Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Количественная оценка вируса бешенства в различных структурах мозга крупного рогатого скота

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/61429
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

Summary

Этот протокол представляет собой qRT-PCR-основанный подход для определения нуклеопротеина вируса бешенства (N) номер копии гена в различных анатомических структур мозга крупного рогатого скота с использованием транскрипции в пробирке.

Abstract

Паралитическое бешенство крупного рогатого скота (БНР) является одной из форм вирусного энцефалита, который имеет существенное экономическое значение во всей Латинской Америке, где он представляет собой крупный зоонозный риск. Здесь нашей целью было использовать лабораторный протокол для определения относительного количества копий генома вируса бешенства (RABV) в различных анатомических структурах мозга крупного рогатого скота с использованием количественных обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR). qRT-PCR количественно определяет определенное количество копий генов, присутствующих в образце на основе флуоресценции, испускаемой после усиления, что прямо пропорционально количеству целевой нуклеиновой кислоты, присутствуют в образце. Этот метод выгоден из-за его короткой продолжительности, снижение риска загрязнения, и потенциал для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот в различных образцах легче по сравнению с другими методами. Мозг шести бешеных животных был разделен на шесть анатомических структур, а именно рог Аммона, мозжечок, кору, медуллу, понс и таламус. Все мозги были определены как положительные для антигенов RABV на основе прямого теста иммунофлюоресценции. Были также оценены те же анатомические структуры из мозга четырех RABV-отрицательных бычьих коров. РНК извлекается из каждой структуры и используется для qRT-PCR. Был проведен анализ для определения копий генов RABV с использованием транскрибированного в пробирке нуклеопротеина гена. Стандартная кривая, используемая для количественной оценки вирусной РНК, продемонстрировали эффективность 100% и линейность 0,99. Анализ показал, что кора, медулла и таламус были идеальными частями ЦНС для использования в обнаружении RABV, основываясь на наблюдении, что эти структуры обладают самыми высокими уровнями RABV. Специфика теста составила 100%. Все пробы были положительными, ложных срабатываний обнаружено не было. Этот метод может быть использован для обнаружения RABV в образцах, которые содержат низкие уровни RABV во время диагностики BPR.

Introduction

Бешенство может быть подтверждено до смерти и вскрытия с помощью различных методов, которые позволяют обнаружения вирусных нуклеиновых кислот в головном мозге, коже, моче илислюне 1. Обнаружение нуклеопротеина вируса бешенства(N)ген в основном используется для диагностики бешенства молекулярными тестами. Этот ген также используется для вирусного генотипирования. Бешенство может быть диагностировано у животных, использующих любую часть пораженного мозга; однако, чтобы исключить возможность бешенства, ткани, по крайней мере из двух областей в головном мозге должны быть проверены2. Существует несколько диагностических методов выявления бешенства у животных; однако, прямой тест иммунофлуоресценции остается стандартной эталоннойтехникой 3. Другие тесты включают биологические тесты, которые включают прививку мыши, инфекции в культуре тканей, и полимеразной цепной реакции (ПЦР)4. Все эти методы рекомендованы Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией по охране здоровья животных (OIE) для диагностики бешенства у людей и животных,соответственно 5.

Методы обнаружения и усиления нуклеиновой кислоты произвели революцию вдиагностике бешенства в последние 6 лет, и эти методы играют важную роль в диагностике бешенства человека. Несколько ПЦР-тесты были оценены в дополнение к обычным тестам для антемы и посмертного бешенства диагнозы 7,8,9,10. Большинство анализов целевой бешенства вирусный ген нуклеопротеина для усиления, который является наиболее высоко сохраниваемой области в вирусномгеноме 1,11. За последние 20 лет были разработаны различные молекулярные анализы для диагностики RABV, и некоторые из этих анализов были использованы для характеристики вируса. Большинство испытаний были направлены на обнаружение сохраненных генов в вирусном геноме, чаще всего с помощью обычных или количественных в режиме реального времени полимеразы цепной реакции (qRT-PCR)анализы 12,13.

ПЦР является высокочувствительным диагностическим методом, который может обнаружить геном данного патогена в тканях, даже если эти ткани разлагаются. Используя ПЦР-подходы, минимальное количество инфекционного агента может быть обнаружено в клиническом образце путем селективного и повторяющегося усиления нуклеотидной последовательностиДНК 14. qRT-PCR, который включает флуоресцентные зонды (например, TaqMan) или ДНК связывающие красители (например, SYBR Green) был использован в испытаниях для диагностики RABV как анте- и после- mortem с высокой чувствительностью; однако такой подход требует специального оборудования. Для преодоления этого ограничения было предложено использовать обратное транскрипционные циклы при посредничестве изотермального усиления (RT-LAMP) на основе его низкой стоимости, простоты и желательных характеристик для обнаружения RABV. Этот анализ особенно важен, поскольку он может быть использован в развивающихся странах15.

qRT-PCR основан на обнаружении и количественной оценке молекулы, где увеличение флуоресцентного сигнала напрямую пропорционально количеству продукта ПЦР в одной реакции. По мере увеличения количества копий цели нуклеиновой кислоты увеличивается и флуоресценция. Неспецифические интеркалирующие красители, такие как SYBR Green DNA-binding dye или последовательность конкретных олигонуклеотидных зондов, несущих флюорофор и утоливание, обычно используются для обеспечения флуоресцентного считывания в qRT-PCR. Этот анализ предлагает преимущества по сравнению с обычными RT-PCR, которые включают в себя более короткое время испытаний (2-4 ч), снижение риска загрязнения из-за закрытой трубки системы (отсутствие пост-PCR манипуляции усиленных продуктов), а также возможность обнаружения различныхцелей одновременно 16. qRT-PCR может быть использован для диагностики бешенства до смерти от слюны и других образцов. Этот анализ также может быть использован в качестве универсального теста в режиме реального времени для обнаружения различных видов лиссавирусов или линий RABV15. В этом комбо RT-PCR подход, две реакции используются. Первый обнаруживает различные генетические линажи RABV, а второй обнаруживает виды лиссавирусов. Оба шага включают анализы qRT-PCR, где первый использует гибридизационые зонды, а второй использует красители15. Из-за большого количества тестов, которые продемонстрировали успешное молекулярное обнаружение RABV с помощью этой техники, текущее наземное руководство МЕА (2018) рекомендует использовать ПЦР для молекулярного обнаружения RABV17.

Мексика является страной со значительным потенциалом животноводства. Государства с самым высоким животноводством содержат как влажные тропические регионы, так и сухие регионы, которые находятся под угрозой вспышек бешенства из-за присутствия летучей мыши-вампира Desmodus rotundus, основного передатчика бешенства. Поэтому необходимо разработать больше инструментов для профилактики и борьбы с паралитической бешенством крупного рогатого скота (БНР) в Мехико. Основываясь на этом, целью данного исследования было использование количественных qRT-PCR для определения количества вирусных частиц в различных анатомических структурах мозга крупного рогатого скота после смерти от бешенства инфекции.

Шесть мозгов, полученных из RABV-положительных бычьих лоз, были пожертвованы внешней лабораторией для использования в разработке описанного ниже протокола qRT-PCR. Образцы структуры мозга крупного рогатого скота были холодной цепью, транспортируется в лабораторию INIFAP CENID-MA BSL-2 и хранится при -80 градусов по Цельсию до использования. Мозги были получены от животных из штатов Кампече, юкатан и Керетаро. До получения, различные структуры были вскрыты из мозга. Эти структуры включали рога Аммона, мозжечок, кору, медуллу, понс италамус 18,19. Генетический материал был извлечен, как описано ниже. Диагноз RABV был подтвержден с использованием прямых флуоресцентных антител (DFA)20. В качестве положительного контроля были использованы мозги мышей, которые были привиты RABV21. Кроме того, четыре RABV-отрицательных мозга крупного рогатого скота (как это определено DFA) были использованы в качестве отрицательного контроля.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Это исследование было одобрено и проведено в строгом соответствии с рекомендациями по использованию животных, предоставленными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Национального комитета по защите животных (CENID-MA).

