Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Моделирование инфекции вируса гепатита В в клетках не хедпатического 293T-NE-3NRs

Published: June 5, 2020 doi: 10.3791/61414
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3,5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College, 4Medical Research Center, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, 5Department of Nucleic Acid Researches, Genetic Engineering and Biotechnology Research Institute, General Autority - City of Scientific Researches and Technological Applications
* These authors contributed equally

Summary

Эта рукопись описывает подробный протокол для инфекции вируса гепатита В (HBV) в новых 293T клеток (293T-NE-3NRs, выражая человека NTCP, HNF4, RXR и PPAR) и традиционных печенок клеток (HepG2-NE, выражая человека NTCP).

Abstract

HBV главным образом заражает людские гепатоциты, но было также найдено, что заражает extrahepatic ткани such as почки и яички. Тем не менее, клеточные модели HBV ограничиваются гепатомными клеточными линиями (такими как HepG2 и Huh7) переэкспрессией функционального рецептора HBV, таурохолата натрия, коатрипрационного полипептида (NTCP). Здесь мы использовали 293T-NE-3NRs (293T overexpressing человека NTCP, HNF4, RXR и PPAR) и HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) в качестве модельных клеточных линий.   HBV инфекция в этих клеточных линий была выполнена либо с использованием концентрированных частиц вируса HBV от HepG2.2.15 или совместного культивирования HepG2.2.15 с целевыми клеточными линиями. HBcAg иммунофлуоресценции для HBcAg была выполнена для подтверждения инфекции HBV. Два метода, представленные здесь, помогут нам изучить инфекцию HBV в неепатических клеточных линиях.

Introduction

Гепатит В влияет на жизнь более 2 миллиардов человек и является одной из основных угроз общественному здравоохранению. Приблизительно 257 миллионов человек хронически инфицированы вирусом гепатита В (HBV) во всем мире, вызывая большое бремя для общества1. Гепатоциты не единственные клетки, инфицированные HBV и другие клетки в неепатической ткани, такие как почки и яички, также инфицированы этим вирусом2,3. В настоящее время модели клеток инфекции HBV ограничены человеческими гепатоцитами только с несколькими моделями линии неепатических клеток. Это препятствует изучению инфекции HBV и HBV связанных патологии негепатических тканей. Здесь мы представляем протоколы для изучения инфекции HBV в не-печеночной клетки 293T, а также в гепатоме основе клеток.

Таурохолат натрия является функциональным рецептором вируса гепатита В и гепатита D4. Гепатоцитов ядерного фактора 4 "(HNF4"), ретиноид X рецептора (RXR) и пероксисомы пролифератор активированный рецептор (PPAR) являются печени обогащенных транскрипции факторов, ограничивающих вирусный тропизм HBV. Они были проверены для содействия HBV прегеномного синтеза РНК и поддержки репликации HBV в негепатомной клеточной линии5. Мы построили три различных клеточных линий, Хепг2 клеточных линий, выражающих NTCP (HepG2-NE), 293T линии клеток, выражающих NTCP (293T-NE) и 293T клеточной линии, выражающей четыре гена хозяина; NTCP, HNF4, RXR и ПТАРЗ (293T-NE-3NRs). Два метода для инфекции HBV были разработаны на основе 293T-NE-3NRs(рисунок 1). Первый метод использует прививку в 293T-NE-3NRs с высокой эквивалентностью вирусного генома (высокий GEq (150), DMSO и PEG8000) на 24 ч. Второй метод использует совместное культивирование 293T-NE-3NRs с HepG2.2.15, который может производить частицы HBV (низкий GEq (около 1.83) без DMSO и PEG8000), таким образом близко эмуируя естественные условия.

Клетки HepG2.2.15 получены из линии HepG2 и хронически выделяют инфекционные HBV, а также субвирусные частицы в культурную среду6,7. Циклоспорин А (CsA) является иммунодепрессантом, клинически используемым для подавления отторжения ксенотрансплантата. Исследования показали, что CsA ингибирует вход HBV в культивируемые гепатоциты, ингибируя транспортерную активность NTCP и блокируя привязку NTCP к большим белкамконверта 8.

