Summary
Presenteras här är ett protokoll för kvantitativt utvärdera injicerbarheten av ett material genom en spruta-nål system med hjälp av en standard mekanisk provning rigg.
Abstract
Injicerbara biomaterial blir allt populärare för minimalt invasiv leverans av läkemedel och celler. Dessa material är typiskt mer trögflytande än traditionella vattenhaltiga injektioner och kan vara halvfast, därför kan deras injicerbarhet inte antas. Detta protokoll beskriver en metod för att objektivt bedöma injicerbarheten av dessa material med hjälp av en mekanisk standardtestare. Sprutkolven komprimeras av tvärhuvudet med en inställd kurs, och kraften mäts. Värdet för max- eller platåkraft kan sedan användas för jämförelse mellan prover, eller till en absolut kraftgräns. Detta protokoll kan användas med alla material, och alla spruta och nål storlek eller geometri. De erhållna resultaten kan användas för att fatta beslut om formuleringar, sprut- och nålstorlekar tidigt i den translationella processen. Vidare kan effekterna av att förändra formuleringar på injektionsbarheten kvantifieras, och den optimala tiden att injicera tidsmässigt föränderliga material bestäms. Denna metod är också lämplig som ett reproducerbart sätt att undersöka effekterna av injektion på ett material, att studera fenomen som självläkning och filterpressning eller studera effekterna av injektion på celler. Detta protokoll är snabbare och mer direkt tillämpligt på injicerbarhet än rotationsreologi, och kräver minimal efterbearbetning för att erhålla nyckelvärden för direkta jämförelser.
Introduction
Biomaterial studeras och används ofta som byggnadsställningar för cellbaserad vävnadsregenerering och depåer för riktad, varaktig leverans av therapeutics1. Inom detta område, injicerbara biomaterial växer i popularitet eftersom de är minimalt invasiva, vilket minskar risken för infektion, smärta och ärrbildning i samband med implantation2. Vidare, eftersom de vanligtvis appliceras som vätskor, de överensstämmer perfekt med vävnadsdefekter, och läkemedel och celler kan blandas in i dem omedelbart före ansökan3,4,5. Som sådan, medan injicerbara biomaterial kan tillverkas som förinstallerade sprutor, de ofta framställs av kliniker direkt före applicering. Till exempel, cement börjar ställa in när pulver och flytande faser blandas, och så kan inte lagras under långa perioder före användning6. Karakteriseringen av dessa material är således tidsberoende och oupplösligt förbunden med deras beredning.
Vanliga injicerbara biomaterial inkluderar kalciumcementer, polymetylmetakrylat, bioglas, och olika polymera hydrogeler3,7. Till skillnad från traditionella injektioner av läkemedel, som har samma reologiska egenskaper som vatten, dessa injicerbara biomaterial är vanligtvis mer trögflytande, icke-Newtonska, kan ha vissa elastisk karaktär, och kan också förändras med tiden. Därför kan man inte anta att dessa material är injicerbara utan måste bedömas experimentellt. Genom att kvantifiera den kraft som krävs för injektion och korrelera den till enkel injektion, tidiga beslut om vilka biomaterial formuleringar, spruta, och nål storlekar att ta framåt kan göras tidigt i utvecklingsprocessen8. Sådana experiment kan också kvantifiera effekterna av att ändra formuleringar på injektionsbarhet9.
Det finns flera metoder för att bedöma egenskaperna hos injicerbara material. Rotational reologi utnyttjas ofta för att bedöma viskositet, icke-Newtonska beteende, post-skjuvning återhämtning, inställning tid, och andra egenskaper hos dessa material10,11,12. Även om denna typ av test är användbart för att fastställa grundläggande egenskaper hos materialen, korrelerar dessa egenskaper inte direkt till injekterbarhet. För en newtonsk vätska och cylindrisk spruta och nål kan injektionskraften uppskattas från en form av Hagen–Poiseuille-ekvationen13:
Där F är den kraft som krävs för injektion (N), R sär den inre sprutaradien (m), Rn är den inre nålradien (m), L är nållängden (m), Q är vätskeflödeshastighet (m3 s-1), η är den dynamiska viskositeten (Pa.s) och Ff är friktionskraften mellan kolven och pipväggen (N). Om viskositeten mäts via rotationsreologi, måtten på sprutan och nålen är alltså kända och flödeshastigheten uppskattad kan injektionskraften uppskattas. Denna ekvation står dock inte för sprutans koniska ände eller några andra geometrier, såsom uttag utanför centrum, och Ffmåste uppskattas eller hittas experimentellt genom mekanisk provning. Vidare är biomaterial vanligtvis inte newtonska, men uppvisar komplexa reologiska egenskaper. För en enkel skjuvningsgallervätska blir ekvationen14:
Där n är effektindex (-) och K är konsekvensindexet (Pa.sn) från uttrycket Ostwald de Waele: , var 
är 
skjuvningshastigheten (s-1). Komplexiteten ökar kraftigt för material vars reologiska egenskaper inte kan karakteriseras av två värden, och särskilt för tidsberoende material som inställning av cement. Dessutom, om de materiella egenskaperna är skjuvningsberoende, då materialet måste testas vid skjuvhastigheten förväntas i nålen, som kan vida överstiga intervallet för en roterande reometer15.
En annan kvantitativ metod för att mäta injicerbarheten innebär att man fäster tryck- och förskjutningsgivare på en spruta när de utför en injektion, antingen för hand eller med hjälp av en sprutpump. Denna utrustning är relativt billig, dock kräver användare att generera skript och kalibrering kurvor att omvandla till kraftdata16. Ytterligare, en spruta pump får inte inneha tillräckligt vridmoment för att komprimera kolven i en exakt takt om höga krafter krävs för att pressa ut viskösa eller halvfasta material. Alternativt, utnyttja dessa sensorer när du injicerar för hand kan vara användbara eftersom de kan användas i ett verkligt kliniskt scenario, under kliniska förfaranden17. Detta kommer dock att ta mycket längre tid och kan införa användarens partiskhet, och kommer därför att behöva större antal upprepningar med olika användare för att få tillförlitliga resultat. Detta kan alltså vara lämpligare för material som ligger längre ner i den translationella rörledningen, eller produkter som redan är i klinisk användning.
I detta protokoll används en mekanisk testare för att komprimera kolven i en inställd takt, och mäta den kraft som krävs för att göra det. Denna typ av mekanisk testare är vanligt i materiallaboratorier och har använts för att kvantifiera injekterbarhet för olika biomaterial18,19,20,21,22,23,24. Detta test kan användas med alla storlekar och geometri av spruta och nål, som innehåller något material. Vidare, när det gäller biomaterial som görs omedelbart före användningen, kan det exakta formuleringsförfarande som skulle användas på kliniken eller kirurgi följas före testning. En mer ytterligare fördel av detta tillvägagångssätt är att det är förhållandevis fastar; när den mekaniska testaren väl är inställd kan tiotals prover studeras på en timme, beroende på strängsprutningshastighet och sprutans volym. Detta står i kontrast till rotationsreologi, som typiskt tar minst 5 – 10 minuter per test, plus lastning, jämvikt och rengöringstid. Att använda en mekanisk testare producerar en tillförlitlig strängsprutningshastighet lika över kolven, vilket är särskilt fördelaktigt för viskösa formuleringar eller de med tidsberoende egenskaper. Efter testning krävs minimal efterbearbetning av data för att dra ut viktiga värden för objektiva jämförelser.
Protocol
1. Provberedning
- Förbered provet och ladda det i sprutan.
- För att simulera en förladdad spruta, förbered provet i förväg, ladda det i sprutan och fäst nålen. Förvaras som krävs, tills testning. Detta kan vara lämpligt för hydrogeler och material som inte förändras med tiden.
OBS: Till exempel, för att förbereda 2% alginas lösningar, lös 2 g alginsyra natriumsalt i 100 mL avjoniserat vatten, genom omrörning vid rumstemperatur. Aspirera lösningen i 5 mL-sprutor, och förvara i 24 h i rumstemperatur. - Alternativt, för att simulera en injektion formulerad direkt före ansökan, förbereda provet på samma sätt som det skulle göras på kliniken, vilket möjliggör eventuella inställningstider. Belastning i sprutan och fäst nålen. Detta kan vara lämpligt för cement, och material vars egenskaper förändras med tiden.
