Summary
Bu el yazması, insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα'yı ifade eden 293T-NE-3NR' ler ve geleneksel hepatik hücreler (HepG2-NE, insan NTCP'yi ifade eden) yeni mühendislik temalı 293T hücreleri (293T-NE-3NR) enfeksiyonu için ayrıntılı bir protokol açıklar.
Abstract
HBV esas olarak insan heatositlerini enfekte eder, ancak böbrek ve testis gibi ekstrahepatik dokulara da bulaşabilmekte bulunmuştur. Bununla birlikte, hücre bazlı HBV modelleri hepatoma hücre hatları ile sınırlıdır (HepG2 ve Huh7 gibi) fonksiyonel BIR HBV reseptörü aşırı ifade, sodyum taurokolate co-transporting polipeptid (NTCP). Burada 293T-NE-3NR (293T aşırı insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα) ve HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) model hücre hatları olarak kullandık. Bu hücre hatlarındaki HBV enfeksiyonu ya HepG2.2.15'teki konsantre HBV virüs parçacıkları kullanılarak ya da hepg2.2.15'i hedef hücre hatları ile birlikte örme ile gerçekleştirildi. HBV enfeksiyonunu doğrulamak için HBcAg immünoresans iması yapıldı. Burada sunulan iki yöntem, hepatik olmayan hücre hatlarında HBV enfeksiyonu çalışmamıza yardımcı olacaktır.
Introduction
Hepatit B 2 milyardan fazla insanın hayatını etkiler ve halk sağlığıiçin en büyük tehditlerden biridir. Yaklaşık 257 milyon kişi kronik hepatit B virüsü ile enfekte (HBV) dünya çapında, toplum için büyük bir yük neden1. Hepatositler hbv ve diğer hücreler tarafından enfekte olmayan karaciğer dokusu, böbrek ve testis gibi enfekte sadece hücreler değildir, ayrıca bu virüs tarafından enfekte2,3. Şu anda, HBV enfeksiyon hücre modelleri sadece birkaç non-hepatik hücre hattı modelleri ile insan hepatositleri ile sınırlıdır. Bu, hepatik olmayan dokuların HBV enfeksiyonu ve HBV ile ilişkili patolojisinin çalışmasını engellemektedir. Burada hepatik olmayan 293T hücrelerinde ve hepatom bazlı hücrelerde HBV enfeksiyonu incelemek için protokoller salıyoruz.
Sodyum taurokolate co-transporting polipeptid (NTCP) insan hepatit B ve hepatit D virüsü için fonksiyonel bir reseptördür4. Hepatosit nükleer faktör 4α (HNF4α), retinoid X reseptörα (RXRα) ve peroksizom proliferator aktive reseptör α (PPARα) HBV viral tropizmkısıtlar karaciğer zenginleştirilmiş transkripsiyon faktörleridir. HbV pregenomik RNA sentezini teşvik etmek ve nonhepatom anormal hücre hattı5HBV replikasyonunu desteklemek için doğrulanmıştır. NTCP (HepG2-NE), NTCP (293T-NE) ve dört konak geni ifade eden 293T hücre hattını ifade eden HepG2 hücre hattı olmak üzere üç farklı hücre hattı inşa ettik; NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα (293T-NE-3NR). HBV enfeksiyonu için 293T-NE-3NR(Şekil 1)temel alınabilmektedir. İlk yöntem 293T-NE-3NR'de yüksek viral genom eşdeğerliği (yüksek GEq (150), DMSO ve PEG8000) 24 saat boyunca aşılama yöntemidir. İkinci yöntem, HBV partiküllerini (düşük GEq (yaklaşık 1,83) DMSO ve PEG8000 olmadan üretebilen ve böylece doğal koşulları yakından taklit eden HepG2.2.15'li 293T-NE-3NR'leri ortak olarak kullanır.