1. Образцы

  1. Используйте различные области мозга, вскрытые из 6 различных бешенство-положительный мозг крупного рогатого скота для анализа RT-PCR.

2. Прямые флуоресцентные антитела (DFAs) для подтверждения бешенства

ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение антигена бешенства DFA является качественным методом для определения наличия нуклеопротеина бешенства с использованием флуоресксеин помеченных антител. Тест был проведен с использованием протокола, предоставленного Дин и др. (1966)20, как описано ниже.

  1. Сделайте два впечатления от каждой ткани, вскрытой из различных структур мозга на стерильной слайде диаметром около 15 мм. Используйте деревянный аппликатор, чтобы размазать примерно3 мм 3 части ткани на стерильные слайды. Чтобы создать мазок, аккуратно прижимите деревянный аппликатор к слайду вручную.
  2. Исправить пример мазка слайды, погмив слайды в 100% ацетон для 1 ч при -20 градусов по Цельсию. После инкубации высушите горки на сухой ткани при 21 градусе Цельсия в течение 30 минут.
  3. Добавьте 50 МКЛ антиклеопротеина, помеченного флуоресковым меткой, к каждому мазку мозга при разбавлении 1:10 путем дозирования через шприц.
  4. Инкубировать горки с спряжением во влажной камере при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
  5. После инкубации, мыть горки дважды с водой и с PBS для устранения избыточного спряжения. Разрешить слайды высохнуть при 21 градусе Цельсия. Тщательно пятно, чтобы удалить избыток жидкости, а затем кратко воздух сухой до монтажа.
  6. Добавить каплю 50% фосфатного глицерина, чтобы покрыть поверхность раздела, а затем накрыть крышкой. Наблюдайте за секциями под эпифлюоресценцией микроскопа при 40-х увеличении.
    1. Процесс и наблюдать положительный и отрицательный контроль (положительный контроль: мозг мыши прививки с RABV; отрицательный контроль: RABV-отрицательный мозг крупного рогатого скота) таким же образом, как образцы.

3. Создание положительного контроля для RT-PCR

  1. Получить BHK-21 клетки из банка зародышевой плазмы. Используйте ячейки до70-го прохода, чтобы воспроизвести штамм RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) с помощью прохода 2.
  2. Поддерживать и распространять клетки BHK-21 в бутылках, содержащих минимальную необходимую среду (MEM), дополненную сывороткой 10% плода теленка (FCS) при 37 градусах Цельсия при наличии CO2 (5%) и во влажных условиях. Выращиваем клетки в 25 см2 культуры колбы, пока они не достигнут 80% слияния, а затем субкультуры.
  3. Удалите культурную среду из клеток и вымойте бутылку фосфатом буферным солевым раствором (PBS). Прививите культуру 105 TCID/mL штамма RABV ERA. Инкубировать вирусный инокулум в течение 2 ч при постоянной тряске при 37 градусах по Цельсию при наличии CO2 (5%) и во влажных условиях.
  4. Удалить инфекции среды и добавить MEM дополняется 5% (сыворотка плода крупного рогатого скота) SFB. Инкубационный на 72 ч при 37 градусах Цельсия при наличии CO2 (5%) во влажных условиях.
  5. Урожай RABV 3 дней после прививки, когда клетки обладают цитопатических эффектов. Заморозить инфицированные клетки, а затем разморозить их при 4 градусов по Цельсию, чтобы подморозить клетки. Соберите среду из бутылки, а затем поместите клетки в центрифугу трубку для центрифугации при 1050 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию.
  6. Храните супернатанты от RABV при -80 градусов по Цельсию и подготовьте рабочие алициты для хранения при -70 градусов по Цельсию.
  7. Intracerebrally привить вирус, полученный в предыдущем шаге в 21 день старые женщины CD1 мышей. Используйте шприц 1 мл для прививки 50 л растворов, содержащих 106 MICLD50 (мышь инфекционной культуры смертельная доза 50%) дозы вмышей 22.

4. Добыча РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Всего РНК была извлечена непосредственно из крупного рогатого скота мозга с использованием метода органической экстракции в соответствии со следующим протоколом.

