Summary
Chick ciliaere ganglier (CG) er en del af det parasympatiske nervesystem. Neuronal kulturer af chick CG neuroner blev vist sig at være effektive cellemodeller i studiet af nervemuskel interaktioner. Vi beskriver en detaljeret protokol for dissektion, dissociation og in vitro kultur CG neuroner fra kylling embryoner.
Abstract
Chick ciliaere ganglier (CG) er en del af det parasympatiske nervesystem og er ansvarlige for innervation af muskelvæv til stede i øjet. Denne ganglion er konstitueret af en homogen population af ciliaere og choroidal neuroner, der innervatetriated og glatte muskelfibre, henholdsvis. Hver af disse neuronal typer regulere specifikke øjenstrukturer og funktioner. I årenes løb, neuronal kulturer af chick ciliaere ganglier blev vist sig at være effektive cellemodeller i studiet af muskel-nervesystem interaktioner, som kommunikerer gennem kolinriske synapser. Ciliaere ganglion neuroner er, i sit flertal, kolinsyre. Denne celle model har vist sig at være nyttig forholdsvis til tidligere anvendte heterogene cellemodeller, der omfatter flere neuronale typer, foruden kolinsyre. Anatomisk, den ciliaere ganglion er lokaliseret mellem synsnerven (ON) og choroid revne (CF). Her beskriver vi en detaljeret procedure for dissektion, dissociation og in vitro kultur ciliaiske ganglier neuroner fra kylling embryoner. Vi leverer en trinvis protokol for at opnå meget rene og stabile cellulære kulturer af CG neuroner, fremhæver vigtige trin i processen. Disse kulturer kan opretholdes in vitro i 15 dage, og hermed viser vi den normale udvikling af CG kulturer. Resultaterne viser også, at disse neuroner kan interagere med muskelfibre gennem neuro-muskulære kolinsyre synapser.
Introduction
Ciliaere ganglion (CG) neuroner tilhører det parasympatiske nervesystem. Disse neuroner er kolinsyre, at være i stand til at etablere muskcarinic eller nicotinic synapser1,,2,,3. Anatomisk, CG er placeret i den bageste del af øjet mellem synsnerven (ON) og choroid revne (CF) og består af omkring 6000 neuroner i tidlige embryonale stadier1,4. For den første uge i kultur, ciliaere ganglion neuroner præsentere en multipolær morfologi. Efter en uge, de begynder at overgangen til en unipolar tilstand, med en neurite udvide og danne axon5. Desuden dør ca. halvdelen af CG-neuroner mellem den8. th Dette fald i antallet af neuroner resulterer i en samlet population af den ciliaere ganglion på omkring 3000 neuroner6,,7,8. In vitro, der er ingen reduktion i antallet af CG neuroner, når dyrkes med muskelceller9 og CG neuroner kan dyrkes i flere uger1,9.
Den ciliaere ganglion består af en homogen population af ciliaere neuroner og choroidal neuroner, hver repræsenterer halvdelen af den neuronale befolkning i CG, innervating musklen i øjet. Disse to typer af neuroner er strukturelt, anatomisk og funktionelt adskilte. Ciliary neuroner innervate de tværstribede muskelfibre på iris og linse, være ansvarlig for elevsammentrækning. Choroidal neuroner innervate den glatte musklen i choroid1,10,,11,,12.
Kulturer af kylling ciliaere ganglion neuroner har vist sig at være nyttige værktøjer til undersøgelse af neuromuskulære synapser og synapse dannelse1,5,9. I betragtning af at neuromuskulære synapser er kolinsyre13,ved hjælp af en neuronal befolkning, der er kolinsyre – CG neuroner – fremstod som et potentielt alternativ til tidligere cellemodeller14. Disse modeller bestod i en heterogen neuronal population, hvor kun en lille del er kolliner. Alternativt, ciliaere ganglion neuroner udvikle relativt hurtigt in vitro, og efter ca 15 timer allerede form synapser1. CG neuroner har været brugt som et modelsystem gennem årene for forskellige forskningsundersøgelser, på grund af sin relativt let isolation og manipulation. Disse anvendelser omfatter optogenetiske undersøgelser, synapse udvikling, apoptose og neuromuskulære interaktioner14,,15.