Клетки HepG2-NE использовались в качестве положительного контроля, в то время как обработанные клетки CsA использовались в качестве отрицательного контроля. Сравнивая с положительными и отрицательными группами контроля, мы можем выяснить, какие гены хозяина играют важную роль в инфекции HBV. Кроме того, через этот режим инфекции HBV, мы также можем найти другие новые механизмы или принимающих генов, участвующих в инфекции HBV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Культура, сбор супернатантов из клеток HepG2.2.15 и инфекции HBV должны быть выполнены в биобезопасности уровня II (P2) или биобезопасности уровня III (P3) лаборатории в соответствии с биобезопасности руководства в стране. Следует соблюдать методы лабораторной безопасности для обеспечения безопасности лабораторного персонала, и все они должны быть вакцинированы и обнаружены HBsAb положительные перед выполнением экспериментов HBV. Наблюдайте за состоянием клеток на каждом шагу, прежде чем переходить к следующему шагу. Образцы сыворотки человека использовались в соответствии с одобрением, полученным Институциональным наблюдательным советом Медицинского колледжа Шанту.

1. Культура Хепг2.2.15 клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: HepG2.2.15 клеточный супернатант, HepG2.2.15 клеточный супернатантный концентрат и все кончики, фляги, пластины и трубки, которые вступают в контакт с HepG2.2.15 должны быть удалены после того, как замачивают в 2% virucide ночь.

  1. Удалите флакон, содержащий клетки HepG2.2.15, из жидкого азота и оттайте, аккуратно закрученный флаконом в водяной бане с 37 градусами Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить вероятность загрязнения, держать крышку из воды. Оттепель должна быть быстрой (примерно 2 мин).
  2. Удалите флакон с водяной бани, как только клетки разморозят и дезинфицируют его 70% этанолом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента выполнять все шаги в строгих асептических условиях.
  3. Перенесите клетки в 25 см2 ткани культуры фляги и добавить 4 мЛ полной среды культуры (DMEM содержащие 10% FBS, пенициллин 100 U/mL, стрептомицин 0,1 мг/ мЛ). Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненное инкубатор с 5% CO2.

2. Коллекция HepG2.2.15 клеточная культура супернатант

  1. Культура HepG2.2.15 ячейки в Т25 колбы при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в увлажненной инкубатор. Меняйте среду каждые 3 дня.
  2. Соберите клеточный супернатант в центрифуговой трубке 50 мл. Закройте крышку плотно и оберните его парафиновой пленкой.
  3. Храните супернатант HepG2.2.15 при -20 градусов по Цельсию, чтобы поддерживать активность вируса HBV.

3. Концентрация HepG2.2.15 супернатант

  1. Снимите супернатант HepG2.2.15 с -20 градусов по Цельсию и оттайте при 4 градусах Цельсия.
  2. Чтобы удалить фрагменты клеток, отфильтруть супернатант HepG2.2.15 с мембраной 0,45 мкм на новую трубку центрифуги 50 мл. Сначала блокируйте фильтр, фильтруя 10 мЛ DMEM с 10% FBS перед фильтрацией вируса, затем фильтруйте супернатант клеточной культуры.
  3. Добавьте 14 мл фильтрованного супернатанта в колонку концентратора вируса и закройте крышку. Центрифуга колонны на 3200 х г в течение 35 минут в горизонтальной вращающейся центрифуге. Соберите супернатантный концентрат HepG2.2.15 (около 200 мл) в трубку 1,5 мл.
  4. Вымойте колонку с DMEM один раз, добавив 200 МЛ DMEM и собрать его в 1,5 мл трубки.

