol/L concentrações finais foram adicionadas ao meio para ativar os receptores hormonais nucleares RXRα e PPARα, respectivamente). Semente 293T-NE em 1 bem a uma densidade de 1 x 104 células.
NOTA: Passar as células em subconfluência usando trippsina de 0,25%. Conte o número da célula e depois semee as células para uma densidade apropriada. - Incubar a célula a 37 °C, 5% de CO2 em uma incubadora umidificada por 24 h. Observe as células após 24 h e proceda com infecção se as células estiverem saudáveis.
- Prepare o complexo de infecção mencionado na Tabela 3, adicione HBV (concentrado supernacante HepG2.2.15), DMSO, PEG8000 e tubo de infecção médio a 1,5 mL de microcentrifusagem. Prepare o estoque da CsA dissolvendo-o em DMSO para uma concentração de 5 mM e mantenha o estoque em -20 ºC. A solução de trabalho do CsA é de 5 μM. Semente 1×104 células por poço da placa de 48 poços. Adicione 100 μL de concentrado supernante HepG2.2.15 (contendo HBV 1.5063 ×107 GEq/mL) para infectar células a 150 GEq/célula.
- Adicione 500 μL do complexo de infecção a cada poço e incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 na incubadora umidificada por 24 h.
- Lave as células duas vezes com 500 μL de PBS antes de mudar o meio. Adicione 1 mL do meio em cada poço. Se o estado celular é ruim e algumas células estão flutuando, mude o meio diretamente. Este é o primeiro dia de infecção. Troque o meio suavemente a cada 2 dias.
- No dia 11, lave as células duas vezes com 500 μL de PBS e fixe as células com metanol gelado para imunofluorescência.
6. HepG2.2.15 co-cultura com HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE
- Adicione 1 mL/poço de 0,1% de gelatina a 5 poços de 6 bem-pratos. Incubar a placa a 37 °C por 2h e descartar o supernaspeso. Incubar a placa novamente por mais 2h a 37 °C para secar completamente o poço.
- Semente 1 x 105 células/poço de HepG-NE em 2 poços, 293T-NE-3NRs em 2 poços, e 293T-NE em 1 poço da placa. Semente 1 x 105 células/poço de HepG2.2.15 em cinco pastilhas de membrana (24 mm, 0,4 μm de diâmetro de poros, sem revestimento) em uma placa de 6 poços separada. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 em uma incubadora umidificada por 24 h.
- Depois das 24h, se as células forem todas aderentes e em bom estado, preparem-se para a co-cultura. Descarte o meio nas pastilhas de 6 poços de placa e membrana celular. Coloque as pastilhas de membrana com HepG2.2.15 na placa de 6 poços semeada com HepG-NE, 293T-NE-3NRs e 293T-NE por pinças. Incubar a célula a 37 °C, 5% de CO2 em uma incubadora umidificada, troque o meio a cada 3-4 dias.
NOTA: Definir grupos como a seguir: Bem 1: co-cultura 293T-NE com HepG 2.2.15; Bem 2: Co-cultura HepG2-NE com HepG 2.2.15; Bem 3: 293T-NE-3NRs co-cultura com HepG2.2.15; Bem 4: Co-cultura HepG2-NE com HepG 2.2.15 (adicionar CsA); Bem 5: 293T-NE-3NRs co-cultura com HepG2.2.15 (adicionar CsA); Adicione o meio completo ao bem número 1, 2 e 3, adicione o meio com CsA de 5 μM para o bem número 4 e 5 bem, cerca de 9 mL para cada poço, certifique-se de que a mídia esteja em contato para que as partículas do vírus migrem de transwells para células infecciosas. - Após 10 dias, remova as pastilhas de membrana, adicione PBS à placa de 6 poços e lave delicadamente duas vezes, fixe as células com metanol gelado para imunofluorescência.
7. Realize a imunofluorescência para hbcag
- Fixar as células com metanol gelado a -20 °C por mais de 3 h. Descarte o metanol. Lave as células com PBS por 10 minutos à temperatura ambiente no shaker, repita por 3 vezes.
- Adicione 5% de BSA (100 μL/48-bem-placa, 500 μL/6-bem-placa), agite no agitador horizontal por 1h a 40 rpm e temperatura ambiente.
- Adicione a solução de anticorpos primários HBcAg (anticorpo primário: solução BSA de 5% =1:200, 100 μL / 48-well-plate, 500 μL / 6-well-plate), agite durante a noite a 4 °C.
- Lave os poços com PBST (PBS com 0,1% de interpolação 20), por 10 minutos em temperatura ambiente no shaker, repita por 3 vezes.