Vi beskriver en detaljeret procedure for dissektion, dissociation og in vitro kultur ciliaary ganglier neuroner fra embryonale dag 7 (E7) kylling embryoner. Vi leverer en trin-for-trin protokol for at opnå meget rene og stabile cellulære kulturer af kolinsyre neuroner. Vi fremhæver også de vigtigste trin i protokollen, der kræver særlig opmærksomhed, og som vil forbedre kvaliteten af de neuronale kulturer. Disse kulturer kan opretholdes in vitro i mindst 15 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af reagenser
BEMÆRK: De materialer, der er nødvendige for denne procedure, er følgende: pincet (nº 5 og nº 55), kirurgisk pincet, dissektionstensskåle (sort bund), 24-brøndsplader, pasteurpipette af plast, brandpoleret glas Pasteurpipette, 10 ml sprøjte, 0,22 μm sprøjtefilter.
- Klargør og steriliser alt det materiale, der er nødvendigt for protokollen, herunder glascoverslips, pincet (nº 5 og nº 55), kirurgiske pincet, petriskåle (sort bund), destilleret H2O, pipetter og materiale til kirurgi.
- Klargør 0,1 mg/ml Poly-D-lysinopløsning (PDL).
- Rekonstituere PDL i 0,1 M boratbuffer (pH 8.2) til en koncentration på 1 mg/ml (10x opløsning).
- 1:10 fortyndes i 166,6 mM boratbuffer (pH 8.2) for at opnå en endelig koncentration på 0,1 mg/ml.
- Der tilberedes 10 μg/ml lamininopløsning.
- 1 mg/ml laminin fortyndes i almindeligt neurobasalt medium til en slutkoncentration på 10 μg/ml.
- Klargør Hanks balancerede saltopløsning (HBSS): 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO4·2H2O, 5 mM glukose, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES buffer, 0,001% phenolrød. PH-værdien indstilles til 7,2.
- Forbered 0,1% trypsin opløsning.
- 5 mg trypsin 1:250 pulver opløses i 5 ml HBSS for en slutkoncentration på 0,1%.
- I en rulleblander på plads ved 4 °C, indtil den er helt opløst.
- Filter med en 10 ml sprøjte og et 0,22 μm sprøjtefilter.
- Forbered ciliær ganglier ufuldstændigmedium: neurobasal medium uden glutamin, 1X B27 (foto-følsomme), 10% varme-inaktiveret hest serum, 2% varme-inaktiveret FBS, 12,5 U / ml penicillin / streptomycin (0,25x) og 2 mm glutamin. Brug sterile reagenser og klargør mediet under sterile forhold.
- Forbered ciliaere ganglier komplet medium (suppleret med vækstfaktorer): til det ufuldstændige medium, tilsæt 5 ng/ml GDNF og 5 ng/ml CNTF.
2. Forberedelse af glasbetrækslips til 24-brøndplader
- Placer det ønskede antal glasdæksler i en syrefast beholder, og tilsæt 65 % salpetersyre, indtil alle dæksler er nedsænket. Anbragt beholderen i en orbital shaker og inkuber natten over ved stuetemperatur (RT) med en hastighed på 1000 rpm.
- Den næste dag, forsigtigt overføre salpetersyren til et lille reservoir og opbevares til videre brug. Salpetersyre kan genforstøres 2-3x.
- Der tilsættes forsigtigt destilleret H2O til overtrækslipsene for at fjerne den resterende salpetersyre. I omrøring i 30 minutter kasseres vaskeopløsningen, og denne 5x gentages.
- Skyl dækslerne med 75% ethanol to gange.
- Forsigtigt adskilles og placeres individuelle overtrækslips i en metalrist dækket med aluminiumsfolie og inkuberer ved 50 ºC i 10-15 minutter eller indtil den er helt tør.
BEMÆRK: Autoklave glas dæksler ikke, da de vil holde sig til hinanden. - Steriliser dækslerne under UV-lys i 10-15 minutter. Opretholde coverslips sterile for neuronal væv kultur.
3. Belægning af glasbetrækslips til 24-brøndplader
- Ved hjælp af en steril pincet, placere en coverslip i hver brønd af en 24-brønd plade.
- Der tilsættes 500 μL 0,1 mg/ml PDL og inkuber natten over ved 37 °C.
