Summary
Bu protokol, in vitro transkripsiyon kullanarak çeşitli sığır beyin anatomik yapıları içindeki kuduz virüsü nükleoprotein (N) gen kopya numarasını belirlemek için qRT-PCR tabanlı bir yaklaşım sunar.
Abstract
Sığır paralitik kuduz (BPR), büyük bir zoonotik risk oluşturduğu Latin Amerika'da önemli ekonomik öneme sahip bir viral ensefalit şeklidir. Burada amacımız, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanarak farklı sığır beyin anatomik yapılarında kuduz virüsü (RABV) genomunun bağıl kopya numarasını belirlemek için bir laboratuvar protokolü kullanmaktı. qRT-PCR, bir numunede bulunan belirli gen kopyalarının sayısını, örnekte bulunan hedef nükleik asit miktarıyla doğru orantılı olan amplifikasyondan sonra yayılan floresan bazlı olarak ölçendir. Bu yöntem, kısa süresi, kontaminasyon riskinin azalması ve farklı numunelerdeki viral nükleik asitleri diğer tekniklere göre daha kolay tespit etme potansiyeli nedeniyle avantajlıdır. Altı kuduz hayvanın beyni altı anatomik yapıya, yani Ammon boynuzu, beyincik, korteks, medulla, pons ve talamusa ayrılmıştır. Doğrudan immünoresans testinde tüm beyinlerin RABV antijenleri için pozitif olduğu belirlendi. Dört RABV negatif sığırın beyninden elde edilen anatomik yapıların aynısı da değerlendirildi. RNA her yapıdan çıkarılmış ve qRT-PCR için kullanılmıştır. RABV genlerinin kopya numaralarını belirlemek için in vitro transkript edilmiş nükleoprotein geni kullanılarak bir test yapıldı. Viral RNA'yı ölçmek için kullanılan standart eğri% 100 verimlilik ve 0.99 doğrusallık gösterdi. Analizler, korteks, medulla ve talamusun, bu yapıların en yüksek RABV seviyelerine sahip olduğu gözlemine dayanarak, RABV tespitinde kullanılmak üzere ideal CNS bölümleri olduğunu ortaya koydu. Test özgüllüğü %100 idi. Tüm örnekler pozitif çıktı, yanlış pozitif tespit olmadı. Bu yöntem BPR tanısı sırasında düşük düzeyde RABV içeren örneklerde RABV'yi tespit etmek için kullanılabilir.
Introduction
Kuduz, beyin, cilt, idrar veya tükürükteki viral nükleik asitlerin tespitini sağlayan çeşitli tekniklerle ante-mortem ve post-mortem olarak doğrulanabilir1. Kuduz virüsü nükleoprotein(N)geninin tespiti öncelikle moleküler testlerle kuduz tanısı için kullanılır. Bu gen viral genotipleme için de kullanılır. Kuduz, etkilenen beynin herhangi bir bölümünü kullanarak hayvanlarda teşhis edilebilir; bununla birlikte, kuduz olasılığını dışlamak için, beyindeki en az iki bölgeden doku test edilmelidir2. Hayvanlarda kuduz tespiti için çeşitli tanı yöntemleri mevcuttur; bununla birlikte, doğrudan immünofluoresans testi standart referans tekniği olmaya devam etmektedir3. Diğer testler arasında fare aşılama, doku kültüründe enfeksiyon ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)4içeren biyolojik testler yer almaktadır. Tüm bu teknikler, insanlarda ve hayvanlarda kuduz tanısı için Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIE) tarafından önerilmektedir, sırasıyla5.
Nükleik asit tespiti ve amplifikasyon teknikleri son yıllarda kuduz tanısında devrim sağlamıştır6 ve bu teknikler insan kuduzunun ante mortem tanısında önemli rol oynamaktadır. Ante-mortem ve post-mortem kuduz tanıları7,8,9,10için konvansiyonel testleri tamamlamak için çeşitli PCR tabanlı testler değerlendirilmiştir. Çoğu tahlil, viral genom 1,11'deen çok korunan bölge olan amplifikasyon için kuduz viral nükleoprotein genini hedefalmaktadır. Son 20 yılda RABV tanısı koymak için çeşitli moleküler tahliller geliştirilmiş ve bu testlerden bazıları virüs karakterizasyonu için kullanılmıştır. Çoğu çalışma, viral genomdaki korunmuş genleri tespit etmeyi amaçlamıştır, en yaygın olarak geleneksel veya nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) tahlillerikullanılarak 12,13.