- Adicione a segunda solução de anticorpos (594 anticorpos rotulados criados em cabra contra o coelho IgG: PBS = 1:1.000, 100 μL /48-bem-placa, 500 μL / 6-bem-placa), cubra a placa com papel alumínio e agite por 2h à temperatura ambiente.
- Lave novamente com PBST por três vezes, agite por 10 min cada.
- Adicione 1 μg/mL DAPI, agite por 2 min. Lave duas vezes com PBST em um shaker por 5 minutos cada. Descarte o PBST. Adicione PBS e observe sob microscópio de imunofluorescência.
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Representative Results
Construímos plasmid pSIN-NTCP-EGFP expressando fusão NTCP e EGFP e com resistência à puramicina. O plasmídeo foi transfectado em células HepG2 e 293T para construir linhas de células estáveis HepG2-NE e 293T-NE expressando NTCP e EGFP. Plasmids (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-bandeira) com resistência e expressão de puromicina foram transfectados em células 293T-NE para construir uma linha celular estável expressando 4 genes hospedeiros9. A expressão do NTCP-EGFP pode ser observada por fluorescência verde e verificada por qPCR e mancha ocidental (dados não mostrados, mas ver trabalho anterior 9).
O anticorpo primário de HBcAg e DAPI incubado com células fixas mostrou uma coloração distinta quando observado usando 10x objetivo em um microscópio fluorescente invertido. A localização nuclear foi confirmada por coloração com DAPI (Figura 3 e Figura 4-a terceira coluna). O NTCP-EGFP é expresso na membrana celular e pode ser localizado pela fluorescência verde (Figura 3 e Figura 4-a segunda coluna). Os locais de expressão de HBcAg podem ser localizados por fluorescência vermelha (Figura 3 e Figura 4-a primeira coluna). Quando DAPI, NTCP e HBcAg estão na mesma célula, significa que a célula foi infectada com sucesso com HBV (Figura 3 e Figura 4-a última coluna).
O grupo CSA foi o controle negativo. O CSA impediu que o HBV entrasse nas células bloqueando o NTCP. Como um controle positivo, as células HepG2-NTCP-EGFP infectadas podem expressar HBcAg. O HBcAg foi detectado em células 293T-NE-3NRs, mas não em células 293T-NE, indicando que o NTCP não é o único fator essencial para a infecção pelo HBV em 293T. A imunofluorescência das células infectadas com concentrado supernante HepG2.2.15 foi a mesma das células co-cultivadas com células HepG2.2.15. Mostrou que o HBcAg foi expresso em células 293T-NE-3NRs e HepG2-NE, o que sugere que os quatro genes hospedeiros (NTCP, HNF4α, RXRα e PPARα) facilitam a infecção pelo HBV. Mas os sinais para HBcAg em 293T-NE-3NRs foram menores em comparação com o HepG2-NE, indicando que a infecção pelo HBV também pode ser afetada por outros fatores de hospedagem.
| Referência quantitativa | Referência quantitativa | Referência quantitativa | Referência quantitativa | Controle negativo | Controle positivo do HBV | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | Nenhum | 12.3865 |
| GEq/mL | 2*10^3 | 2*10^4 | 2*10^5 | 2*10^6 | —— | —— |
Tabela 1: Valores ct para as referências quantitativas.
| HepG 2.2.15 Sobrenadante |
1/20 HepG 2.2.15 Concentrar |
HepG 2.2.15 Concentrar |
|
| Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
| GEq/mL | 1,65 * 10^4 | 7.53 * 10^5 | 1.5 * 10^7 |
Tabela 2: Valores ct para DNA HBV obtidos a partir de HepG2.2.15 supernadante. Os valores representam valores ct para DNA HBV obtidos a partir de supernante original, diluição de 1/20 ou seu concentrado.
| 293T-NE | HepG2-NE | 293T-NE-3NRs | |||
| Vhb | Vhb | HBV+CsA | Vhb | HBV+CsA | |
| HBV GEq/célula | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| HBV μL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CsA μL (5 μM) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| DMSO μL | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
| 40 % PEG8000 μL | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Média de infecção μL | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
| Total μL | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
Tabela 3: Complexo de infecção. O volume total utilizado foi de 500 μL. A ciclosporina A foi utilizada como controle negativo.