- Den næste dag, skyl dækslerne to gange med sterile destilleret H2O. Derefter tilsættes 500 μL destilleret vand til hver overtrækslip og lad det stå i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vandet kasseres, og der tilsættes 350 μL 10 μg/ml lamininopløsning i hver brønd.
- I en 37 °C inkubator i 2 timer indfældes.
- Før cellebestøvning fjernes lamininopløsningen, og der vaskes to gange med almindeligt neurobasalt medium.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at betrækslippen ikke tørrer på noget tidspunkt. - Der tilsættes 300 μL komplet medium, og der efterlades i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 indtil plating-tiden. Før plating celler, fjerne dette medie.
4. Kultur af ciliaiske ganglier fra kylling embryo (embryonale dag 7)
- Dissektion af ciliaere ganglier (CG)
- Fjern æg fra inkubator og spray dem med 75% ethanol.
BEMÆRK: Æggene opbevares ved ~16 °C, inden de inkuberes ved 37,7 °C i 7 dage (eller det ønskede embryonale stadium). Æg, der anvendes her, er fra Ross kylling arter. - Skær toppen af ægget med en saks og tag fosteret ud med en ske. Embryoet placeres i en petriskål med iskold HBSS, og hovedet adskilles fra kroppen ved at skære i halsregionen.
BEMÆRK: Så snart fosteret er fjernet fra ægget, kan det producere proteaser, der er ansvarlige for celledød. Det er vigtigt hurtigt at adskille hovedet fra kroppen, når fosteret er uden for skallen for at minimere celledød. - Hold embryonets hoved i iskold HBSS.
- Hold fosterhovedet op og fastgør det i næbbet på kyllingen med nº 5-ytringstøjninger. Derefter begynder med nº 55 pincet at fjerne det tynde lag af huden omkring øjet.
- Fjern forsigtigt øjet og drej det for at få adgang til den bageste del. Mens adskille øjet fra hovedet af chick, bemærk synsnerven bliver snittet. Dette vil bidrage til at lokalisere ciliaere ganglion.
- Når øjet er adskilt, holde det med den bageste side op og læg mærke til ciliaere ganglion støder op til den sektionsopsnitte synsnerven og choroid revne. Den preganglionic nerve kan stadig være knyttet til ciliaere ganglion, som letter dens identifikation.
- Dissekere ciliaere ganglion fra hvert øje og rense meget godt ved at fjerne det overskydende væv omkring hver ganglion.
BEMÆRK: At have et udbytte på ~ 1x106 celler / ml, dissekere ~ 70 CGs. Bemærk, at den opnåede cellepopulation også indeholder ikke-neuronale celler. For at reducere antallet af ikke-neuronale celler og dermed øge renheden af den neuronale population, er det meget vigtigt at rense ciliaerne så meget som muligt, fjerne alle de overskydende væv.
- Fjern æg fra inkubator og spray dem med 75% ethanol.
- Dissociation og kultur af ciliaere ganglier
- Saml alle ciliaiske ganglier til en 15 ml rør ved hjælp af en steril plast Pasteur pipette.
BEMÆRK: Det er vigtigt at fortræde Pasteur pipetten for at minimere fastgørelsen af ganglieret til pipettens væg. - Ciliiliiliic ganglieret centrifugeres i 2 minutter ved 200 x g.
- Fjern omhyggeligt alle HBSS medium ved hjælp af en Pasteur pipette og derefter en P1000 mikropipette. Der tilsættes 1 ml 0,1 % trypsinopløsning, og der inkuberes i 20 minutter ved 37 °C i et vandbad uden omrøring.
- Centrifugering i 2 minutter ved 200 x g.
- Fjern straks trypsinopløsningen, og tilsæt 1 ml ufuldstændigt medium.
BEMÆRK: Ufuldstændigt medium indeholder serum, som straks vil stoppe effekten af trypsin. - Centrifuge i 2 minutter ved 200 x g og fjern alt medium.
- Der tilsættes 350-500 μL komplet medium.
BEMÆRK: Den nødvendige volumen til at adskille celler afhænger af antallet af ciliaere ganglier opnået, og dermed af den opnåede pellet størrelse. For ~ 70 CG anbefales det at bruge 500 μL medium. - Dissociate CGs ved pipettering op og ned 10-15x først ved hjælp af en P1000 efterfulgt af 10-15x ved hjælp af en brand-poleret glas Pasteur pipette. Undgå luftbobledannelse for at minimere celletab.