HepG2.2.15 hücreleri HepG2 hattından elde edilir ve kronik olarak enfeksiyöz HBV salgılar, ayrıca kültür ortamına subviral partiküller6,7. Siklosporin A (CsA) klinik olarak ksenogreft rekontisyonunun bastırılmasında kullanılan bir immünsupresandır. Çalışmalar, CsA'nın NTCP'nin taşıyıcı aktivitesini inhibe ederek ve NTCP'nin büyük zarf proteinlerine bağlanmasını engelleyerek HBV'nin kültürlü hepatositlere girişini engellediğini göstermiştir8.
HepG2-NE hücreleri pozitif kontrol olarak, CsA tedavi edilen hücreler ise negatif kontrol olarak kullanıldı. Pozitif ve negatif kontrol grupları ile karşılaştırarak, hangi konak genlerin HBV enfeksiyonunda kritik bir rol oynadığını bulabiliriz. Ayrıca, HBV enfeksiyonu bu modu ile, biz de diğer yeni mekanizmalar veya EV sahibi genler HBV enfeksiyonu dahil bulabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kültür, HepG2.2.15 hücrelerinden süpernatants toplama ve HBV enfeksiyonu ülkedeki biyogüvenlik rehberliğine göre biyogüvenlik düzeyi II (P2) veya biyogüvenlik seviyesi III (P3) laboratuvarında yapılmalıdır. Laboratuvar personelinin güvenliğini sağlamak için laboratuvar güvenlik uygulamaları takip edilmeli ve HBV deneyleri yapmadan önce tüm aşılar ve HBsAb pozitif saptanmalıdır. Bir sonraki adıma geçmeden önce her adımda hücrelerin durumunu gözlemleyin. Shantou Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun onayı doğrultusunda insan serumu örnekleri kullanılmıştır.
1. HepG2.2.15 hücre kültürü
NOT: HepG2.2.15 hücre supernatant, HepG2.2.15 hücre supernatant konsantresi ve HepG2.2.15 ile temas eden tüm ipuçları, şişeler, plakalar ve tüpler bir gecede %2 virucide batırıldıktan sonra bertaraf edilmelidir.
- HepG2.2.15 hücrelerini içeren şişeyi sıvı nitrojenden çıkarın ve şişeyi 37 °C'lik bir su banyosunda hafifçe döndürerek çözülün.
NOT: Kontaminasyon olasılığını azaltmak için kapağı sudan uzak tutun. Erime hızlı olmalıdır (yaklaşık 2 dk). - Hücreler çözülür çözülmez şişeyi su banyosundan çıkarın ve %70 etanol ile dezenfekte edin.
NOT: Bu noktadan itibaren sıkı aseptik koşullar altında tüm adımları gerçekleştirin. - Hücreleri 25 cm2 doku kültürü şişesine aktarın ve 4 mL tam kültür ortamı ekleyin (DMEM %10 FBS, penisilin 100 U/mL, streptomisin 0.1 mg/mL içerir). Hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 CO2ile kuluçkaya yatırın.
2. HepG2.2.15 hücre kültürünün toplanması supernatant
- Kültür HepG2.2.15 hücre T25 şişeleri 37 °C, 5% CO2 nemli bir kuluçkamakinesinde . Ortamı her 3 günde bir değiştirin.
- Hücre supernatant bir 50 mL santrifüj tüp toplayın. Kapağı sıkıca kapatın ve bir parafin filmi ile sarın.
- HBV virüslerini aktif tutmak için HepG2.2.15 supernatant'ı -20 °C'de saklayın.
3. Konsantre HepG2.2.15 supernatant
- HepG2.2.15 supernatant'ı -20 °C'den çıkarın ve 4 °C'de çözülün.
- Hücre parçalarını çıkarmak için, HepG2.2.15 supernatant'ı 0,45 m membranile yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne filtreleyin. Önce, virüsü filtrelemeden önce 10 mL DMEM DMEM filtreleyerek filtreyi engelleyin, ardından hücre kültürünü supernatant filtreleyin.
- Virüs konsantratörü sütununa 14 mL filtrelenmiş supernatant ekleyin ve kapağı kapatın. Sütunu 3.200 x g'de, 35 dk'lık yatay bir dönme santrifüjünde santrifüj edin. HepG2.2.15 supernatant konsantresini (yaklaşık 200 μL) 1,5 mL'lik bir tüpe toplayın.
- 200 μL DMEM ekleyerek kolonu DMEM ile bir kez yıkayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe toplayın.
4. Süpernatant konsantrede HBV DNA'sının saptanması
- Kuru blok ısıtıcıyı açın ve sıcaklığı 100 °C'ye ayarlayın.
- HepG2.2.15 supernatant konsantresindeki HBV DNA konsantrasyonunun standart eğri aralığında olmasını sağlamak için, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte 190 μL DMEM'e 10 μL HepG2.2.15 süpernatant konsantresi ekleyerek konsantreyi 20 kat seyreltin. 200 μL HepG2.2.15 supernatant ekleyin, negatif kontrol (sağlıklı donörden HBV-negatif serum), HBV pozitif kontrol (HBV-pozitif serum HBV hastasından) ve kitte verilen kantitatif referansların dört seyreltilmesi (2.0 x 106, 2.0 x 105, 2.0 x 104, 2.0 x 103 GEq /mL), sırasıyla 1.5 mL mikrosanfurige tüpü ayırmak için.
- Kitten 450 μL HBV DNA ekstraksiyon tamponu ekleyin yukarıdaki sekiz 1,5 mL tüpün tümüne, girdap 15 s'ye ve 10 s. 100 °C'de kuru blok ısıtıcıda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığında 5 dk için 12, 000 x g centrifuge.
- Buz üzerine yerleştirilen PCR tüplerine 27 μL PCR ana karışımı ve 3 μL Taq polimeraz enzimi ekleyin.
NOT: Kitte sağlanan PCR ana karışımı, HBV DNA'sının korunmuş bölgesine karşı astariçerir. - Buz üzerine yerleştirilen PCR tüplere 20 μL santrifüjlü süpernatant sıvı ekleyin. Sıkıca kaplayın ve 10 s için aşağı spin.
- Gerçek zamanlı bir PCR makinesinde aşağıdaki koşulları kullanın: 2 dk için 93 °C, 45 s için 93 °C'nin 10 döngüsü ve ardından 60 s için 55 °C; daha sonra 30 s için 93 °C 30 döngüleri ve gerçek zamanlı PCR yürütmek için 45 s için 55 °C izledi.
NOT: Ticari kitte yer alan ana karışım, HBV DNA'sının korunmuş bölgesine karşı astara sahiptir. - Elde edilen Ct değerlerini dışa aktarın ve Tablo 1 ve Şekil 2'degösterildiği gibi standart bir eğri oluşturun.
- Standart eğriye göre, HepG2.2.15 supernatant konsantresinin HBV DNA konsantrasyonu Tablo 2'degösterildiği gibi seyreltilmiş 20x hesaplayAbilirsiniz. HepG2.2.15 süpernatant konsantresinin HBV DNA konsantrasyonunun hesaplanması(Tablo 2).
- HepG2.2.15 supernatant konsantresini aliquotlarda bölün ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
5. HepG2-NE ve 293T-NE-3NR hücrelerinin in vitro enfeksiyonu
- DMEM/F-12'de aşağıdaki enfeksiyon ortamını hazırlayın: %10 FBS, 4 mM glutamin takviyesi, 0.1 mM NEAA, 1 mM Sodyum pirüvat, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 1 μg/mL puromisin, 40 ng/mL deksametazon, 20 g/mL hidrokortizon ve 5 g/mL insülin. 4 °C'de saklayın.
NOT: Bu NTCP pozitif hücreler puromisin dirençli9. - 48 iyi plakalı 5 kuyuya %0,1 jelatin, her kuyuya 200°L ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın, süpernatant'ı atın. Plakayı 37 °C'de 2 saat daha kuluçkaya yatırın.
- Tohum HepG2-NE 2 kuyuda 1 x 104 hücre yoğunluğunda. 2 kuyuda 1 x 104 hücre yoğunluğunda tohum 293T-NE-3NR hücreleri (sırasıyla RXRα ve PPARα nükleer hormon reseptörlerini etkinleştirmek için ortama 1 μmol/L'de tüm trans retinoik asit ve 1 mmol/L son konsantrasyonlarda klofibrik asit eklendi). Tohum 293T-NE 1 iyi 1 x 104 hücre yoğunluğunda.
NOT: Hücreleri %0,25 tripsin kullanarak alt kesişme noktasından geçirilmesi. Hücre numarasını sayın ve hücreleri uygun bir yoğunluğa tohumlayın. - Hücreyi 37 °C,%5 CO2 nemli bir kuluçka makinesinde 24 saat kuluçkaya yatırın.
- Tablo 3'tebelirtildiği gibi enfeksiyon kompleksini hazırlayın, HBV (HepG2.2.15 supernatant konsantresi), DMSO, PEG8000 ve enfeksiyon orta ila 1.5 mL mikrosantrifüj tüp ekleyin. CsA stoğunu DMSO'da 5 mM'lik bir konsantrasyona kadar eriterek hazırlayın ve stoku -20 ºC'de tutun. CsA'nın çalışma çözümü 5 μM'dir. Tohum 1 × 104 hücreleri 48-iyi plaka iyi başına. 150 GEq/hücredeki hücrelere bulaşmasını sağlamak için 100 μL HepG2.2.15 supernatant konsantre (HBV 1.5063 ×107 GEq/mL içeren) ekleyin.
- Her kuyuya enfeksiyon kompleksinin 500 μL'sini ekleyin ve hücreleri 37 °C,%5 CO2 nemli inkübatörde 24 saat kuluçkaya yatırın.
- Ortamı değiştirmeden önce hücreleri 500 μL PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 1 mL orta ekleyin. Hücre durumu zayıfsa ve bazı hücreler kayansa, ortamı doğrudan değiştirin. Bu enfeksiyonun ilk günü. Orta yı 2 günde bir hafifçe değiştirin.
- 11. günde hücreleri 500 μL PBS ile iki kez yıkayın ve immünoresans için hücreleri buz gibi metanol ile düzeltin.
6. HepG2.2.15 hepg2-NE / 293T-NE-3NR / 293T-NE ile ortak kültür
- 6 kuyuluk 5 kuyuya %0,1 jelatin 1 mL/kuyu ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın ve süpernatantı atın. 37 °C'de 2 saat daha tekrar inkübe edin ve kuyuyu tamamen kurutun.
- Tohum 1 x 105 hücreleri /iyi HepG-NE içine 2 kuyu, 2 93T-NE-3NR içine 2 kuyu içine, ve 293T-NE plaka içine 1 kuyu içine. Tohum 1 x 105 hücreleri/kuyusu HepG2.2.15 beş membran kesici uçüzerine (24 mm, 0.4 m gözenek çapı, kaplamasız) ayrı bir 6 kuyu plakası. Hücreleri 37 °C,%5 CO2 nemli bir kuluçka makinesinde 24 saat kuluçkaya yatırın.
- 24 saat sonra, hücrelerin tüm yapışık ve iyi durumda ise, co-kültür için hazırlayın. 6-iyi plaka ve hücre zarı ekler orta atın. HepG2.2.15 ile membran kesici uçları, cımbızla HepG-NE, 293T-NE-3NR ve 293T-NE ile tohumlanmış 6 kuyu plakasına yerleştirin. Hücreyi 37 °C'de, %5 CO2'yi nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın, her 3-4 günde bir ortayı değiştirin.
NOT: Grupları aşağıdaki gibi ayarlayın: Peki 1: 293T-NE hepg 2.2.15 ile ortak kültür; Peki 2: HepG 2.2.15 ile HepG2-NE ortak kültür; Peki 3: HepG2.2.15 ile 293T-NE-3NR ortak kültür; Peki 4: HepG 2.2.15 ile HepG2-NE co-kültür (CsA ekleyin); Peki 5: 293T-NE-3NRs ortak kültür HepG2.2.15 (CsA ekleyin); 1, 2 ve 3 numaralı tüm ortamı ekleyin, 5 μM CsA'yı 4 ve 5'e iyi, her kuyu için yaklaşık 9 mL'ye ekleyin, virüs partiküllerinin transwelllerden hücrelere bulaşması için ortamın temas halinde olduğundan emin olun. - 10 gün sonra, membran kesici uçlarını çıkarın, 6-iyi plakaya PBS ekleyin ve iki kez hafifçe yıkayın, immünofloresans için buz gibi metanol ile hücreleri düzeltin.
7. HBcAg için immünoresans gerçekleştirin
- Hücreleri buz gibi metanol ile -20 °C'de 3 saatten fazla tonu atın. Hücreleri 10 dakika boyunca Oda sıcaklığında çalkalayıcı da PBS ile yıkayın, 3 kez tekrarlayın.
- %5 BSA (100 μL/48-iyi plaka, 500 μL/6-iyi plaka), 40 rpm ve oda sıcaklığında 1 saat yatay shaker sallayın ekleyin.
- HBcAg primer antikor çözeltisi ekleyin (primer antikor: %5 BSA çözeltisi =1:200, 100 μL / 48-iyi plaka, 500 μL / 6-iyi plaka), 4 °C'de bir gecede sallayın.
- PBST (PBS% 0.1 ara 20 ile) ile kuyuları yıkayın, shaker oda sıcaklığında 10 dakika için, 3 kez tekrarlayın.
- İkinci antikor solüsyonu ekleyin (tavşan IgG karşı keçi yükseltilmiş 594 etiketli antikor: PBS = 1:1,000, 100 μL /48-iyi plaka, 500 μL / 6-well-plaka), folyo ile plaka kapağı ve oda sıcaklığında 2 saat sallayın.
- Üç kez PBST ile tekrar yıkayın, her biri 10 dakika sallayın.
- 1 μg/mL DAPI ekleyin, 2 dk. Her biri 5 dk çalkalayıcı üzerinde PBST ile iki kez yıkayın. PBST'yi atın. PBS ekleyin ve immünofloresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PSIN-NTCP-EGFP plazmidini ifade eden NTCP ve EGFP füzyonu ve püromisin direnci ni inşa ettik. Plazmid, HepG2-NE ve 293T-NE hücre hatları ntcp ve EGFP ifade kararlı hücre hatları oluşturmak için HepG2 ve 293T hücrelerine transfeced oldu. Pomisin direnci ve ekspresyonu olan plazmidler (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-flag) 293T-NE hücrelerine dönüştürülerek 4 konak geni ifade eden kararlı bir hücre hattı oluşturmak için9. NTCP-EGFP ifadesi yeşil floresan tarafından gözlemlenebilir ve qPCR ve western blot tarafından doğrulanabilir (veriler gösterilmez, ancak önceki çalışmaya bakın 9).
Sabit hücrelerle inkübe edilen HBcAg ve DAPI primer antikor, floresan ters mikroskopta 10x nesnel kullanılarak gözlendiğinde belirgin bir lekelenme göstermiştir. Nükleer lokalizasyon DAPI ile boyanarak doğrulandı(Şekil 3 ve Şekil 4-üçüncü sütun). NTCP-EGFP hücre zarında ifade edilir ve yeşil floresan(Şekil 3 ve Şekil 4-ikinci sütun) ile bulunabilir. HBcAg'nin ekspresyon bölgeleri kırmızı floresan(Şekil 3 ve Şekil 4-ilk sütun) ile bulunabilir. DAPI, NTCP ve HBcAg aynı hücrede olduklarında, hücrenin HBV(Şekil 3 ve Şekil 4-son sütun) ile başarılı bir şekilde enfekte olduğu anlamına gelir.
CsA grubu negatif kontroldü. CsA, NTCP'yi engelleyerek HBV'nin hücrelere girmesini engelledi. Pozitif kontrol olarak, enfekte HepG2-NTCP-EGFP hücreleri HBcAg'yi ifade edebilir. HBcAg 293T-NE-3NR hücrelerinde saptandı, ancak 293T-NE hücrelerinde saptanmadı, bu da NTCP'nin 293T'deki HBV enfeksiyonu için gerekli olan tek faktör olmadığını gösteriyor. HepG2.2.15 supernatant konsantresi ile enfekte olan hücrelerin immünoresansı HepG2.2.15 hücresi ile birlikte kültürlenmiş hücrelerinkiyle aynıydı. HBcAg'nin 293T-NE-3NR ve HepG2-NE hücrelerinde ifade edildiğini göstermiştir, bu da dört konak genin (NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα) HBV enfeksiyonunu kolaylaştırdığını göstermektedir. Ancak 293T-NE-3NR'deki HBcAg sinyalleri HepG2-NE'ye göre daha düşüktü ve HBV enfeksiyonunun diğer konak faktörlerden etkilenebileceğini gösteriyordu.
| Nicel referans | Nicel referans | Nicel referans | Nicel referans | Negatif kontrol | HBV pozitif kontrol | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Ct | 20.1527 | 17.6647 | 14.5816 | 12.0409 | Hiçbiri | 12.3865 |
| GEq/mL | 2*10^3 | 2*10^4 | 2*10^5 | 2*10^6 | —— | —— |
Tablo 1: Nicel referanslar için Ct değerleri.
| HepG 2.2.15 supernatant |
1/20 HepG 2.2.15 Konsantre |
HepG 2.2.15 Konsantre |
|
| Ct | 17.716 | 13.1556 | —— |
| GEq/mL | 1.65*10^4 | 7.53*10^5 | 1.5*10^7 |
Tablo 2: HepG2.2.15 supernatant'tan elde edilen HBV DNA'sının ct değerleri. Değerler, orijinal supernatant, 1/20 seyreltme veya konsantresinden elde edilen HBV DNA'sı için Ct değerlerini temsil emzdir.
| 293T-NE | HepG2-NE | 293T-NE-3NR | |||
| Hbv | Hbv | HBV+CsA | Hbv | HBV+CsA | |
| HBV GEq/hücre | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| HBV μL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CsA μL (5 μM) | 0 | 0 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| DMSO μL | 10 | 10 | 9.5 | 10 | 9.5 |
| %40 PEG8000 μL | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Enfeksiyon orta μL | 340 | 340 | 340 | 340 | 340 |
| Toplam μL | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
Tablo 3: Enfeksiyon kompleksi. Kullanılan toplam hacim 500 μL. Siklosporin A negatif kontrol olarak kullanıldı.
Şekil 1: Protokolün grafiksel gösterimi. HepG2.2.15 ya 293T-NE-3NR ile birlikte kültürlenmiş ve immünoreskans mikroskobu kullanılarak enfeksiyon gözlendi veya viral partiküller içeren süpernatant konsantre edilip 293T-NE-3NR kültürlü hücrelere sokuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ct değerlerinden hesaplanan HBV standart eğrisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 293T-NE, 293T-NE-3NR ve Hücre başına 150 GEq ile HepG2-NE hücrelerini enfekte etmek için HepG2.2.15 süpernatant konsantre si kullanıldı. HBcAg ekspresyonu immünoresans teşrisi ile saptandı. HBcAg 293T-NE-3NR ve HepG2-NE hücrelerinde ifade edilirken, CsA (HBV giriş inhibitörü) ve 293T-NE hücreleri ile tedavi edilen bu hücrelerde ekspresyon gözlenmedi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 293T-NE, 293T-NE-3NR ve HepG2-NE hepg2.2.15 hücreleri ile birlikte kültürlü. HBcAg ekspresyonu immünoresans teşrisi ile saptandı. HBcAg 293T-NE-3NR ve HepG2-NE hücrelerinde ifade edilirken, CsA (HBV giriş inhibitörü) ve 293T-NE hücreleri ile tedavi edilen bu hücrelerde ekspresyon gözlenmedi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada hepatik olmayan 293T-NE-3NR ve hepatom bazlı HepG2-NE hücrelerinde HBV enfeksiyonu için protokoller sokulduk. 293T-NE-3NR hem yüksek hem de düşük GEq'da HBV enfeksiyonu için uygundu. Protokolümüzü kullanırken aşağıdaki kritik adımların göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Hücre durumu başarılı bir enfeksiyon için önemli bir faktördür. HBV enfeksiyonunun başlangıç döneminden sonra enfeksiyon ortamı zamanında değiştirilmelidir. 293T-NE-3NR hücreleri genellikle yüksek viral titreler ile enfeksiyon sonrasında kırılgandır. Bu nedenle, bu hücreler enfeksiyon 24 saat sonra hücreleri ayırmak önlemek için yavaşça yıkanmalıdır. Kültür için membran kesici uçlar kullanırken, ilk tohumlama yoğunluğunun uygun olduğundan emin olmalıyız ve 293T-NE-3NR hücrelerine viral partiküllerin verimli bir şekilde bağlanmasını sağlamak için oda ortama yeterince batırılmıştır. HBcAg'i tespit etmek için, yanlış pozitif sinyallerden kaçınmak için fiksasyondan önce hücreleri nazikçe yıkamamız gerekir. 293T hücreleri alttan ayırma eğiliminde olduğu için yıkama adımı sırasında dikkatli olunmalıdır.
293T-NE-3NR'yi HBV ile enfekte etmek NTCP ifade eden HepG2 kadar kolay değildir. HepG2 aksine, bu hücrelerin kültür sırasında plaka nın altından ayırmak kolaydır. Ve bu hücreler DMSO ve PEG8000 veya hepG2.2.15 ile birlikte 10 gün boyunca passaging olmadan birlikte kültür kullanılarak enfeksiyon dan sonra HepG2 daha kırılgandır. Bu nedenle plakayı %0,1 jelatin kaplamamız ve uygun hücre numarasını tabağa serilmeliyiz. Daha fazla dikkat hücreleri orta değiştirme sırasında detaching önlemek için alınmalıdır, yıkama veya hücreleri sabitleme.
Geleneksel HBV enfeksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında, enfeksiyon modeli olarak 293T-NE-3NR'ler gibi tasarlanmış 293T hücre hattını benimsedik ve HepG2.2.15 ile birlikte kültürlendik. İlginçtir ki, 293T-NE-3NR hücreleri, doğal fizyolojik koşulları daha doğru bir şekilde taklit eden düşük GEq'da bile HBV ile başarılı bir şekilde enfekte edildi. 293T-NE-3NR'lerde HBV enfeksiyonunun modellanması, bu hücrelerin hepatik olmayan arka planı nedeniyle geleneksel olanın yararlı bir tamamlayıcısıdır. Bu yöntemin enfeksiyon verimliliği geleneksel olduğu kadar yüksek olmasa da yöntemin uygulanması yeni konak faktörleri belirlemek için bize yardımcı olabilir. Bu el yazmasında sunulan in vitro modellerin in vitro modellerinin bu alanda yeni keşifleri kolaylaştıracağına inanıyoruz.
Bu yöntemin bir sınırlama enfeksiyon verimliliğidir. In vitro HBV enfeksiyonu in vivo kadar kolay değildir. HBV için mevcut in vitro modelleri hbv enfeksiyonu, son derece yüksek inocula enfeksiyon başlatmak için gerekli olan ve belirgin viral yayılmış10yoktur onların zayıf duyarlılık nedeniyle sınırlıdır. Bu tek bir HBV virion sadece hafta içinde hepatositlerin büyük bir kısmını enfekte edebilir in vivo gözlemler taban tabana zıttır 11,12. Bu nedenle, HBV replikasyonetkileyen yeni konak faktörlerin belirlenmesi HBV ve ev sahibi etkileşimleri anlayışımızı ilerletmek için büyük ölçüde yararlıdır. Ayrıca, in vivo karaciğer veya böbrek gelişimi taklit ederek, fonksiyonel organoidler daha yakından bir insan karaciğer veya böbrek fizyolojik işleyişini özetlemek istiyorsunuz oluşturulabilir13,14. Bu büyük ölçüde HBV enfeksiyonu anlayışımızı artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81870432 ve 81570567 X.L.Z.), (No. 81571994 P.N.S.), Uluslararası Genç Bilim Adamları Araştırma Fonu (No. 81950410640-W.I.); Li Ka Shing Shantou Üniversitesi Vakfı (No. L1111 2008 için P.N.S.). Shantou Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Prof. Stanley Lin'e faydalı tavsiyeler için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum (FBS) | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