  1. Используйте 100 мг ткани мозга из каждой анатомической структуры для извлечения общей РНК с помощью коммерчески доступного реагента, содержащего изотиоцианат гуанидия.
  2. Вручную гомогенизировать в общей сложности 100 мг ткани из каждой структуры в 1 мл гуанидия изотиоцианат реагент путем вихря с помощью Dounce гомогенизатор с небольшой пестик внутри микротрубки для 15 с на максимальной скорости.
  3. Инкубировать образцы на льду в течение 5 минут, а затем добавить 200 йл хлороформа. Смешайте образцы энергично в течение 15 с, инкубировать на льду в течение 2 до 3 минут, а затем центрифугу при 12000 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию.
  4. Перенесите акеозную фазу в чистую трубку и добавьте 500 МКЛ изопропилового спирта. Инкубировать образцы в течение 15 мин при 21 градусе по Цельсию.
  5. Центрифуга образцов при 12000 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспирировать aqueous supernatant путем pipetting. Изолированная РНК будет присутствовать в виде гранулы в трубке.
  6. Затем промойте гранулы РНК с 1 мл 75% этанола путем пипетки, и центрифуга при 7500 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию.
  7. Декант супернатант и воздух-сухой гранулы РНК при комнатной температуре (21 градус по Цельсию). Затем разбавьте гранулы в 50 мкл воды без нуклеазы.
  8. Определите концентрацию и качество РНК на уровне 260 нм с помощью спектрофотометра. Храните РНК при -80 градусов по Цельсию до использования.
  9. Удалите ДНК из образцов РНК путем пищеварения с DNase I. Добавьте 2 U DNase I на 1 мкг РНК, извлеченной на предыдущем этапе. Затем добавьте 5 МКЛ буфера реакции 10x, а затем инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Инактивировать DNase I, добавив 1 МКЛ ЭДТА в смесь с последующим инкубацией в течение 10 минут при 65 градусов по Цельсию.

5. синтез кДНК и ПЦР

  1. Синтезировать первый прядь cDNA с помощью олиго ДТ и обратной транскриптазы. На каждые 1 мкг РНК добавьте 1 МКЛ олиго ДТ (500 мкг/мл), 1 МКЛ смеси 10 мМ dNTP и безнуклеазу дистиллированную воду до конечного объема 12 йл. Инкубировать смесь при 65 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
  2. Охладите реакционной смеси до 4 градусов по Цельсию. Центрифуга трубки для 30 с на 1050 х г, а затем добавить 4 йл буфера реакции, 2 х 0,1 МТТ, и 1 йл ингибитор рибонуклеазы (40 U/ L).
  3. Инкубировать реакционной смеси при 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин, а затем добавить 1 МКЛ обратной транскриптазы (200 U). Затем инкубировать реакционной смеси в течение 50 мин при 37 градусов по Цельсию, а затем инактивировать реакцию при 70 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
  4. Храните cDNA при -20 градусов по Цельсию перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить качество синтезированного кДНК, выполните усиление фрагмента гена RABV N 761 bp до выполнения синтеза in vitro. Используйте протокол, описанный Loza-Rubio et al.11, описанный в шаге 5.5 ниже.
  5. Выполните ПЦР с помощью полимеразы Taq DNA при следующих условиях. Выполните реакцию, настроенную следующим образом: 10x Taq буфер, содержащий 20 мМ MgCl2, 0,2 мММ dNTPs, 1 U Taq полимераза, 10 ЗМ каждого грунтовки (SuEli: 5 "cgtrgaycaatatgagtaca 3" и SuEli-: 5 "caggctcraacattcttctta 3"), 2,5 мл cDNA, и ультрачистая вода до конечного объема 50 йл.
  6. Выполните усиление в термоциклере, используя следующие условия езды на велосипеде: 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин; 35 циклов по 95 градусов по Цельсию на 30 с, 60 градусов по Цельсию на 30 с и 72 градусов по Цельсию в течение 1 мин; один цикл 72 градусов по Цельсию в течение 7 мин.
  7. Оцените наличие продуктов ПЦР 761 bp с использованием геля агарозы 1%.