BEMÆRK: Hold cellulære suspension på is indtil plating. - Bestem cellulær tæthed ved hjælp af en Trypan blå opløsning og en standard Neubauer kammer.
- Plade 1 x 104 celler/ml i hver brønd af 24-brøndspladen ved fortynding af det passende volumen af cellesuspension i 500 μL komplet medium (suppleret med 10 μM 5'-FDU).
- Inkubér celler i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Saml alle ciliaiske ganglier til en 15 ml rør ved hjælp af en steril plast Pasteur pipette.
5. Immunocytokemi og billedanalyse af ciliaere neuroner
- Immunocytokemianalysen udført i dette dokument som tidligere beskrevet16,17.
- Brug følgende primære antistoffer: mus monoklonale b-III tubulin (1:1000, T8578), kylling monoklonale neurofilament M (1:1000, AB5735), mus monoklonnal SV2 (1:1000, AB2315387).
- Som sekundære antistoffer, bruge Alexa Fluor 568-konjugerede ged anti-mus antistof (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-konjugerede ged anti-kylling antistof (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-konjugeret ged anti-mus antistof (1:1000, A21235).
- Mount coverslips ved hjælp af montering medium med DAPI, for nuklear farvning (P36935).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den anslåede varighed af denne procedure afhænger nøje af det udbytte, der er nødvendigt for hvert enkelt eksperiment, og dermed af antallet af ciliaiske ganglier, der skal isoleres. For et anslået udbytte på 1 x 106 celler/ml, isolere omkring 70 ciliaere ganglier (35 æg). For dette antal ganglier, vil det tage 2-3 timer for dissektion procedure og i alt 4-5 timer for den samlede procedure. En trinvis illustration af isolationsprotokollen er vist i figur 1A. Identifikationen af ciliaere ganglion kan være svært, især når du udfører denne protokol for første gang. Den ciliaere ganglion er lokaliseret i nærheden af synsnerven og choroid revne (Figur 1B). De vigtigste trin i dissektionsproceduren er vist i figur 2. Først fjernes embryonet fra ægget og placeres i iskold HBSS. Hovedet er adskilt fra kroppen og, endnu en gang, placeret i iskold HBSS i en dissektion petriskål (Figur 2A-2C). Derefter fjernes øjet fra kyllingens hoved, og den ciliaere ganglion isoleres (Figur 2D-2H).
De kulturer, der opnås med denne protokol, er meget rene. Men rengøring af ganglier og fjernelse af det overskydende væv stærkt dikterer succes og renhed af kulturen. Cellerne udvikler sig hurtigt og kan allerede bruges i de første dage i kulturen, hvis det samlede eksperiment kræver det. Ikke desto mindre kan kulturerne opretholdes i 15 dage eller mere. Hvis du bruger kulturerne i mere end 7-8 dage, skal du sørge for at erstatte en tredjedel af kulturmediet med frisk medium hver 2-3 dage. Efter 1 dag in vitro, CG neuroner viser en multipolær morfologi. Men, neurite udvidelse sker hurtigt, og en primær neuronal netværk er allerede etableret efter 24 timer. Efter 8 dage in vitro, neuroner allerede overgået til en unipolar tilstand, hvor en af neuritter udvider og danner axon. Det neuronale netværk er meget tæt på dette udviklingsstade (figur 3 og figur 4).
Ciliaere ganglion neuroner er kolinsyre neuroner, der hører til det parasympatiske nervesystem. In vivo, disse neuroner er ansvarlige for muskel innervation i øjet. Disse neuronale kulturer er meget velegnet til studiet af neuromuskulære synapser. Til dette, CG neuroner kan belagt på toppen af muskelceller. Kyllingekjlen blev dissekeret og fik lov til at udvikle og maturate in vitro indtil DIV 4. CG neuroner blev derefter belagt på toppen af muskellaget og co-kultur lov til at udvikle sig i 3 dage mere. På dette tidspunkt, muskelfibre dannes og kan let identificeres ved tilstedeværelsen af flere kerner (blå). Synaptisk vesikel glycoprotein 2A (SV2) immunsintainering, en præsynaptisk markør viser tilstedeværelsen af synapser, der er etableret mellem CG neuroner axoner og muskelfibre (Figur 5).