PCR, bu dokular ayrıştığında bile dokular içindeki belirli bir patojenin genomlarını tespit edebilen son derece hassas bir tanı tekniğidir. PCR tabanlı yaklaşımlar kullanılarak, bir DNA nükleotid dizisinin seçici ve tekrarlayan amplifikasyonu yoluyla klinik bir örnekte minimum miktarda enfeksiyöz ajan tespit edilebilir14. floresan probları (örneğin, TaqMan) veya DNA bağlayıcı boyaları (örneğin, SYBR Green) içeren qRT-PCR, RABV'yi hem antehem de post- mortem'i yüksek hassasiyetle teşhis etmek için çalışmalarda kullanılmıştır; ancak, böyle bir yaklaşım özel ekipman gerektirir. Bu sınırlamayı aşmak için, RABV'nin tespiti için düşük maliyetine, basitliğine ve arzu edilen özelliklerine dayanarak ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) önerilmiştir. Bu tahlil özellikle gelişmekte olan ülkelerde kullanılabileceği için önemlidir15.
qRT-PCR, floresan sinyal artışlarının tek bir reaksiyondaki PCR ürün miktarıyla doğru orantılı olduğu bir molekülün tespitine ve nicelleştirilmesine dayanır. Nükleik asit hedefinin kopyalarının sayısı arttıkça floresan da artar. SYBR Green DNA bağlayıcı boya veya florofor ve quencher taşıyan sıraya özgü oligonükleotid problar gibi spesifik olmayan interkaling boyalar genellikle qRT-PCR'deki floresan okumayı sağlamak için kullanılır. Bu tahlil, daha kısa bir test süresi (2-4 saat), kapalı tüp sistemi nedeniyle kontaminasyon riskinin azalması (güçlendirilmiş ürünlerin PCR sonrası manipülasyon eksikliği) ve aynı anda farklı hedefleri tespit etme yeteneğini içeren geleneksel RT-PCR'ye göre avantajlar sunar16. qRT-PCR, tükürük ve diğer örneklerden kuduz ante-mortem tanısı koymak için kullanılabilir. Bu test, farklı Lyssavirus türlerinin veya RABV15soylarının tespiti için evrensel bir gerçek zamanlı test olarak da kullanılabilir. Bu kombo RT-PCR yaklaşımında iki reaksiyon kullanılır. Birincisi RABV'nin farklı genetik linajlarını, ikincisi ise Lyssavirus türlerini tespit eder. Her iki adım da qRT-PCR tahlillerini içerir, burada ilki hibridizasyon probları kullanır ve ikincisi boyalarkullanır 15. Bu tekniği kullanarak RABV'nin başarılı bir şekilde moleküler olarak tespit edildiğini gösteren çok sayıda test sayesinde, mevcut OIE Karasal El Kitabı (2018), RABV17'ninmoleküler tespiti için PCR kullanılmasını önermektedir.
Meksika önemli hayvancılık potansiyeline sahip bir ülkedir. Hayvancılık üretiminin en yüksek olduğu eyaletler, kuduzun ana vericisi olan vampir yarasa Desmodus rotundus'un varlığı nedeniyle kuduz salgınları için risk altında olan hem nemli tropikal bölgeleri hem de kuru bölgeleri içerir. Bu nedenle, México'da sığır paralitik kuduzunun (BPR) önlenmesi ve kontrolü için daha fazla araç geliştirmek önemlidir. Buna dayanarak, bu çalışmanın amacı kuduz enfeksiyonuna bağlı ölümü takiben sığır beyinlerinin farklı anatomik yapılarındaki viral parçacıkların sayısını belirlemek için nicel qRT-PCR kullanmaktı.
RABV pozitif sığırlardan elde edilen altı beyin, aşağıda açıklanan qRT-PCR protokolünün geliştirilmesinde kullanılmak üzere harici bir laboratuvar tarafından bağışlanmıştır. Sığır beyin yapısı örnekleri inifap CENID-MA laboratuvarı BSL-2 tesisine soğuk zincirle taşınmış ve kullanıma kadar -80 °C'de saklanmıştır. Beyinler Campeche, Yucatán ve Querétaro eyaletlerindeki hayvanlardan elde edildi. Makbuzdan önce, beyinlerden çeşitli yapılar parçalandı. Bu yapılar Ammon boynuzu, serebellum, korteks, medulla, pons ve talamus18,19'uiçeriyordu. Genetik materyal aşağıda açıklandığı gibi çıkarılmıştır. RABV tanısı doğrudan floresan antikorlar (DFA) kullanılarak doğrulandı20. Pozitif kontrol olarak RABV21 ile aşılanmış fare beyinleri kullanılmıştır. Ayrıca, dört RABV negatif sığır beyni (DFA tarafından belirlendiği gibi) negatif kontrol olarak kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından sağlanan hayvanların kullanımına yönelik tavsiyeler doğrultusunda onaylanmış ve yürütülmüştür.