OBS: Till exempel, för att förbereda kalciumsulfatcement, blanda manuellt 4 g kalciumsulfat hemihydrat i 5 mL avjoniserat vatten med en spatel i 1 min. Ta ut kolven ur sprutan och belasta cementen i sprutans pipa med spateln. Påbörja den mekaniska provningen efter 4 min.
FÖRSIKTIGHET: Nålar utgör en säkerhetsrisk, använd trubbiga nålar om möjligt. Om materialet innehåller celler eller andra biologiska material bör man extra noga vara noga med att förhindra att det blir kraftiga skador.
- För att simulera en förladdad spruta, förbered provet i förväg, ladda det i sprutan och fäst nålen. Förvaras som krävs, tills testning. Detta kan vara lämpligt för hydrogeler och material som inte förändras med tiden.
2. Sätt upp den mekaniska testaren
- Fäst flat platens (för kompressionsprovning) på den mekaniska testaren.
- Utrusta mekaniskt manuellt med en lastcell med en maximal belastning på 200 N.
OBS: En större lastcell får användas, förutsatt att den har tillräcklig precision vid 1 – 200 N-området. Prover som är mer trögflytande och som inte är avsedda att injiceras för hand kan kräva en större lastcell. - Separera plattorna, med hjälp av de manuella kontrollknapparna, för att ge tillräckligt utrymme för nålen, sprutan och kolven (runt 30 cm kommer att räcka).
- Skapa ett testprotokoll.
- Öppna testguiden och ange testtypen till enaxial komprimering.
- Ställ in förinläsningen. Detta är det uppmätta kraftvärdet som testningen kommer att påbörjas med. 0,5 N är tillräckligt.
- Ställ in hastigheten på förlastning till 5 mm/min. Detta är den hastighet korshuvudet kommer att flytta ner tills den stöter på pre-load.
- Ställ in inlastningen till förskjutningsstyrning och välj en lämplig testhastighet. 1 mm/s är en lämplig hastighet för en vanlig 5 mL-spruta.
- Sätt en övre kraftgräns vid vilken testet kan stoppas, t.ex. Detta är främst av säkerhetsskäl. Testet kan också stoppas automatiskt vid en given förskjutning, t.ex.
3. Sätt upp fastspänningssystemet
- Fäst två uppsättningar av klämmor på två stativ, med grepp som är tillräckligt stora för att säkert ensconce den valda sprutan.
- Placera greppen mellan tvärhuvudet och basplattan, med tillräckligt med utrymme under greppen för sprutan och nålen.
- Rada upp centra för de två grepp, och linje upp dessa med mitten av korshuvudet.
OBS: Uppriktning av klämman grepp med varandra och mitten av tvärhuvudet kan ta lite tid och iteration att uppnå, men är viktigt att förvärva högkvalitativa data. - Se till att klämmorna är ordentligt säkrade så att ingen rörelse sker i klämmorna när en nedåtgående kraft anbringas.
- Placera en maträtt på bottenplattan för att samla det strängpressade materialet.
4. Kör injekterbarhetsprotokollet
- Sätt sprutan i klämgreppen och stäng dem. Greppen ska hålla sprutan på plats, men låta den röra sig upp och ner utan motstånd.
- Se till att sprutan och kolven är vinkelräta mot tvärhuvudet. Detta säkerställer att endast uniaxial komprimering av materialet kommer att mätas.
OBS: En tom spruta ska användas för att kontrollera steg 4.1 och 4.2. - Sänk den översta plattan till ett läge strax ovanför kolven, med hjälp av de manuella rörelseknapparna.
OBS: Det kan vara möjligt att välja en 'Startposition' i det mekaniska testarprotokollet, sådant att originalläget ovanför kolven uppnås automatiskt och är konsekvent under hela provningen. - Nolla den uppmätta kraften genom att klicka på 'Zero Force'.
- Kör testprotokollet genom att trycka på 'Kör'.
FÖRSIKTIGHET: Försökspersonalen ska alltid vara närvarande för att observera varje försök, och redo att aktivera nödstoppet vid missöde. - Höj plattorna till en tillräcklig höjd, med hjälp av de manuella rörelseknapparna, sådana att sprutan kan tas bort.
- Upprepa steg 4 för varje prov.
OBS: Vid denna punkt kan sprutan och det extruderade provet kasseras om ingen ytterligare analys krävs, men får hållas för att undersöka filterpressning, självläkning, effekterna på celler etc.
5. Insamling av uppgifter
- Spara data från varje försök i ett format från vilket en tabell med kraft och förskjutningsvärden kan genereras (.txt, .xls, .xlsx).
- Rita resultaten från varje försök, med förskjutning på x-axeln och kraft på y-axeln.
- Läs maximal kraft (om den finns) och platåkraft från graferna.
Representative Results
Uppställda av det mekaniska testaren och fastspänningssystemet visas i figur 1A. Detta protokoll genererar en tabell och graf av kraft kontra förskjutning för varje testat prov. En typisk kraftförskjutningskurva består av tre sektioner (Bild 1B): en inledande gradient, då kolven övervinner friktion från pipan och materialet accelereras, en kraft maximal, och en platå, eftersom materialet extruderades i ett stadigt tillstånd.
En distinkt maximal finns dock bara där platåkraften är lägre än den kraft som krävs för att accelerera kolven. Som sådan, toppar ses endast för inviscid prover som passerar genom breda nålar. För viskösa prover som passerar genom en smalare öppning är den kraft som behövs för att injicera provet med konstant hastighet större än den kraft som krävs för att övervinna friktionen i pipan och påskynda materialet, och ingen distinkt topp ses (Figur 1C). För mycket trögflytande prover eller mycket smala nålar kan den kraft som krävs för att extrudera materialet vara så stor att sprutans spännen och misslyckas, ofta med mycket liten extrudering av materialet (Figur 1D). Om det material som injiceras innehåller partiklar eller genomgår inställning, såsom cement, kan filterpressning (förmånlig utvisning av vätskefasen) eller bulkinställning förekomma, vilket leder till ofullständig injektion (Figur 1E).
Bild 1: Provkurvor som genereras av det här protokollet. (A) Uppsättning av den mekaniska testaren för detta protokoll. (B) Typisk kraft-extruderingskurva. (C) Force-extruderingskurva utan distinkt maximal topp. (D) Kraft-extruderingskurva för sprutfel. (E) Force-extruderingskurva för en inställningscement. Denna siffra är anpassad från Robinson et al.8. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Mekanisk testning är kanske det enklaste och mest tillförlitliga sättet att kvantifiera injicerbarhet. En central fördel med detta protokoll är att ingen särskild utrustning krävs, förutom den mekaniska testaren, som är vanlig i materiallaboratorier. Detta protokoll är mycket mångsidigt; något material, kanylmätare och spruta storlek kan användas, förutsatt att sprutan kan rymmas av klämmorna. Detta har verifierats i detta protokoll för sprutor upp till 10 mL. Vidare kan materialet förberedas precis som det skulle för den verkliga tillämpningen25. Slutligen är detta förfarande mycket snabbt, tar bara upp till några minuter per prov, vilket gör att tiotals prover som skall bearbetas per timme.
För prover som ger typiska kurvor kan man extrahera två värden: den maximala kraften och platåkraftskurvorna. Den maximala kraften är utan tvekan mer objektiv och kan extraheras beräkningsmässigt från datatabellen för varje prov. Omvänt kan platåkraften vara mer representativ, eftersom detta kommer att vara den kraft som upplevs under den största tiden och, som ett genomsnitt, påverkas mindre av kurvor med stora fluktuationer. Dessa fluktuationer kan orsakas av luftbubblor eller partiklar i materialet som orsakar intermittenta förändringar när de extruderades, eller av låg instrumentprecision för små kraftmätningar. Det är dock anmärkningsvärt att det för många prover inte finns någon maximal krafttopp, och så är det maximala och platåvärdet detsamma. Objektiva jämförelser mellan injektionskrafter kan göras så länge ett konsekvent värde används.
De data som erhålls kan användas på flera sätt. Värdena för injektionskraften kan jämföras med enkel injektion, för att fastställa vilka formuleringar, sprut- och nålstorlekar som är bärkraftiga för översättning8. Alternativt möjliggör jämförelse mellan prover kvantifiering av förändringar av formuleringar om injicerbarhet. Till exempel, i cementer, ändra viskositeten i den flytande fasen, partikelstorleken fördelning, och lägga till tillsatser såsom citrat att förändra de kolloidala egenskaper, kan ha stora förändringar i injicerbarhet9. Dessa tester kan också informera formuleringsprotokoll för cement, till exempel blandningstid, tid till lastning och tid till applicering, för optimal injektion och prestanda efter injektion. Dessutom kan denna metod användas för att testa den ursprungliga genomförbarheten av nya bioinker för 3D-utskrift.
Detta protokoll kan ändras på flera sätt. Klämsystemet får ersättas med en skräddarsydd 3D-tryckt konstruktion för att hålla i sprutan, vilket kan göra det lättare att säkerställa att sprutan och kolven är vinkelräta mot tvärhuvudet, och sprutan hålls säkert. Nålen kan ersättas med en kanyl eller någon enhet som extruderar material genom kompression av en kolv och kan vara av valfri storlek och geometri. För att öka resultatens trohet kan nålspetsen placeras i en vävnad eller hydrogel, för att mer exakt simulera klinisk injektion. Detta tillför dock ytterligare komplexitet till protokollet, som vävnad / gel sammansättning och nåldjup måste hållas konstant. Vidare utnyttjar detta protokoll förskjutningsstyrd extrudering, för att mäta den kraft som krävs för att injicera vid den angivna hastigheten. Alternativt kan injektionskraften specificeras, och mängden extrudering kan mätas mot tiden. Detta kan vara användbart för material med tidsberoende egenskaper, till exempel cement. Till exempel, genom att använda en korrelation mellan injektionskraft och enkel injektionsbarhet för att välja en kraft8, kan detta protokoll användas för att fastställa om hela volymen cement kan injiceras med denna hastighet före inställningen. Slutligen kan detta protokoll enkelt kombineras med andra experiment, för att testa effekten av injektion på de materiella egenskaperna och undersöka fenomen som filterpressning och självläkning, eller effekten av injektion på celler.
Den främsta begränsningen av detta protokoll är att en universell mekanisk testare krävs. Medan dessa är vanliga i material testlabb, de är dyra att köpa om användaren inte kan komma åt en. Vidare ger den mekaniska testaren enaxial kompression vid antingen en inställd kraft eller förskjutningshastighet, medan den tillämpade kraften och injektionshastigheten kan variera under injektionsförflyttningen för hand. Detta protokoll är också olämpligt för att replikera några verkliga världen injektioner, såsom injektioner i komplexa vävnader i teater, eller injicera i olika vinklar. Att kvantifiera injektionskraften på kliniken kan kraft och förskjutningsgivare vara en bättre metod.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av EPSRC CDT for Formulation Engineering vid School of Chemical Engineering vid University of Birmingham, Storbritannien, Grant reference EP/L015153/1 och Royal Centre for Defence Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid Sodium Salt | Sigma | A2033-100G | |
| Blunt Needles | Needlez | NB19G1.5 | Any size may be used, depending on application |
| Calcium Sulphate Hemihydrate | Acros Organics | 22441.296 | |
| Clamp stand | Eisco | MTST5 | Two required |
| Clamps | R&L Enterprises | 41 | Two required, should have flat tops |
| Syringes | BD | 307731 | Any size can be used, depending on application |
| Universal Mechanical Tester | Zwick Roell | Z030 |
References
- Webber, M. J., Appel, E. A., Meijer, E. W., Langer, R.
- Mathew, A. P., Uthaman, S., Cho, K. -H., Cho, C. -S., Park, I. -K. Injectable hydrogels for delivering biotherapeutic molecules. International Journal of Biological Macromolecules. 110, 17-29 (2018).
- Zhou, H., et al. Injectable biomaterials for translational medicine. Materials Today. 28, 81-97 (2019).
- Alves, H. L. R., dos Santos, L. A., Bergmann, C. P. Injectability evaluation of tricalcium phosphate bone cement. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2241-2246 (2008).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chemical Society Reviews. 37, 1473 (2008).
- Pawelec, K. M., Planell, J. A. Bone Repair Biomaterials: Regeneration and Clinical Applications. , Elseiver, Woodhead Publishing. (2019).
- Fernandez de Grado, G., et al. Bone substitutes: a review of their characteristics, clinical use, and perspectives for large bone defects management. Journal of Tissue Engineering. 9, 204173141877681 (2018).
- Robinson, T. E., et al. Filling the Gap: A Correlation between Objective and Subjective Measures of Injectability. Advanced Healthcare Materials. , 1901521 (2020).
- O'Neill, R., et al. Critical review: Injectability of calcium phosphate pastes and cements. Acta Biomaterialia. 50, 1-19 (2017).
- Gantar, A., et al. Injectable and self-healing dynamic hydrogel containing bioactive glass nanoparticles as a potential biomaterial for bone regeneration. RSC Advances. 6, 69156-69166 (2016).
- Ramin, M. A., Latxague, L., Sindhu, K. R., Chassande, O., Barthélémy, P. Low molecular weight hydrogels derived from urea based-bolaamphiphiles as new injectable biomaterials. Biomaterials. 145, 72-80 (2017).
- Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
- Burckbuchler, V., et al. Rheological and syringeability properties of highly concentrated human polyclonal immunoglobulin solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76, 351-356 (2010).
- Allmendinger, A., et al. Rheological characterization and injection forces of concentrated protein formulations: An alternative predictive model for non-Newtonian solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87, 318-328 (2014).
- Davison, P. F. The Effect of Hydrodynamic Shear on the Deoxyribonucleic Acid from T2 and T4 Bacteriophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 45, 1560-1568 (1959).
- Chen, M. H., et al. Methods to Assess Shear-Thinning Hydrogels for Application As Injectable Biomaterials. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3, 3146-3160 (2017).
- Krebs, J., et al. Clinical measurements of cement injection pressure during vertebroplasty. Spine. 30, (2005).
- Bohner, M., Baroud, G.
- Gbureck, U., Barralet, J. E., Spatz, K., Grover, L. M., Thull, R. Ionic Modification of Calcium Phosphate Cement Viscosity. Part I: Hypodermic Injection and Strength Improvement of Apatite Cement. Biomaterials. 25, 2187-2195 (2004).
- Habib, M., Baroud, G., Galea, L., Bohner, M. Evaluation of the ultrasonication process for injectability of hydraulic calcium phosphate pastes. Acta Biomaterialia. 8, 1164-1168 (2012).
- Martin, B. C., Minner, E. J., Wiseman, S. L., Klank, R. L., Gilbert, R. J. Agarose and methylcellulose hydrogel blends for nerve regeneration applications. Journal of Neural Engineering. 5, 221-231 (2008).
- Borzacchiello, A., Russo, L., Malle, B. M., Schwach-Abdellaoui, K., Ambrosio, L. Hyaluronic Acid Based Hydrogels for Regenerative Medicine Applications. BioMed Research International. 2015, 871218 (2015).
- Zhao, L., Weir, M. D., Xu, H. H. K. An injectable calcium phosphate-alginate hydrogel-umbilical cord mesenchymal stem cell paste for bone tissue engineering. Biomaterials. 31, 6502-6510 (2010).
- Ji, D. -Y., Kuo, T. -F., Wu, H. -D., Yang, J. -C., Lee, S. -Y. A novel injectable chitosan/polyglutamate polyelectrolyte complex hydrogel with hydroxyapatite for soft-tissue augmentation. Carbohydrate Polymers. 89, 1123-1130 (2012).
- Vaishya, R., Chauhan, M., Vaish, A.