6. Транскрипция in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Транскрипция in vitro генерирует мРНК целевого гена. Используйте грунтовку, которая усиливает полный ген RABV N и тот, который используется в качестве положительного контроля для анализа qRT-PCR. Эти грунтовки предназначены для усиления полного гена RABV N и добавления промоутера, который распознает полимеразу T7 (TAATACGACTCACTATAG).

  1. Чтобы усилить весь ген N RABV, используйте праймеры Trans-Nrab вперед (5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ) и обратный (5ʹ caatacgactcactatggatgcacaagatt 3ʹ) и высокой точности PCR комплект.
    1. Для каждой реакции подготовьте мастер-микс PCR, добавив к чистому буферу реакции ПЦР 10x, 2 мММ ДМСО, 25мМ МгКл 2,10 мММ дНТП, 10 МКМ от каждой грунтовки, 0,5 U полимеразы высокой точности, 1,5 л кДНК (подготовленная в шаге 5), и ультрапурная вода до конечного объема 50 л.
    2. Используйте термоциклер, установленный для следующих условий для усиления: 94 градуса по Цельсию в течение 1 мин; 4 цикла по 94 градуса по Цельсию в течение 1 мин, 40 градусов по Цельсию в течение 1 мин и 72 градусов по Цельсию в течение 2 мин; 35 циклов по 94 градуса по Цельсию в течение 1 мин, 60 градусов по Цельсию в течение 1 мин и 72 градусов по Цельсию в течение 2 мин; окончательное продление 72 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
  2. Использовать продукт PCR в качестве шаблона для синтеза in vitro и удалить компоненты энзиматической реакции из шага 6.1.2, очистить продукт ПЦР с помощью комплекта концентратора на основе колонки в соответствии с инструкциями производителя, а затем количественно с помощью спектрофотометра.
  3. Для синтеза РНК используйте набор для транскрипции in vitro со следующей реакционной смесью: 5 МКЛ T7 Транскрипция 5x буфер, 1,9 МКЛ каждого нуклеотида трифосфата, 10 мкг очищенной RABV N DNA VP2 DNA и 2,5 МКЛ ферментной смеси. Затем инкубировать смесь при 37 градусов по Цельсию в течение 4 ч. Затем добавьте 1 МКЛ из 1 U/g RNase-Free DNase в реакционной смеси и инкубировать в течение 15 мин при 37 градусов по Цельсию для устранения загрязнения ДНК.
  4. Очистить в пробирке транскрибированной РНК, а затем сконцентрировать его с помощью фенола:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1).
  5. Повторное использование очищенных гранул РНК в 70 МКЛ буфера TE, а затем хранить при -80 градусов по Цельсию до использования.
  6. Повторите протокол ПЦР от шага 6.1 до получения приблизительно 5 мкг продукта ПЦР. После очищения и концентрации транскрибированная в пробирке N генная мРНК будет присутствовать при концентрации 4,711 мкг/ОЛ.
  7. Подтвердите, что транскрибированная мРНК in vitro соответствует гену N после 5-го шага этого протокола, и используйте это в качестве положительного контроля для обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR).

7. Обратная транскрипционная цепная реакция полимеразы в режиме реального времени (qRT-PCR)

  1. Для qRT-PCR используйте транскрипт in vitro mRNA, кодирующий полный ген N, в качестве положительного контроля наряду с коммерческим одношаговым комплектом qRT-PCR с использованием гибридизации зондов в соответствии с инструкциями производителя. Используйте зонд и грунтовки, описанные Carneiro et al. (2010)23 для обнаружения сохраненной области гена RABV N (BRDesrot-Rev: 5 "aaactcaagagaaggccaacca 3", BRDesrot-Fwd: 5 "cgtactgatgtggagggaattg 3" и BRDesrot-Probe: 5"-FAM-acaagggaccctactgttgagagcatgc-3"-BHЗ).
  2. Используйте следующие условия теплового велоспорта: 1 цикл по 50 градусов по Цельсию в течение 10 минут и 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин; 40 циклов по 95 градусов по Цельсию на 15 с и 50 градусов по Цельсию на 30 с.

8. Кривая калибровки или стандартная кривая

  1. Выполните серийные разбавления транскрибированных мРНК in vitro, последовательно затухая 1 мкг/л мРНК в трубки до тех пор, пока не будут получены шесть разбавлений. Подготовка труб на объем 100 мкл в трипликат для использования в создании стандартной кривой. Выполните qRT-PCR, как описано в шаге 7.
  2. Выполните qRT-PCR в термоциклере с ротором, обработав различные образцы мозга одновременно с ходовых реакций для создания стандартной кривой и с использованием положительных элементов управления, отрицательного контроля и супернатантов, изолированных от клеточной культуры.
  3. Чтобы оценить предел обнаружения, эффективность теста и чувствительность теста, используйте стандартную кривую в тройном режиме при тех же условиях.

9. qRT-PCR биологических образцов

  1. Для обнаружения гена N RABV используйте РНК из полевых образцов, положительный контроль, отрицательный контроль и супернатанты клеточной культуры для выполнения qRT-PCR с использованием набора ПЦР, описанного в шаге 7.
  2. Для определения количества копий генома RABV, присутствующих в образцах мозга крупного рогатого скота, получить данные Ct из стандартной кривой и биологических образцов и от тех, интерполированных из уравнения кривой калибровки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты DFA показали 100%, 100%, 83,3%, 66% и 50% положительность RABV в коре головного мозга, таламусе, медулле, понах и рогах соответственно. Эти результаты подтвердили предыдущие результаты, и по крайней мере три структуры, расчлененные из каждого мозга, были положительными для RABV. Представитель положительного Окрашивания DAF показан на рисунке 1.

На рисунке 2 показано усиление фрагмента гена RABV N (шаг 5.5) с праймерами, о которых сообщили Loza-Rubio et al.11. Это свидетельствует о том, что материал, полученный для использования в усилении, имеет хорошее качество.

Размер фрагмента, усиленный ПЦР, показан на рисунке 3. Уравнение стандартной кривой показывает связь между количеством генетического содержания RABV в образце и размером фрагмента, усиленным ПЦР. Количество генетического содержания RABV (в нг) было выведено путем интерполяции значений Ct в кривой калибровки с использованием уравнения, представленного на рисунке 4. С помощью этого уравнения было установлено, что предел обнаружения1 х 10 5 мкг/мл вирусной РНК соответствует 36 копиям генома RABV. Эти результаты показывают, что анализ чувствителен и может быть использован для обнаружения вируса в образцах, которые содержат небольшое количество копий гена RABV N. Эффективность анализа рассчитывалась с помощью наклона стандартной кривой, которая составила -3,28. Образцы, используемые для qRT-PCR, показали усиление гена RABV N.

Чтобы определить количество присутствующих вирусных копий, значения Ct для каждого образца были интерполированы с помощью уравнения кривой калибровки. Полученный результат (в нанограммах) был заменен на формулу, описанную ниже из следующего рефери24:

Количество копий гена RABV N (образец NG 6.022 x 1023) / (104 bp (длина продукта ПЦР) - 1 x 109 и 650).

Для сравнения, результаты анализа qRT-PCR соответствовали результатам, полученным с помощью DFA. Согласно результатам, полученным в тесте qRT-PCR в случаях C и D(таблица 1), таламус является структурой, которая обладает наибольшим количеством копий гена RABV N. Это говорит о том, что ранняя инфекция гипоталамические и таламические нейроны имеет важное значение в развитии болезни, учитывая, что эти нейроны контролируют вегетативные функции животного. Копии генов RABV N, обнаруженные в каждой структуре каждого образца, показаны в таблице 1. Чувствительность и специфичность теста qRT-PCR были как 100%, так как все образцы были положительными. Этот результат согласуется с первоначальными диагнозами образцов.