1. Örnekler
- RT-PCR analizi için beynin 6 farklı kuduz pozitif sığır beyninden parçalanmış farklı bölgelerini kullanın.
2. Kuduzu doğrulamak için doğrudan floresan antikorlar (DFAs)
NOT: Kuduz antijeninin DFA tarafından tespit edilmesi, floresan etiketli antikorlar kullanılarak kuduz nükleoproteinin varlığını belirlemek için nitel bir yöntemdir. Test, aşağıda açıklandığı gibi Dean ve ark. (1966)20tarafından sağlanan protokol kullanılarak gerçekleştirildi.
- Yaklaşık 15 mm çapında steril bir slayt üzerinde farklı beyin yapılarından parçalanmış her dokudan iki izlenim bırakın. Dokunun yaklaşık 3mm 3 kısmını steril kaydırağa sürmek için ahşap bir aplikatör kullanın. Lekeyi oluşturmak için, ahşap aplikatörü slayta hafifçe bastırın.
- Slaytları -20 °C'de 1 saat boyunca %100 aseton olarak batırarak örnek leke slaytlarını sabitleyin. Kuluçkadan sonra, slaytları 21 °C'de kuru bir bez üzerinde 30 dakika kurutun.
- Bir şırıngamdan dağıtarak her beyin smear'ına 1:10 seyreltmede floresan etiketli anti-nükleoprotein antikorunun 50 μL'sini ekleyin.
- Slaytları konjuge ile 37 °C'de nemli bir odada 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, fazla konjugeyi ortadan kaldırmak için slaytları iki kez suyla ve PBS ile yıkayın. Slaytların 21 °C'de kurumasını bekleyin. Fazla sıvıyı çıkarmak için dikkatlice lekelenin ve montajdan önce kısa bir süre hava kurutun.
- Bölümün yüzeyini örtmek için% 50 fosfat gliserin damlası ekleyin ve ardından bir kapakla örtün. Epifluoresans mikroskobu altındaki bölümleri 40x büyütmede gözlemleyin.
- Pozitif ve negatif kontrolleri (pozitif kontrol: RABV ile aşılanmış fare beyinleri; negatif kontroller: RABV negatif sığır beyinleri) örneklerle aynı şekilde işleyin ve gözlemleyin.
3. RT-PCR için pozitif kontrol oluşturma
- Mikroplazm bankasından BHK-21 hücreleri alın. RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) suşunu 2.
- BHK-21hücrelerini, CO 2 (%5) varlığında 37 °C'de %10 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenmiş minimum esansiyel ortam (MEM) içeren şişelerde muhafaza edin ve yayın ve nemli koşullar altında. Hücreleri% 80 birışıklığa ve daha sonra alt kültüre ulaşana kadar25 cm 2 kültür şişelerinde büyütün.
- Kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve şişeyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. RABV strain ERA'nın 105 TCID/mL'si ile kültürü aşıla. Co 2 (%5) varlığında 37 °C'de sürekli sallanarak viral inokülüsleri2 saat kuluçkaya yatırın ve nemli koşullar altında.
- Enfeksiyon ortamını çıkarın ve% 5 (serum fetal sığır) SFB ile desteklenmiş MEM ekleyin. CO 2 (%5) varlığında 37 °C'de72 saat kuluçkaya yatır nemli koşullarda.
- Hücreler sitopatik etkiler sergilediğinde aşılamadan 3 gün sonra RABV hasat edin. Enfekte hücreleri dondurun ve hücreleri izne çıkarmak için 4 °C'de çözün. Ortamı şişeden toplayın ve ardından hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.050 x g'da santrifüjleme için bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
- RABV'den gelen süpernatantları -80 °C'de saklayın ve -70 °C'de depolama için çalışan aliquots hazırlayın.
- İntraserebrally, önceki adımda elde edilen virüsü 21 günlük dişi CD1 farelerine aşılar. 106 MICLD 50 (fare enfeksiyöz kültürü ölümcül doz% 50) içeren50 μL çözeltiyi aşılamak için 1 mL şırınna kullanın farelere dozlar22.