Figura 1: Uma representação gráfica do protocolo. HepG2.2.15 foram co-cultivados com 293T-NE-3NRs e a infecção foi observada utilizando microscopia de imunofluorescência ou o supernascimento contendo partículas virais foi concentrado e introduzido em células cultivadas 293T-NE-3NRs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curva padrão HBV calculada a partir dos valores ct. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O concentrado supernacante HepG2.2.15 foi usado para infectar células 293T-NE, 293T-NE-3NRs e HepG2-NE com 150 GEq por célula. A expressão HBcAg foi identificada pelo ensaio de imunofluorescência. HBcAg foi expresso em células 293T-NE-3NRs e HepG2-NE, enquanto que nenhuma expressão foi observada nessas células tratadas com células CSA (inibidor de entrada HBV) e 293T-NE. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: 293T-NE, 293T-NE-3NRs e HepG2-NE co-cultivados com células HepG2.2.15. A expressão HBcAg foi identificada pelo ensaio de imunofluorescência. HBcAg foi expresso em células 293T-NE-3NRs e HepG2-NE, enquanto que nenhuma expressão foi observada nessas células tratadas com células CSA (inibidor de entrada HBV) e 293T-NE. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, introduzimos protocolos para infecção por HBV em células Hepáticas 293T-NE-3NRs e hepatoma baseadas em HepG2-NE. 293T-NE-3NRs foram adequados para infecção por HBV tanto no Alto quanto no Baixo GEq. As seguintes etapas críticas devem ser levadas em consideração ao usar nosso protocolo. O estado celular é um fator importante para uma infecção bem sucedida. O meio de infecção deve ser alterado oportunamente após o período inicial de infecção por HBV. As células 293T-NE-3NRs são tipicamente frágeis após a infecção com virais altas. Portanto, essas células devem ser lavadas suavemente para evitar desacoplamento das células após 24 horas de infecção. Ao usar pastilhas de membrana para cultura, devemos garantir que a densidade inicial de semeadura seja apropriada, e a câmara está suficientemente submersa em mídia para garantir a fixação eficiente de partículas virais às células 293T-NE-3NRs. Para detectar o HBcAg, devemos lavar as células suavemente antes da fixação para evitar sinais falsos positivos. Deve-se tomar cuidado durante a etapa de lavagem, pois as células 293T tendem a se desprender da parte inferior.
Infectar 293T-NE-3NRs por HBV não é tão fácil quanto o HepG2 expresso em NTCP. Ao contrário do HepG2, essas células são fáceis de se desprender da parte inferior da placa durante a cultura. E essas células são mais frágeis do que o HepG2 após a infecção usando DMSO e PEG8000 ou co-cultura com HepG2.2.15 por 10 dias sem passar. Portanto, precisamos revestir a placa em 0,1% de gelatina e número de célula apropriado de sementes na placa. Mais cuidado deve ser tomado para evitar que as células se desprendem durante a mudança do meio, lavagem ou fixação das células.
Em comparação com os métodos tradicionais de infecção por HBV, adotamos uma linha celular 293T projetada, 293T-NE-3NRs, como modelo de infecção e co-cultivado com HepG2.2.15. Curiosamente, as células 293T-NE-3NRs foram infectadas com sucesso com HBV mesmo em GEq baixo, o que imita as condições fisiológicas naturais com mais precisão. Modelar a infecção por HBV em 293T-NE-3NRs é um complemento útil ao tradicional devido ao fundo não hepático dessas células. A aplicação do método pode nos ajudar a identificar os novos fatores de hospedagem, embora a eficiência da infecção deste método não seja tão alta quanto a tradicional. Acreditamos que os modelos in vitro apresentados neste manuscrito ajudarão a facilitar novas descobertas no campo.
Uma limitação para este método é a eficiência da infecção. A infecção in vitro do HBV não é tão fácil quanto a in vivo. Os modelos in vitro atuais para HBV são limitados devido à sua baixa suscetibilidade à infecção por HBV, onde inocula extremamente alta são necessárias para iniciar a infecção e não há propagação viral óbvia10. Isso contrasta com observações in vivo onde um único virion HBV pode infectar uma grande porção de hepatócitos nas meras semanas11,12. Assim, a identificação de novos fatores de hospedagem que afetam a replicação do HBV é muito benéfica para promover nossa compreensão das interações de HBV e host. Além disso, imitando o desenvolvimento hepático in vivo ou rim, podem ser gerados organoides funcionais que recapitulariam mais de perto o funcionamento fisiológico de um fígado humano ou rim13,14. Isso aumentaria muito nossa compreensão da infecção pelo HBV.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (nº 81870432 e 81570567 a X.L.Z.), (Nº 81571994 para P.N.S.), Fundo de Pesquisa para Jovens Cientistas Internacionais (nº 81950410640 a W.I.); Fundação Universidade Li Ka Shing Shantou (Nº. L1111 2008 para P.N.S.). Gostaríamos de agradecer ao Prof. Stanley Lin da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou por conselhos úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
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