Figure 1
Рисунок 1: Ткани мозга крупного рогатого скота, показывающие положительное окрашивание в соответствии с прямым тестом иммунофлуоресценции, который обнаруживает белок вируса бешенства N в инфицированных тканях. Ябло-зеленая окраска наблюдается при окрашиваниях, где антитела связываются с антигеном бешенства. Шкала бар: 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: 1,5% агарозный гель, показывающий продукты усиления. Усиление фрагмента гена RABV N на 761 б.п., чтобы продемонстрировать наличие и качество кДНА, которые будут использоваться в транскрипции in vitro. Переулок 1 содержит молекулярный маркер веса, строка 2: усиление положительного контроля; полоса 3: отрицательный контроль (неиммияная выборка); линия 4: усиление cDNA, используемого для транскрипции in vitro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: 1,5% агарозный гель, показывающий продукты усиления. Усиление полного гена N показано в полосе 2. Переулок 1 содержит молекулярный маркер веса, а полоса 3 содержит отрицательный контроль усиления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Стандартная кривая qRT-PCR с использованием транскрибированного в пробирке N гена mRNA для количественной оценки количества копий гена RABV N. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Идентификационный мозг структура DAF Количество копий (x109)
ля Рог Аммона + 0.261
мозжечок + 0.0663
кора + 0.02
костный мозг + 0.146
Понс + 30.7
Таламуса + 108
си Рог Аммона - 0.0251
мозжечок + 4.64
кора + 12.4
костный мозг + 0.175
Понс No u2012 0.0721
Таламуса + 121
до Рог Аммона No u2012 0.168
мозжечок + 0.0239
кора + 21.5
костный мозг + 17.2
Понс + 1.32
Таламуса + 102
ре Рог Аммона + 11.8
мозжечок + 0.0239
кора + 8.72
костный мозг + 1.25
Понс No u2012 0.0165
Таламуса + 33.4
ми Рог Аммона + 4.15
мозжечок + 6.78
кора + 1.53
костный мозг + 1.41
Понс + 0.025
Таламуса + 95
фа Рог Аммона + 0.0221
мозжечок No u2012 0.00023
кора + 4.95
костный мозг No u2012 0.000556
Понс + 1.02
Таламуса + 89

Таблица 1: Определение количества копий гена RABV N в каждой структуре мозга. Результаты были получены из шести анатомических структур RABV-положительных мозгов крупного рогатого скота, диагностированных с помощью DFA. Слова, выделенные жирным шрифтом, указывают на структуры с большим количеством копий. Результаты были выражены как количество копий гена N на миллиграмм ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Предыдущие исследования показали, что DFA может обнаружить RABV только в течение семи дней после того, как образец хранится при комнатной температуре (21 градус по Цельсию)14. В отличие от этого, эта работа показала, что чувствительность RT-PCR начинает снижаться после того, как образцы подверглись воздействию комнатной температуры в течение 12 дней. Таким образом, геном RABV может быть обнаружен qRT-PCR в образцах, подверженных комнатной температуре до 23 дней. Это свидетельствует о том, что чувствительность qRT-PCR относительно выше для более высокоразложившихся образцов. Тем не менее, по-прежнему необходимо разработать более простые методы, которые не компрометацииспецифики 25. Настоящее исследование продемонстрировало молекулярный анализ, который обладает более высокой чувствительностью, чем DFA, на основе наблюдения, что он был в состоянии обнаружить вирусный геном независимо от конкретной структуры мозга.

Преимущества метода РТ-ПЦР для использования в выявлении инфекционных агентов были отмечены в нескольких научных исследованиях. Однако этот метод может показать некоторые недостатки, такие как стоимость исполнения, так как он требует специализированного оборудования. Обученный персонал необходим для обработки анализов молекулярной биологии. Кроме того, следует отметить, что в качестве высокочувствительных методов, некоторые из шагов имеют решающее значение для получения наилучших результатов. Одним из них является надлежащее обращение с образцами для извлечения РНК. Этот шаг имеет решающее значение, так как РНК легко деградирует, и, следовательно, результаты могут быть затронуты. Рассмотрите возможность поддержания образца в холодных условиях (примерно 4 градуса по Цельсию) во время процесса. Кроме того, учти, что несколько раундов применения ПЦР проводятся, как увекается в шаге 6.1 для генерации стенограммы in vitro. Это потому, что большое количество генетического материала необходимо для реакции, чтобы дать существенные (более миллиграмм) количества ДНК. Другим важным аспектом этого анализа является требование для очистки генетического материала в столбцах, так как ДНК также может быть потеряна во время этого шага.

известно, что qRT-PCR так же специфичен, как и тест DFA, который является стандартным тестом, одобренным ВОЗ и МЕО. Однако молекулярные анализы с использованием RT-qPCR показали более высокую чувствительность и, таким образом, позволяют провести анализ образцов с более высокой степенью разложения, чтобы облегчить обнаружение относительно небольшого числа копий вирусного генома. Это также гораздо быстрее, снижает риск заражения, и может быть использован до смерти26,27.

Бингем и ван Дер Мерве (2002)28 провели исследование с использованием DFA, чтобы определить, какие структуры мозга обладают более высокой концентрацией гена RABV N. Всего было оценено 252 структуры мозга нескольких видов. Таламус, понс и медулла были наиболее актуальными структурами мозга, так как они были положительными во всех оцениваемых образцах мозга. Эти результаты согласуются с результатами, представленными здесь, которые соответствовали результатам DFA в следующих структурах: кора и таламус, 100%; Medulla, 83,3%; понс, 66%; и рога, 50%. В отличие от этого, предыдущие исследования не сообщали о ложных негативах. В этой работе, некоторые отрицательные результаты были обнаружены в полных структур мозга, которые ранее были диагностированы как положительные. Это может быть потому, что часть образца, используемого для теста, не содержала вирусных частиц, идентифицированных антителами или более чувствительным молекулярным анализом. Другим возможным объяснением является то, что образцы не были должным образом транспортированы или сохранены до приема в лаборатории.

Анализ qRT-PCR, проведенный в этом исследовании, мог обнаружить всего 36,3 копии гена RABV N на миллиграмм ткани. Наиболее подходящими структурами мозга для qRT-PCR были кора и таламус. Это основано на наблюдениях, что более высокие концентрации гена RABV N были обнаружены в этих структурах и что они также были признаны положительными с помощью эталонного теста RABV. Тест был в состоянии обнаружить очень низкие концентрации (0.00023 х10 9 копий) вируса в различных образцах. В дополнение к количественной оценке вирусных частиц в образце, тест, как представляется, обеспечивает хороший альтернативный диагностический и исследовательский инструмент для обнаружения RABV.

С результатами, полученными с помощью протокола обнаружения вирусного генома вируса бешенства, представленного здесь, предполагается, что этот метод может быть применен для молекулярной диагностики вируса в различных типах образцов, так как способен обнаруживать минимальное количество вирусного генома. Его самым большим преимуществом по сравнению с другими методами, такими как DFA является то, что он является более чувствительным и может быть использован до смерти, как было предложено другими авторами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, чтобы заявить.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом сельскохозяйственных, лесных и животноводческих исследований (INIFAP). Мы благодарим Джерзайна Фраустро Esquivel за его сотрудничество в разработке видео, связанного с этим документом.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform SIGMA C7559 Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500 Zimo D4031 The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol Amresco 193-500 Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack Roche 3553400001 High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR BioRad XR+ Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed Biotium 41003 A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient BioRad 582BR Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit BioRad 1725141 Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol Amresco 0918-500 Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28706 QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase Invitrogen 28025-021 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary
DNA strand.
NanoDrop 2000 Thermo-Scientific ND2000 Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer Invitrogen SO132 The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 Promega P1300 In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase Invitrogen #EP0402 Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
 
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
  2. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
  3. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  4. Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
  5. Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
  6. Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
  7. David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
  8. Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
  9. Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
  10. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
  11. Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
  12. Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
  13. Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
  14. Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
  15. Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
  16. Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
  17. Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
  18. Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
  19. Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
  20. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  21. Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
  22. Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
  23. Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
  24. Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
  25. Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
  26. Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
  27. Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
  28. Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 171 вирус бычье паралитический бешенство qRT-PCR диагностика зооноз мозг
Количественная оценка вируса бешенства в различных структурах мозга крупного рогатого скота
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D.,… More

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D., Bárcenas-Reyes, I., Loza-Rubio, E. Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures. J. Vis. Exp. (171), e61429, doi:10.3791/61429 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter