Summary
Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för hepatit B-virus (HBV) infektion i nya konstruerade 293T celler (293T-NE-3NRs, uttrycker mänskliga NTCP, HNF4α, RXRα och PPARα) och traditionella leverceller (HepG2-NE, uttrycker mänskliga NTCP).
Abstract
HBV infekterar främst mänskliga hepatocyter, men det har också visat sig infektera extrahepatic vävnader såsom njure och testikel. Icke desto mindre, cell-baserade HBV modeller är begränsade till hepatoma cellinjer (såsom HepG2 och Huh7) överuttryck en funktionell HBV receptor, natrium taurocholat samtransport polypeptid (NTCP). Här använde vi 293T-NE-3NRs (293T overexpressing human NTCP, HNF4α, RXRα och PPARα) och HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) som modellcelllinjer. HBV infektion i dessa cellinjer utfördes antingen med hjälp av koncentrerade HBV virus partiklar från HepG2.2.15 eller co-odling HepG2.2.15 med målet cellinjer. HBcAg immunofluorescens för HBcAg utfördes för att bekräfta HBV infektion. De två metoder som presenteras här kommer att hjälpa oss att studera HBV infektion i icke-lever cellinjer.
Introduction
Hepatit B påverkar livet för mer än 2 miljarder människor och är ett av de största hoten mot folkhälsan. Cirka 257 miljoner människor är kroniskt smittade med hepatit B-virus (HBV) över hela världen, vilket orsakar en stor börda för samhället1. Hepatocyter är inte de enda celler som smittats av HBV och andra celler i icke-levervävnad, såsom njure och testikel, är också smittade av detta virus2,3. För närvarande HBV infektion cellmodeller är begränsade till mänskliga hepatocyter med endast några icke-lever celllinje modeller. Detta hämmar studien av HBV-infektion och HBV-relaterad patologi av icke-levervävnader. Här presenterar vi protokoll för att studera HBV infektion i icke-lever 293T celler samt i hepatoma-baserade celler.
Natriumtaurocholate co-transporterar polypeptid (NTCP) är en funktionell receptor för human hepatit B och hepatit D-virus4. Hepatocyte nukleära faktor 4α (HNF4α), retinoider X receptor α (RXRα) och peroxisome proliferator-aktiverad receptor α (PPARα) är leverberikade transkriptionsfaktorer som begränsar viral tropism av HBV. De har verifierats för att främja HBV pregenomisk RNA-syntes och stödja HBV-replikering i en nonhepatoma cellinje5. Vi konstruerade tre olika cellinjer, HepG2 cellinjer uttrycker NTCP (HepG2-NE), 293T cellinje uttrycker NTCP (293T-NE) och 293T cellinje uttrycker fyra värdgener; NTCP, HNF4α, RXRα och PPARα (293T-NE-3NRs). Två metoder för HBV-infektion utvecklades baserat på 293T-NE-3NRs (figur 1). Den första metoden använder inympning i 293T-NE-3NRs med hög viral genomekvivalens (hög GEq (150), DMSO och PEG8000) för 24 h. Den andra metoden använder co-odling 293T-NE-3NRs med HepG2.2.15, som kan producera HBV partiklar (låg GEq (ca 1,83) utan DMSO och PEG8000), vilket nära efterliknar naturliga förhållanden.
HepG2.2.15 celler kommer från HepG2 linjen och kroniskt utsöndr infektiös HBV, samt subvirala partiklar i odlingsmediet6,7. Cyclosporin A (CsA) är ett immunsuppressivt kliniskt används för undertryckande av xenograft avslag. Studier har visat att CsA hämmar HBV inträde i odlade hepatocyter genom att hämma transportören verksamhet NTCP och blockerar bindning av NTCP till stora kuvert proteiner8.
HepG2-NE celler användes som positiv kontroll medan CsA behandlade celler användes som negativ kontroll. Genom att jämföra med de positiva och negativa kontrollgrupperna kan vi ta reda på vilka värdgener som spelar en avgörande roll i HBV-infektion. Dessutom, genom detta läge av HBV infektion, kan vi också hitta andra nya mekanismer eller värd gener som deltar i HBV infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kultur, insamling av supernatants från HepG2.2.15 celler och HBV infektion bör utföras i biosäkerhet nivå II (P2) eller biosäkerhet nivå III (P3) laboratorium enligt biosäkerhet vägledning i landet. Laboratoriesäkerhetsrutiner bör följas för att garantera laboratoriepersonalens säkerhet, och alla bör vaccineras och detekteras HBsAb-positiva innan HBV-experiment utförs. Observera cellernas tillstånd vid varje steg innan du fortsätter till nästa steg. Humana serumprover användes i enlighet med det godkännande som erhållits av Institutional Review Board of Shantou University Medical College.
1. HepG2.2.15 cellkultur
OBS: HepG2.2.15 cell supernatant, HepG2.2.15 cell supernatant koncentrat och alla tips, flaskor, plattor och rör som kommer i kontakt med HepG2.2.15 bör kasseras efter att ha blötlagts i 2% virucide över natten.
- Ta bort injektionsflaskan som innehåller HepG2.2.15-celler från flytande kväve och tina genom att försiktigt snurra flaskan i ett 37 °C vattenbad.
OBS: För att minska risken för kontaminering, håll locket borta från vattnet. Upptining bör vara snabb (ca 2 min). - Ta bort injektionsflaskan från vattenbadet så snart cellerna tinas upp och desinficera den med 70 % etanol.
Obs: Från och med nu utför du alla steg under strikta aseptiska förhållanden. - Överför cellerna till en25 cm 2 vävnadsodlingskolv och tillsätt 4 ml komplett odlingsmedium (DMEM innehållande 10% FBS, penicillin 100 U/mL, streptomycin 0,1 mg/ml). Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5% CO2.
2. Insamling av HepG2.2.15 cell kultur supernatant
- Kultur HepG2.2.15 cell i T25 flaskor vid 37 °C, 5% CO2 i en fuktad inkubator. Byt medium var tredje dag.
- Samla cellen supernatant i en 50 ml centrifugrör. Stäng locket ordentligt och linda det med en paraffinfilm.
- Förvara Supernatanten HepG2.2.15 vid -20 °C för att hålla HBV-viruset aktivt.
3. Koncentrera HepG2.2.15 supernatant
- Ta bort HepG2.2.15 supernatant från -20 °C och tina vid 4 °C.
- För att ta bort cellfragmenten, filtrera HepG2.2.15 supernatant med ett 0,45 μm membran till ett nytt 50 ml centrifugrör. Blockera först filtret genom att filtrera 10 ml DMEM med 10% FBS innan du filtrerar viruset och filtrerar sedan cellodlingsuperanten.
- Tillsätt 14 ml filtrerat supernatant i en viruskoncentratorkolonn och stäng locket. Centrifugera kolonnen vid 3 200 x g i 35 minuter i en horisontell spinncentrifug. Samla upp HepG2.2.15 supernatantkoncentrat (ca 200 μL) i ett 1,5 ml-rör.
- Tvätta kolonnen med DMEM en gång genom att tillsätta 200 μl DMEM och samla in den i ett 1,5 ml-rör.
4. Påvisande av HBV DNA i supernatantkoncentrat
- Slå på torrblockvärmaren och ställ in temperaturen på 100 °C.
- För att säkerställa att koncentrationen av HBV DNA i HepG2.2.15 supernatantkoncentrat ligger inom standardkurvan, späd koncentratet 20 gånger genom att tillsätta 10 μL HepG2.2.15 supernatantkoncentrat till 190 μL DMEM i ett 1,5 ml mikrorifcentugrör. Tillsätt 200 μL HepG2.2.15 supernatant, negativ kontroll (HBV-negativt serum från frisk donator), HBV-positiv kontroll (HBV-positivt serum från HBV-patienten) och fyra utspädningar av de kvantitativa referenser som anges i satsen (1) 2,0 x 106, 2,0 x 105,2,0 x 104,2,0 x 103 GEq /mL), respektive för att separera 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 450 μl HBV DNA-extraktionsbuffert från satsen till alla ovanstående åtta 1,5 ml-rör, virvel för 15 s och snurra ner för 10 s. Inkubera vid 100 °C i 10 min i torrblockvärmare. Centrifugera vid 12, 000 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 27 μl PCR-master mix och 3 μL Taq-polymerasenzym till PCR-rören som placeras på is.
OBS: PCR master mix som finns i satsen innehåller primers mot det bevarade området HBV DNA. - Tillsätt 20 μl centrifugerad supernatantvätska till de PCR-rör som placeras på is. Täck tätt och snurra ner i 10 s.
- Använd följande förhållanden på en PCR-maskin i realtid: 93 °C i 2 min, 10 cykler av 93 °C i 45 s följt av 55 °C för 60 s. därefter 30 cykler av 93 °C för 30 s följt av 55 °C för 45 s för att utföra PCR i realtid.
OBS: Master mixen som finns i den kommersiella satsen har primers mot den bevarade regionen HBV DNA. - Exportera de ct-värden som erhållits och generera en standardkurva enligt tabell 1 och figur 2.
- Beräkna HBV DNA-koncentrationen av HepG2.2.15 supernatantkoncentrat utspädd 20x enligt tabell 2. Beräkna HBV DNA-koncentrationen av HepG2.2.15 supernatantkoncentrat (tabell 2).
- Dela HepG2.2.15 supernatant koncentrat i alikvoter och förvara på -80 °C tills den används.
5. In vitro-infektion av HepG2-NE och 293T-NE-3NRs celler
- Förbered följande infektionsmedium i DMEM/F-12: 10% FBS, 4 mM glutamin tillägg, 0,1 mM NEAA, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 1 μg/mL puromycin, 40 ng/mL dexametason, 20 μg/mL hydrocortisone och 5 μg/mL insulin. Förvaras vid 4 °C.
OBS: Dessa NTCP-positiva celler är puromycinresistenta9. - Tillsätt 0,1% gelatin till 5 brunnar av 48 väl plattan, 200 μL till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 °C i 2 timmar, kasta supernatanten. Inkubera plattan vid 37 °C i ytterligare 2 timmar.
- Seed HepG2-NE vid en densitet på 1 x 104 celler i 2 brunnar vardera. Frö 293T-NE-3NRs celler med en densitet av 1 x 104 celler i 2 brunnar vardera (all-trans retinoinsyra vid 1 μmol/L och clofibric syra vid 1 mmol/L slutliga koncentrationer tillsatts till mediet för att aktivera RXRα och PPARα nukleära hormonreceptorer, respektive). Seed 293T-NE i 1 brunn vid en densitet på 1 x 104 celler.
OBS: Passage cellerna vid sub-sammanflödet med 0,25% trypsin. Räkna cellnumret och så ut cellerna till en lämplig densitet. - Inkubera cellen vid 37 °C, 5% CO2 i en fuktad inkubator i 24 timmar. Observera cellerna efter 24 timmar och fortsätt med infektion om cellerna är friska.
- Förbered infektionskomplexet som nämns i tabell 3, tillsätt HBV (HepG2.2.15 supernatantkoncentrat), DMSO, PEG8000 och infektionsmedium till 1,5 ml mikrocentrifugrör. Förbered CsA-beståndet genom att lösa upp det i DMSO till en koncentration på 5 mM och håll lagret på -20 ºC. Arbetslösningen för CsA är 5 μM. Seed 1 × 104 celler per brunn av 48-brunnsplattan. Tillsätt 100 μl HepG2.2.15 supernatantkoncentrat (innehållande HBV 1,5063 ×107 GEq/ml) för att infektera celler vid 150 GEq/cell.
- Tillsätt 500 μL av infektionskomplexet till varje brunn och inkubera cellerna vid 37 °C, 5% CO2 i befuktad inkubator i 24 timmar.
- Tvätta cellerna två gånger med 500 μl PBS innan du byter medium. Tillsätt 1 ml medium i varje brunn. Om celltillståndet är dåligt och vissa celler flyter ändrar du mediet direkt. Detta är dag 1 av infektion. Byt medium varannan dag.
- På dag 11, tvätta cellerna två gånger med 500 μl PBS och fixera cellerna med iskall metanol för immunfluorescens.
6. HepG2.2.15 co-kultur med HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE
- Tillsätt 1 ml/brunn på 0,1% gelatin till 5 brunnar av 6 välplatta. Inkubera plattan vid 37 °C i 2 timmar och kasta supernatanten. Inkubera plattan igen för ytterligare 2 h vid 37 °C för att helt torka brunnen.
- Frö 1 x 105 celler/brunn av HepG-NE i 2 brunnar, 293T-NE-3NRs i 2 brunnar och 293T-NE i 1 brunn av plattan. Frö 1 x 105 celler/brunn hepG2.2.15 på fem membranskär (24 mm, 0,4 μm pordiameter, obestruken) i en separat 6-brunnsplatta. Inkubera cellerna vid 37 °C, 5% CO2 i en fuktad inkubator i 24 timmar.
- Efter 24 h, om cellerna är alla vidhäftande och i gott skick, förbered dig för samkultur. Kassera mediet i 6-brunns- och cellmembraninsatserna. Placera membranskären med HepG2.2.15 i 6-brunnsplattan sådd med HepG-NE, 293T-NE-3NRs och 293T-NE av pincett. Inkubera cellen vid 37 °C, 5% CO2 i en fuktad inkubator, byt medium var 3-4 dagar.
OBS: Ställ in följande grupper: Well 1: 293T-NE co-culture med HepG 2.2.15; Tja 2: HepG2-NE co-kultur med HepG 2.2.15; Brunn 3: 293T-NE-3NRs co-culture med HepG2.2.15; Tja 4: HepG2-NE co-kultur med HepG 2.2.15 (lägg till CsA); Tja 5: 293T-NE-3NRs co-kultur med HepG2.2.15 (lägg till CsA); Tillsätt hela medium till brunn nummer 1, 2 och 3, tillsätt mediet med 5 μM CsA till brunn nummer 4 och 5 väl, ca 9 ml för varje brunn, se till att mediet är i kontakt för att viruspartiklar att migrera från transwells att infektera celler. - Efter 10 dagar, ta bort membraninsatserna, tillsätt PBS till 6-brunnsplattan och tvätta försiktigt två gånger, fixera cellerna med iskall metanol för immunfluorescens.
7. Utför immunofluorescens för HBcAg
- Fäst cellerna med iskall metanol vid -20 °C i mer än 3 timmar. Tvätta cellerna med PBS i 10 min vid rumstemperatur på shaker, upprepa i 3 gånger.
- Tillsätt 5% BSA (100 μL/48-väl-platta, 500 μL/6-väl-platta), skaka på horisontell shaker för 1 h vid 40 varv/min och rumstemperatur.
- Tillsätt HBcAgs primära antikroppslösning (primär antikropp: 5% BSA-lösning =1:200, 100 μL / 48-brunnsplatta, 500 μL / 6-brunnsplatta), skaka över natten vid 4 °C.
- Tvätta brunnarna med PBST (PBS med 0,1% tween 20), i 10 min vid rumstemperatur på shaker, upprepa i 3 gånger.
- Tillsätt den andra antikroppslösningen (594 märkt antikropp upp på get mot kanin IgG: PBS = 1:1000, 100 μL /48-brunnsplatta, 500 μL / 6-brunnsplatta), täck plattan med folie och skaka i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta igen med PBST i tre gånger, skaka i 10 min vardera.
- Tillsätt 1 μg/mL DAPI, skaka i 2 min. Tvätta två gånger med PBST på en shaker i 5 min vardera. Kassera PBST. Tillsätt PBS och observera under immunofluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi konstruerade pSIN-NTCP-EGFP plasmid uttrycker NTCP och EGFP fusion och med puromycin motstånd. plasmid var transfected i HepG2 och 293T celler att konstruera stabila cellinjer HepG2-NE och 293T-NE uttrycker NTCP och EGFP. Plasmider (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-flag) med puromycinresistens och uttryck transfekterades i 293T-NE-celler för att konstruera en stabil cellinje som uttrycker 4 värdgener9. Uttrycket av NTCP-EGFP kan observeras genom grön fluorescens och verifieras av qPCR och western blot (data visas inte, men se tidigare arbete 9).
Primära antikroppar av HBcAg och DAPI inkuberas med fasta celler visade en distinkt färgning när de observeras med 10x mål på en fluorescerande inverterad mikroskop. Kärnlokalisering bekräftades genom färgning med DAPI (Figur 3 och figur 4-den tredje kolumnen). NTCP-EGFP uttrycks på cellmembranet och kan placeras med grön fluorescens (figur 3 och figur 4-den andra kolumnen). Uttrycksplatserna för HBcAg kan placeras med röd fluorescens (figur 3 och figur 4-den första kolumnen). När DAPI, NTCP och HBcAg finns i samma cell betyder det att cellen har smittats med HBV (figur 3 och figur 4-den sista kolumnen).
CsA-gruppen var den negativa kontrollen. CsA hindrade HBV från att komma in i celler genom att blockera NTCP. Som en positiv kontroll kan infekterade HepG2-NTCP-EGFP-celler uttrycka HBcAg. HBcAg upptäcktes i 293T-NE-3NRs celler men inte i 293T-NE celler, vilket indikerar NTCP är inte den enda faktor som är nödvändig för HBV infektion i 293T. Immunofluorescens av celler infekterade med HepG2.2.15 supernatant koncentrat var samma som för celler co-odlade med HepG2.2.15 cell. Det visade att HBcAg uttrycktes i 293T-NE-3NRs och HepG2-NE celler, tyder detta på att de fyra värd gener (NTCP, HNF4α, RXRα och PPARα) underlättar HBV infektion. Men signaler för HBcAg i 293T-NE-3NRs var lägre jämfört med HepG2-NE, vilket tyder på HBV infektion kan också påverkas av andra värdfaktorer.
| Kvantitativ referens | Kvantitativ referens | Kvantitativ referens | Kvantitativ referens | Negativ kontroll | HBV positiv kontroll | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | Ingen | 12.3865 |
| GEq/mL | 2*10^3 | 2*10^4 | 2*10^5 | 2*10^6 | —— | —— |
Tabell 1: Ct-värden för de kvantitativa referenserna.
| HepG 2.2.15 Supernatanten |
1/20 HepG 2.2.15 Koncentrera sig |
HepG 2.2.15 Koncentrera sig |
|
| Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
| GEq/mL | 1.65*10^4 | 7.53*10^5 | 1,5*10^7 |
Tabell 2: Ct-värden för HBV DNA som erhållits från HepG2.2.15 supernatant. Värden representerar Ct-värden för HBV DNA som erhållits från original supernatant, 1/20 utspädning eller dess koncentrat.
| 293T-NE | HepG2-NE | 293T-NE-3NRs | |||
| Hbv | Hbv | HBV+CsA | Hbv | HBV+CsA | |
| HBV GEq/cell | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| HBV μL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CsA μL (5 μM) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| DMSO μL | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
| 40 % PEG8000 μL | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Infektion medium μL | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
| Totalt μL | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
Tabell 3: Infektionskomplex. Den totala volymen som användes var 500 μL. Cyclosporine A användes som en negativ kontroll.
Figur 1: En grafisk representation av protokollet. HepG2.2.15 var antingen co-odlade med 293T-NE-3NRs och infektion observerades med hjälp av immunofluorescensmikroskopi eller supernatant som innehåller viral partiklar koncentrerades och infördes i 293T-NE-3NRs odlade celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: HBV-standardkurvan beräknad utifrån Ct-värdena. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: HepG2.2.15 supernatant koncentrat användes för att infektera 293T-NE, 293T-NE-3NRs och HepG2-NE celler med 150 GEq per cell. HBcAg uttryck identifierades genom immunofluorescens analys. HBcAg uttrycktes i 293T-NE-3NRs och HepG2-NE celler, medan, inget uttryck observerades i dessa celler behandlas med CsA (HBV inträdeshämmare) och 293T-NE celler. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: 293T-NE, 293T-NE-3NRs och HepG2-NE co-cultured med HepG2.2.15 celler. HBcAg uttryck identifierades genom immunofluorescens analys. HBcAg uttrycktes i 293T-NE-3NRs och HepG2-NE celler, medan, inget uttryck observerades i dessa celler behandlas med CsA (HBV inträdeshämmare) och 293T-NE celler. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här introducerar vi protokoll för HBV infektion i icke-lever 293T-NE-3NRs och hepatoma-baserade HepG2-NE celler. 293T-NE-3NR var lämpliga för HBV-infektion vid både hög och låg GEq. Följande kritiska åtgärder måste beaktas när du använder vårt protokoll. Cellstatus är en viktig faktor för en lyckad infektion. Infektionsmediet måste ändras i tid efter den inledande perioden av HBV-infektion. 293T-NE-3NRs celler är vanligtvis bräckliga efter infektion med hög viral titers. Därför måste dessa celler tvättas försiktigt för att undvika att lossa cellerna efter 24 h infektion. När du använder membranskär för kultur måste vi se till att den ursprungliga sådensiteten är lämplig, och kammaren är tillräckligt nedsänkt i media för att säkerställa effektiv fastsättning av viruspartiklar till 293T-NE-3NRs-cellerna. För att upptäcka HBcAg måste vi tvätta cellerna försiktigt före fixering för att undvika falska positiva signaler. Försiktighet måste iakttas under tvättsteg som 293T celler tenderar att lossna från botten.
Infektera 293T-NE-3NRs av HBV är inte så lätt som NTCP-uttryck hepG2. Till skillnad från HepG2, dessa celler är lätta att lossna från botten av plattan under kulturen. Och dessa celler är mer bräcklig än HepG2 efter infektion med DMSO och PEG8000 eller co-kultur med HepG2.2.15 för 10 dagar utan passaging. Därför måste vi belägga plattan med 0,1% gelatin och utsäde lämpligt cellnummer i plattan. Mer försiktighet bör iakttas för att förhindra att cellerna lossnar under byte av medium, tvättning eller fixering av cellerna.
Jämfört med traditionella HBV infektionsmetoder, antog vi en konstruerad 293T cellinje, 293T-NE-3NRs, som infektion modell och co-odlade det med HepG2.2.15. Intressant nog var 293T-NE-3NRs celler framgångsrikt infekterade med HBV även vid låga GEq som härmar naturliga fysiologiska förhållanden mer exakt. Modellering HBV infektion i 293T-NE-3NRs är ett användbart komplement till den traditionella på grund av att nonhepatic bakgrunden av dessa celler. Tillämpningen av metoden kan hjälpa oss att identifiera de nya värdfaktorerna även om infektionseffektiviteten hos denna metod inte är lika hög som den traditionella. Vi tror att de in vitro-modeller som presenteras i detta manuskript kommer att bidra till att underlätta nya upptäckter inom området.
En begränsning till denna metod är infektionseffektiviteten. In vitro HBV-infektionen är inte lika lätt som in vivo. Nuvarande in vitro-modeller för HBV är begränsade på grund av deras dåliga känslighet för HBV-infektion, där extremt hög inokulat krävs för att initiera infektion och det inte finns någon uppenbar virusspridning10. Detta står i skarp kontrast till in vivo observationer där en enda HBV virion kan infektera en stor del av hepatocyter på bara veckor11,12. Identifiering av nya värdfaktorer som påverkar HBV-replikering är därför till stor nytta för att främja vår förståelse av HBV och värdinteraktioner. Dessutom, genom att härma in vivo lever eller njure utveckling, funktionella organoider kan genereras som skulle närmare rekapitulera den fysiologiska funktionen hos en mänsklig lever eller njure13,14. Detta skulle avsevärt öka vår förståelse av HBV infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81870432 och 81570567 till X.L.Z.), (nr 81571994 till P.N.S.), Forskningsfonden för internationella unga forskare (nr 81950410640 till W.I.); Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 till P.N.S.). Vi vill tacka prof. Stanley Lin från Shantou University Medical College för användbara råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
