Summary
ここでは、標準的な機械式試験装置を用いて注射器針システムを通して物質の注入可能性を定量的に評価するためのプロトコルを提示する。
Abstract
注射用生体材料は、薬物および細胞の低侵襲送達にますます人気が高まっている。これらの材料は、典型的には、従来の水性注射よりも粘性であり、半固体であり、したがって、それらの注射可能性を想定することができない。本プロトコルは、標準機械試験機を用いてこれらの材料の注入可能性を客観的に評価する方法を説明する。シリンジプランジャーは、設定された速度でクロスヘッドによって圧縮され、力が測定されます。最大またはプラトー力値は、サンプル間の比較、または絶対力限界に使用できます。このプロトコルは、任意の材料、および任意の注射器と針のサイズまたは幾何学で使用することができます。得られた結果は、翻訳プロセスの早い段階で製剤、注射器および針のサイズに関する決定を行うために使用することができる。また、製剤の改質が注射性に及ぼす影響を定量化し、かつ一時的に変化する材料を注入するのに最適な時間を決定する。この方法は、材料に対する注射の効果を調べる再現性のある方法として、自己治癒やフィルタープレスなどの現象を研究したり、細胞に対する注射の影響を研究したりするのにも適している。このプロトコルは、回転流理よりも速く、より直接的に注入に適用可能であり、直接比較のためのキー値を得るために最小限の後処理を必要とします。
Introduction
生体材料はしばしば研究され、細胞ベースの組織再生のための足場として使用され、治療の標的化された持続的な送達のための貯蔵所1.この分野では、注射用生体材料は侵襲性が低いため人気が高まっており、移植に伴う感染、痛み、瘢痕化のリスクを軽減する。さらに、それらは通常、流体として適用されるので、それらは組織の欠陥に完全に適合し、そして薬物および細胞は、適用3、4、5の直前にそれらに混合されてもよい。そのため、注射用生体材料はプリロードされた注射器として製造される可能性がありますが、多くの場合、適用前に臨床医によって調製されます。例えば、セメントは粉末相と液相が混ざるとセットを開始し、6を使用する前に長期間保存することはできません。したがって、これらの材料の特性は時間依存性であり、それらの調製物と密接に関連している。
一般的な注射用生体材料は、カルシウムセメント、ポリメチルメタクリレート、バイオグラス、および様々なポリマーヒドロゲル3、7を含む。水と同じレオロジー特性を有する伝統的な薬物の注射とは異なり、これらの注射可能な生体材料は、典型的には、より粘性、非ニュートン、いくつかの弾性特性を有し、また、時間の経過とともに変化する可能性がある。したがって、これらの材料の注入可能性は想定できないが、実験的に評価されなければならない。注射に必要な力を定量化し、それを注射の容易さに関連付けることによって、どの生体材料製剤、注射器、および針のサイズを進めるかについての早期の決定は、発達プロセス8の早い段階で行われ得る。このような実験は、注射可能性9に対する製剤の変化の影響を定量化することもできる。
注射材料の特性を評価する方法はいくつかあります。回転性の耳動学は、しばしば、粘度、非ニュートン行動、ポスト剪断回復、設定時間、およびこれらの材料10、11、12の他の特性を評価するために利用される。このタイプのテストは材料の基本的な特性を確立するのに有用であるが、これらの特性は、注入性に直接相関しない。ニュートン流体と円筒状の注射器と針の場合、注入力はハーゲン-ポイズイユ方程式13の形から推定することができます。
ここでFは射出に必要な力(N)、Rsは内部シリンジ半径(m)、Rnは内部針半径(m)、Lは針長(m)、Qは流体流量(m3s-1)、動的粘度(Pa.s)η 及びFfはプランジャーとバレル壁(N)との間の摩擦力である(N)。これにより、回転流動論を介して粘度を測定すれば、注射器と針の寸法が既知であり、流量推定により、注入力を推定することができる。ただし、この方程式は、シリンジの円錐の端点や、中心外の出口などの他のジオメトリを考慮せず、Ffは機械的なテストによって実験的に推定または発見されなければなりません。さらに、生体材料は、典型的にはニュートンではなく、複雑なレオロジー特性を示す。単純なせん断間液の場合、方程式は14になります。
ここで nはパワー インデックス (-) で、Kはオストワルド・デ・ワールレ式の整合性指数 (Pa.sn)で 
、シア 
レート(s -1)はどこです。この複雑さは、レオロジー特性を持つ材料が2つの値で特徴づけることができない材料、特にセメントの設定などの時間依存材料に対して大きく増加します。さらに、材料特性がせん断依存性である場合、材料は針に予想されるせん断速度で試験されなければならないが、これは回転式流圧計15の範囲をはるかに超える可能性がある。
注入性を測定するもう一つの定量的方法は、注射を行っている間、圧力および変位センサーを注射器に取り付ける、手で、またはシリンジポンプを使用することを含む。この装置は比較的安価ですが、ユーザーはスクリプトとキャリブレーションカーブを生成してフォースデータ16に変換する必要があります。また、粘性または半固体材料を押し出すために高い力が必要な場合、シリンジポンプは、正確な速度でプランジャーを圧縮するのに十分なトルクを有していない可能性があります。あるいは、これらのセンサを手で注入する際に利用することは、臨床処置17の間に、実際の臨床シナリオで使用することができるように有用であり得る。しかし、これははるかに長い時間がかかり、ユーザーの偏見を引き起こす可能性があり、したがって、信頼性の高い結果を得るためには、異なるユーザーとの繰り返しの数が多くなる必要があります。したがって、翻訳パイプラインのさらに下にある材料、または既に臨床使用されている製品に対して、より適切である可能性があります。
このプロトコルでは、機械的テスターを使用してプランジャを設定速度で圧縮し、そのために必要な力を測定します。このタイプの機械式テスターは、材料研究所で一般的であり、様々な生体材料18、19、20、21、22、23、24の注射率を定量するために使用されています。このテストは、任意の材料を含む注射器および針の任意のサイズと幾何学で使用することができる。また、使用直前に作られる生体材料の場合には、検査の前に診療所や手術で使用されるであろう正確な製剤手順に従うことができる。この手順のさらなる利点は、比較的高速であるということです。機械式テスターをセットアップすると、押出速度とシリンジの体積に応じて、1時間で数十個のサンプルを研究できます。これは、通常、テストごとに少なくとも5〜10分かかり、負荷、平衡、洗浄時間を要する回転的な手理とは対照的です。機械式テスターを使用すると、プランジャー上で同等に信頼性の高い押出速度が生成され、粘性製剤または時間依存特性を有する製剤にとって特に有利です。テストの後、客観的な比較のために重要な値を引き出すために、データの後処理を最小限に抑える必要があります。
Protocol
1. サンプルの準備
- サンプルを準備し、シリンジにロードします。
- あらかじめロードされたシリンジをシミュレートするには、サンプルを事前に準備し、注射器にロードして針を取り付けます。テストまで、必要に応じて保管します。これは、時間とともに変化しないヒドロゲルおよび材料に適している可能性があります。
注:例えば、2%アルギン酸溶液を調製し、アルギン酸ナトリウム塩2gを100mLの脱イオン水に溶解し、室温で撹拌する。溶液を5mLの注射器に吸引し、室温で24時間保存する。 - あるいは、アプリケーションの直前に製剤化された注射をシミュレートするために、クリニックで行われるのと同じ方法でサンプルを調製し、任意の設定時間を可能にする。注射器にロードし、針を取り付けます。これはセメント、および特性が時間とともに変化する材料に適している可能性があります。
注:例えば、硫酸カルシウムセメントを調製するために、4gの硫酸カルシウムのヘミヒド和物を5mLの脱イオン水に1分間ヘラで手動で混合します。シリンジからプランジャーを取り出し、へらでシリンジバレルにセメントをロードします。4分後に機械検査を開始します。
注意:針は安全上のリスクを引き起こす、可能であれば鈍い針を使用する。材料に細胞または他の生物学的材料が含まれている場合は、鋭い傷害を防ぐために特別な注意を払う必要があります。
- あらかじめロードされたシリンジをシミュレートするには、サンプルを事前に準備し、注射器にロードして針を取り付けます。テストまで、必要に応じて保管します。これは、時間とともに変化しないヒドロゲルおよび材料に適している可能性があります。
2. 機械テスターをセットアップする
- 機械試験機に平板(圧縮試験用)を取り付けます。
- 手動で200 Nの最大負荷をロードセルを機械テスターに装備します。
注: 1 ~ 200 N の範囲で十分な精度を持っている場合は、より大きなロード セルを使用できます。より粘性があり、手で注入されることを意図していないサンプルは、より大きなロードセルを必要とするかもしれません。 - 手動制御ボタンを使用してプレートを分離し、針、注射器、プランジャー(約30cmで十分)に十分なスペースを確保します。
- テスト プロトコルを作成します。
- テスト ウィザードを開き、テストの種類を単軸圧縮に設定します。
- プリロードを設定します。これは、テストを開始する測定力の値です。0.5 Nで十分です。
- プリロード速度を5mm/分に設定します。これは、クロスヘッドがプリロードに遭遇するまで下に移動する速度です。
- 荷重を 変位制御に 設定し、適切なテスト速度を選択します。1 mm/sは標準的な5 mLのシリンジのための適切な速度である。
- テストを停止する 上限値 を設定します(例えば、200 N)。これは主に安全上の理由です。また、テストは、所定の変位、例えば、シリンジの長さで自動的に停止され得る。
3. クランプシステムの設定
- 2つのスタンドに2組のクランプを取り付け、選択したシリンジをしっかりとエンスコンスするのに十分な大きさのグリップを取り付けます。
- クロスヘッドとベースプレートの間にグリップを配置し、シリンジと針のグリップの下に十分なスペースを置きます。
- 2 つのグリップの中心を並べ、クロスヘッドの中心に並べてください。
注: クランプ グリップを相互に配置し、クロスヘッドの中心を調整するには時間と反復が必要ですが、高品質のデータを取得するには重要です。 - 下向きの力が加えられるとクランプに動きがないようにクランプがしっかりと固定されていることを確認します。
- 皿を底板に置き、押し出された材料を集める。
4. 注入性プロトコルを実行する
- クランプグリップにシリンジを挿入し、閉じます。グリップはシリンジを所定の位置に保持する必要がありますが、抵抗なしに上下に移動できるようにします。
- 注射器とプランジャがクロスヘッドに垂直であることを確認します。これにより、材料の単軸圧縮のみが測定されます。
注: ステップ 4.1 と 4.2 を確認するには、空のシリンジを使用する必要があります。 - 手動移動ボタンを使用して、トッププレートをプランジャーのすぐ上の位置に下げます。
注: メカニカル テスター プロトコルで開始位置を選択すると、プランジャより上の位置が自動的に到達し、テスト全体で一貫性が保たれます。 - [ゼロ フォース] をクリックして、測定したフォースをゼロにします。
- ' Run ' を押してテスト プロトコルを実行します。
注意:実験者は、各試験を観察するために常に存在し、事故の場合には緊急停止を活性化する準備ができている必要があります。 - 手動の移動ボタンを使用して、シリンジを取り外すことができるように、プレートを十分な高さに上げます。
- 各サンプルについて手順 4 を繰り返します。
注:この時点で、シリンジと押し出しサンプルは、それ以上の分析が必要ない場合は廃棄することができますが、フィルタープレス、自己修復、細胞への影響などを調べるために保持することができます。
5. データ収集
- 各試行のデータを、力と変位値の表を生成できる形式 (.txt、.xls、.xlsx) で保存します。
- X 軸上の変位と Y 軸の力を使用して、各試験の結果をプロットします。
- グラフから最大力(存在する場合)とプラトー力を読み取ります。
Representative Results
機械式テスターとクランプシステムのセットアップを 図1Aに示します。このプロトコルは、テストされた各サンプルのフォースと変位の表とグラフを生成します。一般的な力変位曲線は、3つのセクション(図1B):初期勾配は、プランジャーがバレルからの摩擦を克服し、材料が加速し、力の最大値、および高原の材料が定常状態で押し出されるので、初期勾配で構成されます。
しかし、プラトー力がプランジャーを加速するために必要な力よりも低い場合にのみ、明確な最大値が存在します。したがって、ピークは広い針を通過するインビシッドサンプルに対してのみ見られます。より狭いオリフィスを通過する粘性サンプルの場合、一定速度でサンプルを注入するために必要な力は、バレルの摩擦を克服し、材料を加速するために必要な力よりも大きく、明確なピークは見られない(図1C)。非常に粘性の高いサンプルまたは非常に狭い針の場合、材料を押し出すために必要な力は非常に大きいので、シリンジはバックルして失敗し、しばしば材料の押出はほとんどありません(図1D)。注入される材料に粒子が含まれているか、セメントのような設定を受けている場合、フィルター押下(液相の優先的な追放)またはバルク設定が発生し、不完全な注入につながる可能性があります(図1E)。
図1:このプロトコルによって生成されたサンプル曲線。(A) このプロトコルのメカニカルテスターのセットアップ。(B)典型的な力押出曲線。(C)最大ピークが明確なフォース押し出し曲線。(D) シリンジ故障の強制押し出し曲線。(E)設定セメントの強制押し出し曲線。この図はロビンソンら8.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
機械的なテストは、おそらく最も簡単で最も信頼性の高い方法で、注射感度を定量化します。このプロトコルの主な利点は、材料研究所で一般的である機械試験機以外に、特別な装置が必要な点です。このプロトコルは非常に汎用性が高い。任意の材料、針ゲージおよびシリンジサイズは、シリンジがクランプによって収容することができる場合に使用することができる。これは、10 mLまでの注射器のこのプロトコルで検証されています。また、実世界のアプリケーション25に対して、材料を正確に調製することができる。最後に、この手順は非常に高速で、1 サンプルあたり数分しかかからず、1 時間あたり数十個のサンプルを処理できます。