4. RNA ekstraksiyonu
NOT: Toplam RNA, aşağıdaki protokole göre organik ekstraksiyon yöntemi kullanılarak doğrudan sığır beyinlerinden çıkarılmıştır.
- Guanidium izotiyosiyanat içeren piyasada bulunan bir reaktif kullanarak toplam RNA çıkarmak için her anatomik yapıdan 100 mg beyin dokusu kullanın.
- Maksimum hızda 15 s için mikrotüp içinde küçük bir pestil ile bir Dounce homojenizat kullanarak girdap kullanarak guanidium izotiyosiyanat reaktifinin 1 mL'sinde her yapıdan toplam 100 mg dokuyu manuel olarak homojenize edin.
- Numuneleri 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve ardından 200 μL kloroform ekleyin. Numuneleri 15 sn boyunca kuvvetlice karıştırın, 2 ila 3 dakika buzda kuluçkaya yatırın ve ardından 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjlayın.
- Sulu fazı temiz bir tüpe aktarın ve 500 μL izopropil alkol ekleyin. Numuneleri 21 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj edin. Sulu süpernatantı pipetleme ile epire edin. İzole RNA tüpte bir pelet olarak mevcut olacaktır.
- Daha sonra, RNA peletini pipetleme ile% 75 etanol 1 mL ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 7500 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı kurutun ve RNA peletini oda sıcaklığında (21 °C) havayla kurutun. Daha sonra, peletin 50 μL çekirdeksiz suda seyreltin.
- Spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ve kalitesini 260 nm olarak belirleyin. Kullanıma kadar RNA'yı -80 °C'de saklayın.
- DNA'yı DNase I ile sindirerek RNA örneklerinden çıkarın. Ardından, 5 μL 10x reaksiyon tamponu ekleyin ve ardından 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın. Karışıma 1 μL EDTA ekleyerek DNase I'i devre dışı bırak ve ardından 65 °C'de 10 dakika kuluçka.
5. cDNA sentezi ve PCR
- Oligo dT ve ters transkriptaz kullanarak ilk iplikçik cDNA sentezlemek. Her 1 μg RNA için 1 μL oligo DT (500 μg/mL), 1 μL 10 mM dNTP karışımı ve 12 μL'lik son hacme çekirdeksiz damıtılmış su ekleyin. Karışımı 65 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Reaksiyon karışımını 4 °C'ye soğutun. Tüpü 1.050 x g'da30 sn sn santrifüjleyin ve ardından 4 μL reaksiyon tamponu, 2 μL 0,1 M DTT ve 1 μL ribononik önleyici (40 U/μL) ekleyin.
- Reaksiyon karışımını 37 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 1 μL ters transkriptaz (200 U) ekleyin. Daha sonra, reaksiyon karışımını 37 ° C'de 50 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından reaksiyonun 70 ° C'de 15 dakika boyunca inaktive edin.
- Kullanmadan önce cDNA'yı -20 °C'de saklayın.
NOT: Sentezlenen cDNA'nın kalitesini doğrulamak için, sentez in vitrosunu gerçekleştirmeden önce RABV N geninin 761 bp'lik bir parçasının amplifikasyonunun gerçekleştirilmesi gerçekleştirilir. Aşağıdaki 5.5. adımda açıklandığı gibi Loza-Rubio ve ark.11 tarafından açıklanan protokolü kullanın. - Aşağıdaki koşullar altında Taq DNA polimeraz kullanarak PCR gerçekleştirin. Reaksiyon kurulumini aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 20 mM MgCl 2,0,2mM dNTP içeren 10x Taq tamponu, 1 U Taq polimeraz, her astarın 10 μM'si (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ ve SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2.5 μL cDNA ve ultra saf su 50 μL'lik son hacme.
- Aşağıdaki bisiklet koşullarını kullanarak bir termosikleyicide amplifikasyonu gerçekleştirin: 3 dakika boyunca 95 ° C; 30 s için 95 ° C 35 döngü, 30 s için 60 ° C ve 1 dakika için 72 ° C; 7 dakika boyunca 72 °C'lik bir döngü.
- % 1 agarose jel kullanarak 761 bp PCR ürünlerinin varlığını değerlendirin.
6. Tüp bebek transkripsiyon
NOT: In vitro transkripsiyon hedef genin mRNA'ını oluşturur. Tam RABV N genini yükselten ve qRT-PCR tahlili için pozitif kontrol olarak kullanılan bir astar çifti kullanın. Bu astarlar, tam RABV N genini güçlendirmek ve T7 polimerazını (TAATACGACTCACTATAG) tanıyan bir promotör eklemek için tasarlanmıştır.
- Tüm N geni RABV'yi güçlendirmek için Trans-Nrab ileri (5ʹ gatgagtcactcgaatatattcttctt 3ʹ) ve ters (5ʹ caataatacgactcactataggatgccgacaagatt 3ʹ) ve yüksek kaliteli bir PCR kiti kullanın.
- Her reaksiyon için, temiz bir PCR tüp reaksiyon tamponu 10x ekleyerek bir PCR ana karışımı hazırlayın, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTP, her astarın 10 μM'si, 0,5 U yüksek kaliteli polimeraz, 1,5 μL cDNA (adım 5'te hazırlanmış) ve ultra saf su 50 μL'lik son hacme kadar.
- Amplifikasyon için aşağıdaki koşullara ayarlanmış bir termosikler kullanın: 1 dakika boyunca 94 °C; 1 dakika için 94 °C, 1 dakika için 40 °C ve 2 dakika için 72 °C döngü; 1 dakika için 94 °C, 1 dakika için 60 °C ve 2 dakika için 72 °C 35 döngü; 2 dakika boyunca 72 °C'nin son uzantısı.
- PCR ürününü in vitro sentez için bir şablon olarak kullanmak ve enzimatik reaksiyonun bileşenlerini adım 6.1.2'den çıkarmak için, PCR ürününü üreticinin talimatlarına göre sütun tabanlı bir yoğunlaştırıcı kiti kullanarak arındırın ve ardından bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
- RNA sentezi için, aşağıdaki reaksiyon karışımına sahip bir in vitro transkripsiyon kiti kullanın: 5 μL T7 Transkripsiyon 5x tampon, her trifosfat nükleotitten 1,9 μL, 10 μg saflaştırılmış RABV N DNA VP2 DNA ve enzim karışımının 2,5 μL'si. Daha sonra, karışımı 37 °C'de 4 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Ardından, reaksiyon karışımına 1 μL 1 U/μg RNase Içermeyen DNaz ekleyin ve DNA kirlenmesini ortadan kaldırmak için 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Tüp bebek transkriptif RNA'sını saflaştırın ve fenol:kloroform:izoamil alkol kullanarak konsantre edin (25:24:1).
- Saflaştırılmış RNA peletini 70 μL TE arabelleğine yeniden depolayın ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
- PCR protokolünü adım 6.1'den yaklaşık 5 μg PCR ürünü elde edilene kadar tekrarlayın. Saflaştırma ve konsantrasyondan sonra, in vitro transkript N gen mRNA 4.711 μg / μL konsantrasyonda mevcut olacaktır.
- In vitro transkriptörlü mRNA'nın bu protokolün 5.
7. Gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)
- qRT-PCR için, üreticinin talimatlarına göre hibridizasyon probları kullanan ticari bir tek adımlı qRT-PCR kiti ile birlikte pozitif bir kontrol olarak tam N genini kodlayan bir in vitro mRNA transkript kullanın. RABV geni N'nin korunmuş bir bölgesini tespit etmek için Carneiro ve ark.(2010) 23 tarafından açıklanan prob ve astarları kullanın (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, ve BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).
- Aşağıdaki termal bisiklet koşullarını kullanın: 10 dakika için 50 °C 1 döngü ve 2 dakika için 95 °C; 15 s için 95 °C 40 döngü ve 30 sn için 50 °C.
8. Kalibrasyon eğrisi veya standart eğri
- Altı dektil seyreltme elde edilene kadar 1 μg/μL mRNA'yı tüplere seri olarak pipetleme yaparak in vitro transcribed mRNA'nın seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Tüpleri standart eğriyi oluştururken kullanılmak üzere üç taraflı olarak 100 μL hacimde hazırlayın. QRT-PCR'ı 7.
- QRT-PCR'yi, çeşitli beyin örneklerini standart eğriyi oluşturmak için çalışan reaksiyonlarla aynı anda işleyerek ve hücre kültüründen izole edilmiş pozitif kontroller, negatif kontroller ve süpernatantlar kullanarak bir rotorlu termosikler halinde gerçekleştirin.
- Testin algılama, test etkinliği ve duyarlılığı sınırını değerlendirmek için, aynı koşullar altında üç taraflı olarak standart bir eğri kullanın.
9. biyolojik örneklerin qRT-PCR'si
- RABV gen N'nin tespiti için, 7.