4. Обнаружение ДНК HBV в супернатантного концентрате

  1. Включите сухой блок нагревателя и установите температуру до 100 градусов по Цельсию.
  2. Для обеспечения того, чтобы концентрация ДНК HBV в супернатантном концентрате HepG2.2.15 находится в пределах стандартного диапазона кривой, разбавляйте концентрат в 20 раз, добавляя 10 мл супернатантного концентрата HepG2.2.15 к 190 мл DMEM в 1,5 мл микроцентровой трубки. Добавьте 200 мл супернатанта HepG2.2.15, отрицательный контроль (HBV-отрицательная сыворотка от здорового донора), положительный контроль HBV (HBV-положительная сыворотка от пациента HBV) и четыре разбавления количественных ссылок, представленных в комплекте (2.) 0 х 106, 2,0 х 105, 2,0 х 104,2,0 х 103 GEq /mL), соответственно, чтобы отделить 1,5 мл микроцентрифуги труб.
  3. Добавьте 450 мл буфера извлечения ДНК HBV из комплекта для всех вышеуказанных восьми труб 1,5 мл, вихря для 15 с и спина вниз в течение 10 с. Инкубировать при 100 градусов по Цельсию в течение 10 минут в сухом блоке нагревателя. Центрифуга при температуре 12 000 х в течение 5 минут при комнатной температуре.
  4. Добавьте 27 мл смеси ПЦР и 3 мл фермента Taq-полимеразы в трубки ПЦР, размещенные на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР мастер смеси, представленные в комплекте содержат грунтовки против сохраненной области HBV ДНК.
  5. Добавьте 20 мл центробежной супернатантной жидкости в трубки ПЦР, размещенные на льду. Накройте плотно и спина вниз на 10 с.
  6. Используйте следующие условия на машине ПЦР в режиме реального времени: 93 ккc в течение 2 мин, 10 циклов 93 градусов по Цельсию для 45 с, а затем 55 градусов по Цельсию за 60 с; затем 30 циклов по 93 градуса по Цельсию в течение 30 с, а затем 55 градусов по Цельсию в течение 45 с для выполнения в режиме реального времени ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мастер микс, представленный в коммерческом комплекте, имеет грунтовки против сохраненной области ДНК HBV.
  7. Экспорт значений Ct получены и генерировать стандартную кривую, как показано в таблице 1 и рисунок 2.
  8. Основываясь на стандартной кривой, вычислить концентрацию HBV ДНК HepG2.2.15 супернатантный концентрат разбавленный 20x, как показано в таблице 2. Рассчитайте концентрацию HBV ДНК концентрата HepG2.2.15(Таблица 2).
  9. Разделите супернатантный концентрат HepG2.2.15 в аликоту и храните при -80 градусов по Цельсию до использования.

5. In vitro инфекции HepG2-NE и 293T-NE-3NRs клетки

  1. Подготовка следующей инфекции среды в DMEM / F-12: 10% FBS, 4 мМ глутамин дополнение, 0,1 м НЭТ, 1 мМ Натрия пируват, 100 U/mL пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицин, 1 мкг/мл пуромицин, 40 нг/мл дексаметазон, 20 мкг/мл гидрокортизона и 5 мкг/мл инсулина. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти NTCP положительные клетки пуромицин-резистентных9.
  2. Добавьте 0,1% желатина в 5 скважин по 48 скважин, 200 мл к каждому колодцу. Обузуте пластину при 37 градусах по Цельсию на 2 ч, отбросьте супернатант. Обузуте пластину при 37 градусах Цельсия еще на 2 ч.
  3. Семя HepG2-NE при плотности 1 х 104 клеток в 2 скважины каждый. Семена 293T-NE-3NRs клетки при плотности 1 х 104 клетки в 2 скважины каждый (все-транс ретинойной кислоты на 1 мкмоль / л и клофибриновой кислоты в 1 ммоль / Л окончательные концентрации были добавлены в среду для активации RXR и PPAR'ядерных рецепторов гормонов, соответственно). Семя 293T-NE в 1 колодце при плотности 1 х 104 клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прохождение клеток в суб-слияние с использованием 0,25% трипсина. Подсчитайте номер клетки, а затем сейте клетки до соответствующей плотности.
  4. Инкубировать клетку при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в увлажненное инкубатор на 24 ч. Наблюдать клетки после 24 ч и приступить к инфекции, если клетки здоровы.
  5. Подготовьте инфекционный комплекс, как уже упоминалось в таблице 3, добавьте HBV (HepG2.2.15 супернатантный концентрат), DMSO, PEG8000 и инфекции средней до 1,5 мл микроцентрифуг трубки. Подготовка запасов CsA путем растворения его в DMSO к концентрации 5 мМ и держать запас на -20 oC. Рабочим решением CsA является 5 МКМ. Семена 1'104 клетки на колодец из 48-хорошо пластины. Добавьте 100 мл концентрата HepG2.2.15 супернатант (содержащий HBV 1.5063 х 107 GEq/mL) для заражения клеток при 150 ГЕк/ячейке.
  6. Добавьте 500 мл инфекционного комплекса в каждый колодец и инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в увлажненное инкубатор на 24 ч.
  7. Вымойте клетки дважды с 500 МЛ PBS, прежде чем менять среду. Добавьте 1 мл среды в каждую скважину. Если состояние ячейки плохое, а некоторые клетки плавают, измените среду напрямую. Это первый день инфекции. Меняйте среду осторожно каждые 2 дня.
  8. На 11-й день вымойте клетки дважды с 500 мл PBS и зафиксируеме клетки ледяным метанолом для иммунофлуоресценции.