一般的な曲線を与えるサンプルの場合、最大力とプラトー力曲線の 2 つの値を抽出できます。最大力は間違いなくより客観的であり、各サンプルのデータテーブルから計算的に抽出することができます。逆に、高原力は、最も長い時間経験される力であり、平均して、大きな変動を伴う曲線の影響を受けにくいため、より代表的である可能性があります。これらの変動は、材料内の気泡や粒子が押し出し時に断続的な変化を引き起こしたり、小さな力測定のために低い機器精度によって引き起こされることがあります。しかし、多くのサンプルでは最大力ピークがなく、最大値とプラトー値が同じである点が注目に値する。一貫した値が使用されている限り、射出力間の客観的な比較を行うことができます。
取得したデータは、いくつかの方法で使用できます。注射力値を注射の容易さと比較して、翻訳のためにどの製剤、注射器および針サイズが実行可能かを確立する8.あるいは、サンプル間の比較は、注入可能性に関する製剤の変化の定量化を可能にする。例えば、セメントでは、液相の粘度を変化させ、粒度分布、およびクエン酸等の添加剤を添加してコロイド性を変化させ、注射性9に大きな変化を有することができる。これらの試験はまた、セメントの配合プロトコル、例えば混合時間、負荷時間、塗布時間を通知し、最適な注入および射出後の性能を得る。また、この方法は、3D印刷のための新規バイオインクの初期実現可能性をテストするために使用することができる。
このプロトコルは、いくつかの方法で変更できます。クランプシステムは、シリンジを保持するために別注の3Dプリント構造に置き換えられ、シリンジとプランジャーがクロスヘッドに垂直であり、シリンジがしっかりと保持されていることを確認しやすくなる可能性があります。針は、カニューレまたはプランジャーの圧縮によって材料を押し出す任意のデバイスに置き換えることができ、任意のサイズとジオメトリのことができます。結果の忠実度を高めるために、針の先端を組織またはヒドロゲルに入れることができ、臨床注射をより正確にシミュレートする。しかし、組織/ゲル組成と針深度を一定に保たなければならないため、プロトコルにさらに複雑さが加われます。また、このプロトコルは、変位制御押出を利用して、指定された速度での注入に必要な力を測定する。あるいは、射出力を指定し、押し出し量を時間に対して測定することができる。これは、セメントなどの時間依存性を持つ材料に役立ちます。例えば、射出力と注入性の容易さとの相関関係を用いて力8を選択し、このプロトコルは、セメントの全容を設定前にこの速度で注入できるかどうかを確立するために用いられ得る。最後に、このプロトコルは、材料特性に対する注入の効果をテストし、フィルタープレスや自己治癒、または細胞への注入の影響などの現象を調べるために、他の実験と簡単に組み合わせることができます。
このプロトコルの主な制限は、ユニバーサルメカニカルテスターが必要です。これらは、材料テスト ラボでは一般的ですが、ユーザーがラボにアクセスできない場合は購入コストが高くなります。また、機械的テスターは、設定された力または変位率のいずれかで単軸圧縮を提供する一方、適用された力および注入速度は、注入の過程で手で変化する場合がある。このプロトコルは、劇場の複雑な組織への注入、または異なる角度での注入など、いくつかの現実世界の注射を複製するのに適していません。診療所での注射力を定量化するために、力および変位トランスデューサはより良い方法であるかもしれない。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、英国バーミンガム大学化学工学部の製剤工学のためのEPSRC CDT、グラント参照EP/ L015153/1、および王立防衛医学センターによって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid Sodium Salt | Sigma | A2033-100G | |
| Blunt Needles | Needlez | NB19G1.5 | Any size may be used, depending on application |
| Calcium Sulphate Hemihydrate | Acros Organics | 22441.296 | |
| Clamp stand | Eisco | MTST5 | Two required |
| Clamps | R&L Enterprises | 41 | Two required, should have flat tops |
| Syringes | BD | 307731 | Any size can be used, depending on application |
| Universal Mechanical Tester | Zwick Roell | Z030 |
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