- Sığır beyin örneklerinde bulunan RABV genomunun kopya sayısını belirlemek için, standart eğri ve biyolojik örneklerden ve kalibrasyon eğrisi denkleminden enterpolasyonlu olanlardan Ct verileri elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DFA sonuçları korteks, talamus, medulla, pons ve kornada RABV için sırasıyla %100, %100, %83,3, %66 ve %50 pozitiflik gösterdi. Bu sonuçlar önceki sonuçları doğruladı ve her beyinden incelenen yapılardan en az üçü RABV için pozitifti. Şekil 1'detemsili pozitif DAF boyama gösterilmiştir.
Şekil 2, RABV N geninin bir parçasının (adım 5.5) Loza-Rubio ve ark.11tarafından bildirilen astarlarla yükseltilmesini göstermektedir. Bu, amplifikasyonda kullanılmak üzere elde edilen malzemenin kaliteli olduğunu gösterdi.
PCR ile güçlendirilmiş parçanın boyutu Şekil 3'te gösterilmiştir. Standart eğrinin denklemi, bir örnekteki RABV genetik içeriğinin miktarı ile PCR ile güçlendirilmiş parçanın boyutu arasındaki ilişkiyi gösterir. RABV genetik içeriğinin miktarı (in ng), Şekil 4'tesunulan denklem kullanılarak kalibrasyon eğrisinde Ct değerlerinin enterpolasyonu ile ortaya çıktı. Bu denklem kullanılarak, 1 x 105 μg/μL viral RNA algılama sınırının RABV genomunun 36 kopyasına karşılık geldiği bulunmuştur. Bu sonuçlar, tahlilin hassas olduğunu ve düşük sayıda kopya RABV N geni içeren örneklerde virüsü tespit etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Tahlilin verimliliği -3.28 olan standart eğrinin eğimi kullanılarak hesaplandı. qRT-PCR için kullanılan örneklerde RABV N geninin amplifikasyonu saptandı.
Mevcut viral kopya sayısını belirlemek için, her numunenin Ct değerleri kalibrasyon eğrisi denklemi kullanılarak enterpolasyona alındı. Elde edilen sonuç (nanogram olarak) aşağıdaki hakemden aşağıda açıklanan formüle ikameedildi.
Kopya sayısı RABV N geni = (ng örnek * 6.022 x 1023) / (104 bp (PCR ürün uzunluğu) * 1 x 109 * 650).
Karşılaştırmalı olarak, qRT-PCR tahlillerinin sonuçları DFA kullanılarak elde edilenlerle tutarlıydı. QRT-PCR testinde elde edilen sonuçlara göre C ve D olgularında(Tablo 1),talamus RABV N geninin en yüksek sayıda kopyasına sahip yapıdır. Bu, hipotalamik ve talamik nöronların erken enfeksiyonunun, bu nöronların bir hayvanın vejetatif işlevlerini kontrol ettiği göz önüne alındığında, hastalığın gelişiminde önemli olduğunu göstermektedir. Her numunenin her yapısında tespit edilen RABV N geninin kopya numaraları Tablo 1'degösterilmiştir. QRT-PCR testinin hassasiyeti ve özgüllüğü tüm örnekler pozitif olduğu için %100 idi. Bu sonuç, örneklerin ilk teşhisleriyle tutarlıdır.
Şekil 1: Enfekte dokularda kuduz virüsü protein N'yi tespit eden doğrudan immünofluoresans testine göre pozitif lekelenme gösteren sığır beyin dokuları. Antikorun kuduz antijenine bağlandığı lekelenme üzerine elma yeşili bir renklenme görülür. Ölçek çubuğu: 50 μm Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Amplifikasyon ürünlerini gösteren% 1.5 agarose jel. Rabv N geninin 761 bp'lik bir parçasının amplifikasyonu, in vitro transkripsiyonda kullanılacak cDNA'nın varlığını ve kalitesini göstermek için. Şerit 1 moleküler ağırlık işareti içerir, çizgi 2: pozitif kontrolün amplifikasyonu; şerit 3: negatif kontrol (enfekte olmayan örnek); hat 4: in vitro transkripsiyon için kullanılan cDNA'nın amplifikasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Amplifikasyon ürünlerini gösteren% 1.5 agarose jel. Tam N geninin amplifikasyonu şerit 2'de gösterilmiştir. Şerit 1 moleküler ağırlık işareti içerir ve şerit 3 negatif amplifikasyon kontrolünü içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: RABV N geninin kopya sayısını ölçmek için in vitro transkript N geni mRNA kullanarak qRT-PCR'nin standart eğrisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Kimlik beyni | yapı | DAF | Sayı kopyaları (x109) |
| A | Ammon boynuzu | + | 0.261 |
| beyincik | + | 0.0663 | |
| Korteks | + | 0.02 | |
| Medulla | + | 0.146 | |
| Pons | + | 30.7 | |
| talamus | + | 108 | |
| B | Ammon boynuzu | - | 0.0251 |
| beyincik | + | 4.64 | |
| Korteks | + | 12.4 | |
| Medulla | + | 0.175 | |
| Pons | \u2012 | 0.0721 | |
| talamus | + | 121 | |
| C | Ammon boynuzu | \u2012 | 0.168 |
| beyincik | + | 0.0239 | |
| Korteks | + | 21.5 | |
| Medulla | + | 17.2 | |
| Pons | + | 1.32 | |
| talamus | + | 102 | |
| D | Ammon boynuzu | + | 11.8 |
| beyincik | + | 0.0239 | |
| Korteks | + | 8.72 | |
| Medulla | + | 1.25 | |
| Pons | \u2012 | 0.0165 | |
| talamus | + | 33.4 | |
| E | Ammon boynuzu | + | 4.15 |
| beyincik | + | 6.78 | |
| Korteks | + | 1.53 | |
| Medulla | + | 1.41 | |
| Pons | + | 0.025 | |
| talamus | + | 95 | |
| F | Ammon boynuzu | + | 0.0221 |
| beyincik | \u2012 | 0.00023 | |
| Korteks | + | 4.95 | |
| Medulla | \u2012 | 0.000556 | |
| Pons | + | 1.02 | |
| talamus | + | 89 |
Tablo 1: Her beyin yapısında RABV N geninin kopya sayısının belirlenmesi. DFA kullanılarak teşhis edilen RABV pozitif sığır beyinlerinin altı anatomik yapısından sonuç alındı. Kalın olarak vurgulanan sözcükler, en çok kopya içeren yapıları gösterir. Sonuçlar, N geninin miligram doku başına kopya sayısı olarak ifade edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önceki çalışmalar, DFA'nın RABV'i sadece numunenin oda sıcaklığında (21 °C)14'tedepolanmasının yedi gün içinde tespit dabileceğini göstermiştir. Buna karşılık, bu çalışma, numuneler 12 gün boyunca oda sıcaklığına maruz kaldıktan sonra RT-PCR'nin hassasiyetinin azalmaya başladığını göstermiştir. Bu nedenle RABV genom, 23 güne kadar oda sıcaklığına maruz kalan örneklerde qRT-PCR ile tespit edilebilir. Bu, daha fazla ayrışmış numuneler için qRT-PCR duyarlılığının nispeten daha yüksek olduğunu göstermektedir. Ancak, özgüllükten ödün vermeyen daha basit yöntemler geliştirmek gerekli olmaya devam ediyor25. Mevcut araştırma, belirli beyin yapısından bağımsız olarak viral genomun tespit edebildiği gözlemine dayanarak DFA'dan daha yüksek hassasiyete sahip bir moleküler test göstermiştir.
RT-PCR tekniğinin enfeksiyöz ajanların tespitinde kullanılmasındaki avantajları çeşitli bilimsel çalışmalarda vurgulanmıştır. Bununla birlikte, bu teknik özel ekipman gerektirdiğinden, yürütme maliyeti gibi bazı dezavantajlar sergileyebilir. Moleküler biyoloji testlerini yapmak için eğitimli personel gereklidir. Ayrıca, son derece hassas bir teknik olarak, bazı adımların en iyi sonuçları elde etmek için kritik olduğu belirtilmelidir. Bunlardan biri, RNA ekstraksiyonu için numunelerin uygun şekilde işlenmesidir. RNA kolayca bozulabileceği ve bu nedenle sonuçlar etkilenebileceği için bu adım çok önemlidir. İşlem sırasında numuneyi soğuk koşullarda (yaklaşık 4 °C) korumayı düşünün. Ek olarak, transkript in vitro oluşturmak için adım 6.1'de belirtildiği gibi birkaç pcr uygulaması turu gerçekleştirildiğini düşünün. Bunun nedeni, reaksiyonun önemli miktarda (miligramdan fazla) DNA elde etmesi için çok miktarda genetik materyalin gerekli olmasıdır. Bu testin bir diğer önemli yönü, bu adım sırasında DNA da kaybedilebileceğinden, sütunlardaki genetik materyalin saflaştırılması gereksinimidir.
qRT-PCR'nin, WHO ve OIE tarafından onaylanan standart test olan DFA testi kadar spesifik olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, RT-qPCR kullanan moleküler tahlillerin daha yüksek hassasiyete sahip olduğu ve böylece viral genomun nispeten az sayıda kopyasının tespitini kolaylaştırmak için daha yüksek derecede ayrışma olan örneklerin analizine izin verdiği gösterilmiştir. Ayrıca çok daha hızlıdır, kontaminasyon riskini azaltır ve ante-mortem26,27kullanılabilir.
Bingham ve van Der Merwe (2002)28, hangi beyin yapılarının RABV N geninin daha yüksek konsantrasyonlarına sahip olduğunu belirlemek için DFA kullanarak bir çalışma yaptı. Çeşitli türlerden toplam 252 beyin yapısı değerlendirildi. Talamus, pons ve medulla, değerlendirilen tüm beyin örneklerinde pozitif oldukları için en alakalı beyin yapılarıydı. Bu sonuçlar, burada sunulan ve aşağıdaki yapılarda DFA sonuçlarıyla tutarlı olan sonuçlarla uyumludur: korteks ve talamus, % 100; medulla, %83,3; pons, 66%; ve korna, %50. Buna karşılık, önceki çalışmalarda yanlış negatif bildirilmedi. Bu çalışmada daha önce pozitif tanısı konmuş komple beyin yapılarında bazı olumsuz sonuçlar tespit edilmiştir. Bunun nedeni, numunenin test için kullanılan kısmının antikor veya daha hassas moleküler test tarafından tanımlanan viral parçacıklar içermemesi olabilir. Başka bir olası açıklama, numunelerin laboratuvarda kabul edilmeden önce düzgün bir şekilde taşınmamış veya depolanmamış olmasıdır.
Bu çalışmada yapılan qRT-PCR tahlili, rabv N geninin miligram doku başına 36,3 kadar kopyasını tespit edebilir. qRT-PCR için en uygun beyin yapıları korteks ve talamusu içeriyordu. Bu, bu yapılarda RABV N geninin daha yüksek konsantrasyonlarının tespit edildiği ve RABV referans testi kullanılarak da pozitif olduklarının tespit edildiği gözlemlerine dayanmaktadır. Test, çeşitli örneklerde virüsün çok düşük konsantrasyonlarını (0.00023 x10 9 kopya) tespit edebildi. Örnekteki viral parçacıkları ölçmeye ek olarak, test RABV'nin tespiti için iyi bir alternatif tanı ve araştırma aracı sağladığı görülmektedir.
Burada sunulan kuduz virüsü viral genom tespit protokolü kullanılarak elde edilen sonuçlarla, viral genomun minimum miktarda tespit edilebilmesi nedeniyle bu tekniğin farklı örnek türlerinde virüsün moleküler tanısı için uygulanabileceği öngörülmektedir. DFA gibi diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, diğer yazarlar tarafından önerildikçe daha hassas olması ve ante-mortemkullanılabilmesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Tarım, Ormancılık ve Hayvancılık Araştırmaları Enstitüsü (INIFAP) tarafından desteklendi. Jerzayn Fraustro Esquivel'e bu belgeyle ilişkili videonun geliştirilmesindeki işbirliği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | SIGMA | C7559 | Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil. |
| DNA Clean & Concentrator-500 | Zimo | D4031 | The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations. |
| Ethanol | Amresco | 193-500 | Purification of nucleic acids |
| FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack | Roche | 3553400001 | High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes |
| GelDoc XR | BioRad | XR+ | Analyzes larger protein and DNA gels |
| GelRed | Biotium | 41003 | A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells. |
| iCycler Thermal Cycler Gradient | BioRad | 582BR | Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | BioRad | 1725141 | Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes |
| Isopropyl alcohol | Amresco | 0918-500 | Precipitation of nucleic acids |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-021 | Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand. |
| NanoDrop 2000 | Thermo-Scientific | ND2000 | Microvolume Spectrophotometer |
| Oligo(dT)18 primer | Invitrogen | SO132 | The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends. |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 | Promega | P1300 | In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | #EP0402 | Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples. |
References
- Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
- CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
- Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
- Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
- Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
- David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
- Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
- Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
- Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
- Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
- Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
- Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
- Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
- Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
- Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
- Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
- Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
- Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
- Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
- Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
- Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
- Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
- Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).