6. HepG2.2.15 совместно с HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE

  1. Добавьте 1 мл/колодец 0,1% желатина к 5 скважинам из 6 хорошо плит. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию на 2 ч и отбросить супернатант. Обузуте тарелку еще 2 ч при 37 градусах Цельсия, чтобы полностью высушить колодец.
  2. Семя 1 х 105 клеток/колодец HepG-NE в 2 скважины, 293T-NE-3NRs в 2 скважины, и 293T-NE в 1 колодец пластины. Семя 1 х 105 клеток/хорошо HepG2.2.15 на пять мембранных вставок (24 мм, диаметр пор 0,4 м, неокрашенный) в отдельной 6-й колодецной пластине. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в увлажненное инкубатор на 24 ч.
  3. После 24 ч, если клетки все приверженцы и в хорошем состоянии, подготовиться к со-культуры. Отбросьте среду в 6-хорошо пластины и клеточной мембраны вставки. Поместите мембранные вставки с HepG2.2.15 в 6 хорошо пластины посеяны с HepG-NE, 293T-NE-3NRs и 293T-NE пинцетом. Инкубировать клетку при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в увлажненное инкубатор, изменить среду каждые 3-4 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Набор групп следующим образом: Ну 1: 293T-NE совместной культуры с HepG 2.2.15; Ну 2: HepG2-NE со-культуры с HepG 2.2.15; Ну 3: 293T-NE-3NRs совместно культуры с HepG2.2.15; Ну 4: HepG2-NE совместной культуры с HepG 2.2.15 (добавить CsA); Ну 5: 293T-NE-3NRs совместно культуры с HepG2.2.15 (добавить CsA); Добавьте полную среду к ну номер 1, 2 и 3, добавьте среду с 5 ЗМ CsA к ну номер 4 и 5 хорошо, около 9 мл для каждой скважины, убедитесь, что средства массовой информации находятся в контакте для того, чтобы частицы вируса мигрировать из трансвеллов в инфицированные клетки.
  4. Через 10 дней снимите мембранные вставки, добавьте PBS в 6-хорошо пластину и аккуратно вымойте дважды, зафиксируеме клетки ледяным метанолом для иммунофлуоресценции.