Figur 1: Skemaet for dissektionsprotokollen og ciliaerne ganglion. (A) Diagram over isolations- og kulturprotokollen. (B) Ordningen af chick ciliaere ganglion lokalisering i den bageste del af øjet. Synsnerven, ciliaere ganglion og choroid revne er angivet med pile. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dissektion af E7 chick ciliaere ganglion. (A)Skær toppen af ægget med en saks. (B)Fjern embryonet fra ægget med en ske og læg det i en dissektion petriskål med iskold HBSS. (C)Adskil hovedet fra kroppen ved at skære i halsregionen. DD) Embryoets hoved fastgøres i næbbet med en kraft nº 5. (E)Fjern øjet ved forsigtig rotation med forcep nº 55. (F) Posterior visning af øjet. Pile angiver lokalisering af synsnerven, choroid revne og ciliaere ganglion. (G) Dissekere ciliaere ganglion. (H) Dissekeret ciliary ganglion. Overskydende væv bør fjernes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ciliary ganglion neuroner udvikling in vitro. Fase kontrast billeder af CG neuroner på DIV 1, 3, 8 og 15. Som CG neuroner er belagt, de straks indlede neurite udvækst. På DIV 15, axonal netværket er meget tæt og på dette tidspunkt neurites er helt differentieret i dendritter og axoner. Fase kontrast-billeder blev erhvervet ved hjælp af en konforossen mikroskop med en plan-Apochromat 20x ph2 mål. Skala bar: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Immunocytokemi af CG neuroner på DIV 8. CG neuroner viser en veletableret neuronal netværk efter 8 dage in vitro. Kerner blev plettet med DAPI (blå) og axoner blev plettet med b-III tubulin (rød). Fluorescens imagens blev erhvervet ved hjælp af en konfokal mikroskop med en plan-Apochromat 20x mål. Skala bar: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kulturperler CG neuroner etablere synapser med muskelfibre. Immunocytokemi billeder af CG neurons-brystmusklen co-kulturer. Muskelfibre identificeret ved stiplede linjer præsentere flere kerner, som blev plettet med DAPI (blå). Axoner var mærket mod neurofilament (rød) og synaptiske vesikler blev mærket mod SV2 (cyan). Billeder blev erhvervet ved hjælp af en konfostmikroskop med en plan-Apochromat 63x olie mål. Skala bar: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol demonstrerede vi, hvordan man forbereder og kultur CG neuroner. Identifikation og dissektion af ciliaere ganglion kan være svært for uerfarne brugere. Derfor præsenterer vi en detaljeret og trin-for-trin procedure til effektivt dissekere E7 chick ciliaere ganglier, adskille væv og forberede neuronal kulturer, der kan opretholdes i mindst 15 dage. De ciliaere ganglion neuroner opnået med denne protokol er også velegnet til co-kultur med muskelceller.
Ciliaere ganglier på forskellige udviklingsstadier af kylling embryonale udvikling kan bruges som en celle model, afhængigt af formålet med undersøgelsen. For kulturer af CG-neuroner foreslås det dog, at de isoleres fra kyllingembryon mellem embryonale dage 7 og 818. I fosterfasen E8 har CG-neuroner endnu ikke gennemgået neuronale dødsprocesser, og antallet af ikke-neuronale celler reduceres forholdsvis med neuronaleceller 18. Dette, i kombination med en streng dissektion procedure og meget godt renset ganglier, vil bidrage til en meget ren kultur af ciliaere ganglion neuroner, med lidt forurening med ikke-neuronale celler, såsom fibroblaster eller gliaceller.
Under isolering af CG neuroner, et af de kritiske punkter er identifikation og rengøring af CG. Dissektion af sådan en lille struktur, som ciliaere ganglion, kan være svært i betragtning af lokalisering, evnen til at identificere ganglion samt størrelsen af ganglion selv. Det er normalt, at gangliaerne kan knytte til krafthæcen under dissektion. Høj kvalitet dissektion instrumenter er meget vigtigt for en vellykket dissektion og vil minimere fastgørelsen af ganglier til kraftpper. Rengøring af GC er vigtigt for at forhindre forurening med ikke-neuronale celler. Det er nødvendigt at isolere ca. 70 ganglier for at opnå en cellulær tæthed på ~ 1x106 celler/ml, i modsætning til andre neuronale væv i det perifere nervesystem, der har en 5-15x større antal ganglier3.
I kultur, tilsætning af 5'-FDU til det komplette medium reducerer forurening af GC kultur med ikke-neuronale celler. 5'-FDU er en anti-mitotisk forbindelse, der hæmmer cellespredning, nemlig spredning af gliaceller og fibroblaster. Koncentrationen af 5'-FDU tilsat mediet er nok til at stoppe cellecyklussen i S-fasen, men er ikke skadelig for den normale udvikling af CG-neuroner3,19,20. Behandlingstiden med 5'-FDU kan justeres. Men da CG neuroner etablere et tæt axonal netværk i en kort tid, 5'-FDU bør føjes til kulturen så tidligt som tidspunktet for plating.
En af de vigtigste begrænsninger ved denne model er, at det ikke er repræsentativt for den normale udvikling af CG neuroner under fysiologiske forhold. I ovo, omkring halvdelen af CG neuroner dør mellem den 8th og 14th dag af chick embryo udvikling. I kultur, der er ingen nedgang i antallet af CG neuroner, når mediet er suppleret med neurotrofiskefaktorer,der tillader dens overlevelse1,6,14.
Den neuronale population opnået ved dissektion af chick ciliaere ganglion er en homogen population af kolinsyre neuroner, der tilhører det autonome nervesystem. Det skal bemærkes, at udtrykket af neurotransmittere i choroid populationen af CG er mål-drevet, som kan være hæmmet afhængigt af den type muskel, der anvendes i co-kultur24. Hvis formålet med undersøgelsen er relateret til den genetiske identitet eller undertype af motor neuron selv, så CG neuroner måske ikke være den bedst egnede neuronal model. Også, specificiteten af motoriske neuroner i innervation af muskelfibre kan ikke opnås, når du bruger CG neuron co-kulturer, da, i dette tilfælde, muskelfibre kan formere innervated25. Men denne neuronal kultur har flere fordele, det kræver kun grundlæggende udstyr til at opretholde og inkubere æggene, det er en rimelig billig procedure og, endnu vigtigere, giver en fremragende model for studiet af neuromuskulære synapser1, da CG neuroner neurotransmission mekanismer er meget lig dem, der forekommer i spinal motor neuroner. De cellemodeller, der tidligere blev anvendt til denne typeundersøgelser,var sensoriske neuronerfra rygmarven 12,,21,,22,23. Men, disse co-kulturer var sammensat af en heterogen population af neuroner, ikke alle kolinsyre og dermed kun en lille del af neuroner var i stand til at etablere funktionelle kontakter med muskelceller1. Ud over den udviklingsmæssige analyse (immunocytokemi) demonstreret i dette arbejde andre analyser kan udføres i CG kulturer som elektrofysiologi og neuronal overlevelse.
Baseret på denne protokol yderligere videnskabelige spørgsmål kan løses, for eksempel hvordan subcellulære lokalisering af specifikke mRNAs og proteiner regulerer synapse dannelse og funktion. Desuden kan nervemuskel co-kulturer let etableres og yderligere anvendes til at studere neuromuskulære sygdomme, når stedet for skade er det neuromuskulære kryds. Neuromuskulære sygdomme er heterogene i naturen i den forstand, at dysfunktion kan være forbundet med musklen selv, de perifere nerver eller neuromuskulære vejkryds26. Således gennem disse co-kulturer ville det være muligt at studere neuromuskulære kryds ændringer, der i sidste ende ligger til grund for udvikling og progression af neuromuskulære sygdomme. En anden interessant mulighed ville være at tilpasse denne protokol til musen trigeminal system. Disse neuroner er let tilgængelige, og deres udviklingsmæssige mønster er velkendt27. Fordi mus er modtagelige for genetisk manipulation og trigeminussystemet er godt karakteriseret i form af topografiske kort dannelse nye muligheder opstår ved hjælp af en trigeminal-baseret protokol til at studere neuronal udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU) gennem Centro 2020's regionale operationelle program under projekter CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS og gennem COMPETE 2020 - Det operationelle program for konkurrenceevne og internationalisering og portugisiske nationale midler via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under projekter UIDB/04539/2020 UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, og de individuelle tilskud SFRH/BD/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/14109 2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) og af Marie Curie Actions - IRG, 7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