7. Выполните иммунофлуоресценцию для HBcAg

  1. Закрените клетки ледяным метанолом при температуре -20 градусов по Цельсию более чем на 3 ч. Откажитесь от метанола. Вымойте клетки с PBS в течение 10 минут при комнатной температуре на шейкере, повторите в течение 3 раз.
  2. Добавьте 5% BSA (100 л/48-хорошо пластины, 500 л/6-хорошо пластины), встряхните на горизонтальном шейкере на 1 ч при 40 об/мин и комнатной температуре.
  3. Добавьте решение первичного антитела HBcAg (первичное антитело: 5% раствор BSA No1:200, 100 л / 48-хорошо пластины, 500 мл / 6-хорошо пластины), встряхните на ночь при 4 градусов по Цельсию.
  4. Вымойте колодцы с PBST (PBS с 0,1% tween 20), в течение 10 минут при комнатной температуре на шейкере, повторите в течение 3 раз.
  5. Добавьте второй раствор антитела (594 помеченных антитела, поднятые в козе против кролика IgG: PBS 1:1,000, 100 qL /48-well-plate, 500 л / 6-хорошо пластины), накройте пластину фольгой и встряхните в течение 2 ч при комнатной температуре.
  6. Вымойте снова с PBST в течение трех раз, встряхнуть в течение 10 минут каждый.
  7. Добавить 1 мкг/мл DAPI, встряхните в течение 2 мин. Вымойте дважды с PBST на шейкере в течение 5 мин каждый. Откажитесь от PBST. Добавить PBS и наблюдать под иммунофлуоресценцией микроскопа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы построили pSIN-NTCP-EGFP плазмиду, выражаюющую синтез NTCP и EGFP и с устойчивостью к пуромицину. Плазмида была трансфицирована в клетки HepG2 и 293T для построения стабильных клеточных линий HepG2-NE и 293T-NE, выражающих NTCP и EGFP. Плазмиды (pSIN-HNF4, pSIN-RXR, pLV-PPAR-puro-flag) с резистентностью и экспрессией пуромицинов были трансфицированы в 293T-NE клетки для построения стабильной клеточной линии, выражающей 4 гена хоста9. Выражение NTCP-EGFP можно наблюдать по зеленой флуоресценции, и проверяется qPCR и западной помарки (данные не показаны, но см. предыдущую работу 9).

Первичные антитела HBcAg и DAPI, инкубированные фиксированными клетками, показали четкое окрашивание при использовании 10-х цели на флуоресцентном перевернутом микроскопе. Ядерная локализация была подтверждена окрашивания с DAPI(рисунок 3 и рисунок 4- третья колонка). NTCP-EGFP выражается на клеточной мембране и может быть расположен зеленой флуоресценцией(рисунок 3 и рисунок 4- второй столбец). Сайты выражения HBcAg могут быть расположены красной флуоресценцией(рисунок 3 и рисунок 4- первая колонка). Когда DAPI, NTCP и HBcAg находятся в одной ячейке, это означает, что клетка была успешно заражена HBV(рисунок 3 и рисунок 4- последняя колонка).

Группа CsA была отрицательным контролем. CsA предотвратил hbV от входа в ячейки, блокируя NTCP. В качестве положительного контроля, инфицированные клетки HepG2-NTCP-EGFP могут выразить HBcAg. HBcAg был обнаружен в клетках 293T-NE-3NRs, но не в клетках 293T-NE, что указывает на то, что NTCP не является единственным фактором, необходимым для инфекции HBV в 293T. Иммунофлуоресценция клеток, инфицированных супернатантным концентратом HepG2.2.15, была такой же, как и у клеток, совместно культивируемых с клеткой HepG2.2.15. Он показал, что HBcAg был выражен в 293T-NE-3NRs и HepG2-NE клеток, это свидетельствует о том, что четыре гена хозяина (NTCP, HNF4 , RXR и PPAR) облегчает инфекцию HBV. Но сигналы для HBcAg в 293T-NE-3NRs были ниже по сравнению с HepG2-NE, указывая на инфекцию HBV может быть также затронуты другими факторами хозяина.

Количественная ссылка Количественная ссылка Количественная ссылка Количественная ссылка Отрицательный контроль ПОЛОЖИТЕЛЬНЫй контроль HBV
1 2 3 4
Ct 20.1527 17.6647 14.5816 12.0409 Ни один 12.3865
GEq/mL 2х10 х3 2х10 х 4 2х10 х 5 2'10'6 —— ——

Таблица 1: Значения Ct для количественных ссылок.

Хепг 2.2.15
супернатант		 1/20 Хепг 2.2.15
Сосредоточиться		 Хепг 2.2.15
Сосредоточиться
Ct 17.716 13.1556 ——
GEq/mL 1,65-10х4 7,53х10 х 5 1,5х10 х 7

Таблица 2: Ct значения для HBV ДНК, полученные из HepG2.2.15 супернатанта. Значения представляют значения Ct для ДНК HBV, полученные из оригинального супернатанта, разбавления 1/20 или его концентрата.

293T-NE Хепг2-NE 293T-NE-3NRs
Hbv Hbv HBV-CsA Hbv HBV-CsA
HBV GEq/ячейка 150 150 150 150 150
HBV ЗЛ 100 100 100 100 100
CsA ЗЛ (5 МК) 0 0 0.5 0 0.5
DMSO ЗЛ 10 10 9.5 10 9.5
40 % PEG8000 ЗЛ 50 50 50 50 50
Инфекция средняя ЗЛ 340 340 340 340 340
Итого ЗЛ 500 500 500 500 500

Таблица 3: Инфекционный комплекс. Общий объем используемого составил 500 мл. Циклоспорин А использовался в качестве отрицательного контроля.

Figure 1
Рисунок 1: Графическое представление протокола. HepG2.2.15 были либо совместно культивируется с 293T-NE-3NRs и инфекция наблюдалась с помощью иммунофлуоресценции микроскопии или супернатант, содержащий вирусные частицы был сконцентрирован и введен в 293T-NE-3NRs культурных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: стандартная кривая HBV, рассчитанная на основе значений Ct. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Хепг2.2.15 супернатантный концентрат был использован для заражения 293T-NE, 293T-NE-3NRs и HepG2-NE клетки с 150 GEq на ячейку. Выражение HBcAg было выявлено путем анализа иммунофлуоресценции. HBcAg был выражен в 293T-NE-3NRs и HepG2-NE клеток, в то время как, не выражение наблюдалось в этих клетках, обработанных с CsA (ингибитор входа HBV) и 293T-NE клеток. Масштабная панель No 100 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: 293T-NE, 293T-NE-3NRs и HepG2-NE совместно культивирулись с клетками HepG2.2.15. Выражение HBcAg было выявлено путем анализа иммунофлуоресценции. HBcAg был выражен в 293T-NE-3NRs и HepG2-NE клеток, в то время как, не выражение наблюдалось в этих клетках, обработанных с CsA (ингибитор входа HBV) и 293T-NE клеток. Масштабная панель No 100 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы вводим протоколы для инфекции HBV в негепатических 293T-NE-3NRs и гепатома основе HepG2-NE клеток. 293T-NE-3NRs были пригодны для инфекции HBV как на высоком, так и на низком уровне GEq. При использовании нашего протокола необходимо принять во внимание следующие важные шаги. Состояние клеток является важным фактором для успешной инфекции. Среда инфекции должна быть изменена своевременно после начального периода инфекции HBV. 293T-NE-3NRs клетки, как правило, хрупкие после инфекции с высоким вирусными титры. Таким образом, эти клетки должны быть вымыты осторожно, чтобы избежать отсоединения клеток после 24 ч инфекции. При использовании мембранных вставок для культуры, мы должны убедиться, что начальная плотность посева является целесообразным, и камера достаточно погружена в средствах массовой информации для обеспечения эффективного присоединения вирусных частиц к клеткам 293T-NE-3NRs. Чтобы обнаружить HBcAg, мы должны тщательно вымыть клетки перед фиксацией, чтобы избежать ложных положительных сигналов. Уход должен быть сделан во время стирки шаг, как 293T клетки, как правило, отсоединяются от нижней.

Заразить 293T-NE-3NRs HBV не так просто, как NTCP-экспрессивный HepG2. В отличие от HepG2, эти клетки легко отделить от нижней части пластины во время культуры. И эти клетки являются более хрупкими, чем HepG2 после инфекции с использованием DMSO и PEG8000 или совместной культуры с HepG2.2.15 в течение 10 дней без прохода. Поэтому нам нужно покрыть тарелку на 0,1% желатином и семенным соответствующим номером клетки в тарелку. Следует проявлять больше всякую осторожность, чтобы предотвратить отсоединение клеток при изменении среды, стирке или фиксации клеток.

По сравнению с традиционными методами инфекции HBV, мы приняли инженерии 293T клеточной линии, 293T-NE-3NRs, как модель инфекции и совместно культивируется с HepG2.2.15. Интересно, что клетки 293T-NE-3NRs были успешно инфицированы HBV даже при низком GEq, который более точно имитирует естественные физиологические условия. Моделирование инфекции HBV в 293T-NE-3NRs является полезным дополнением к традиционной из-за негепатического фона этих клеток. Применение метода может помочь нам определить новые факторы хозяина, хотя эффективность инфекции этого метода не так высока, как традиционный. Мы считаем, что модели in vitro, представленные в этой рукописи, помогут облегчить новые открытия в этой области.

Ограничением этого метода является эффективность инфекции. In vitro HBV инфекции не так просто, как in vivo. Текущие модели in vitro для HBV ограничены из-за их плохой восприимчивости к инфекции HBV, где чрезвычайно высокая инкула требуется, чтобы инициировать инфекцию и нет очевидного вирусного распространения10. Это резко контрастирует с in vivo наблюдений, где один HBV вирион может заразить большую часть гепатоцитов в течение нескольких недель11,12. Таким образом, выявление новых факторов пребывания, влияющих на репликацию HBV, очень полезно для углубления нашего понимания HBV и взаимодействия с хозяином. Кроме того, имитируя развитие печени или почек in vivo, могут быть созданы функциональные органоиды, которые бы более точно перепроверяли физиологическое функционирование печени или почек человека13,,14. Это значительно повысит наше понимание инфекции HBV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 81870432 и 81570567 к X.L.З.), (No 81571994 к P.N.S.), Научно-исследовательский фонд для международных молодых ученых (No 81950410640 к W.I.); Фонд Университета Ли Ка Шин Шанту (Нет. L1111 2008 до P.N.S.). Мы хотели бы поблагодарить профессора Стэнли Лина из Медицинского колледжа Шанту за полезные советы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45μm membrane filter Millex-HV SLHU033RB Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate BIOFIL TCP010006 For co-culture
Amicon Ultra 15 ml Millipore UFC910008 For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA Beyotime ST023 For immunofluorescence assay
Cyclosporin A Sangon biotech 59865-13-3 inhibitor of HBV infection
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) DAAN GENE 7265-2013 For HBV DNA detection
DMEM HyClong SH30243.01 For culture medium
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS) CLARK Bioscience FB25015 For culture medium
Fluorescence microscope ZEISS Axio observer Z1 For immunofluorescence assay
HepG2-NE Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
HBcAg antibody ZSGB-BIO ZA-0121 For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS ZSGB-BIO ZLI-9062 For cell wash
PEG8000 Merck P8260 For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine Thermo Fisher 10378016 For culture medium
Transwell CORNING 3412 For co-culture
Tween 20 sigma-Aldrich WXBB7485V For PBST
Virkon Douban 6971728840012 Viruside

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2017).
  2. Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
  3. Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
  4. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
  5. Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
  6. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
  7. Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
  8. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
  9. Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
  10. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  11. Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
  12. Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
  13. Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
  14. Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).

Tags

Этот месяц в JoVE Выпуск 160 ИНФЕКЦИЯ HBV модель HepG2.2.15 HepG-NE 293T-NE-3NRs NTCP рецепторы ядерных гормонов
Моделирование инфекции вируса гепатита В в клетках не хедпатического 293T-NE-3NRs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, X., Yang, X., Zeng, C., Attia… More

Sun, X., Yang, X., Zeng, C., Attia Koutb Megahed, F., Zhou, Q., Liu, T., Iqbal, W., Sun, P., Zhou, X. Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells. J. Vis. Exp. (160), e61414, doi:10.3791/61414 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter