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Neuroscience

독실성 신경절 뉴런의 고립과 문화

doi: 10.3791/61431 Published: August 8, 2020
* These authors contributed equally

Summary

병아리 섬모 신경질 (CG)는 부교감 신경계의 일부입니다. 병아리 CG 뉴런의 신경 배양신경 근육 상호 작용의 연구에서 효과적인 세포 모델 것으로 나타났다. 우리는 병아리 배아에서 CG 뉴런의 해부, 해리 및 체외 문화에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

병아리 섬모 신경질 (CG)는 부교감 신경계의 일부이며 눈에 존재하는 근육 조직의 내면화를 담당합니다. 이 신경절은 섬모와 코로이드 뉴런의 균일 한 인구에 의해 구성되며, 내면의 무늬와 부드러운 근육 섬유는 각각. 이러한 신경 유형의 각각특정 눈 구조 와 기능을 조절. 수년에 걸쳐, 병아리 섬모 신경질의 신경 배양은 해막 시냅스를 통해 통신하는 근육 신경계 상호 작용의 연구 결과에 있는 효과적인 세포 모형으로 보였습니다. Ciliary 신경절 뉴런은, 그것의 대다수에서, 콜린성. 이러한 세포 모델은 이전에 사용되는 이질세포 모델들이 여러 신경세포를 포함하는 비교적 유용하게 사용되어 왔으며, 그 외에 는 콜린성 이외에. 해부학적으로, 섬모 신경절은 시신경(ON)과 코로이드 균열(CF) 사이에 국한된다. 여기에서, 우리는 병아리 배아에서 섬모 신경신경의 해부, 해피 및 체외 문화에 대한 상세한 절차를 설명합니다. 우리는 CG 뉴런의 매우 순수하고 안정적인 세포 배양을 얻기 위해 단계별 프로토콜을 제공하여 프로세스의 주요 단계를 강조합니다. 이러한 문화는 15일 동안 체외에서 유지될 수 있으며, 이를 통해 CG 문화의 정상적인 발전을 보여줍니다. 결과는 또한 이 뉴런이 신경 근육 질의 시냅스를 통해 근육 섬유와 상호 작용할 수 있음을 보여줍니다.

Introduction

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Ciliary 신경절 (CG) 뉴런은 부교감 신경계에 속한다. 이러한 뉴런은 해골성이며, 무스카린 또는 니코틴 시냅스1,,2,,3을설정할 수 있다. 해부학적으로, CG는 시신경(ON)과 코로이드 균열(CF) 사이의 눈의 후방 부분에 위치하며 초기 배아 단계1,,4에서약 6000뉴런으로 구성된다. 문화의 첫 주에 대 한, 섬 모 성 신경 절개 뉴런은 다극성 형태를 제시. 일주일 후, 그들은 축 하5확장 하 고 형성 하는 하나의 neurite와 함께 단극성 상태로 전환 하기 시작. 또한, CG 뉴런의 약 절반은 병아리 배아 발달의8일과 14일 사이에 세포 사멸의 프로그램된 과정을 통해 죽는다. 이 뉴런의 수의 감소는 약 3000 뉴런66, 7,7,8의섬모 신경절의 총 인구 결과. 시험관에서는, 근육세포9와 CG 뉴런으로 성장하면 CG 뉴런의 수가 감소하지않으며,CG 뉴런은 몇 주 동안 배양될 수 있다1,9.

섬광 신경절은 모분 뉴런과 치오로이드 뉴런의 균일 한 인구로 구성되어 있으며, 각각 CG에서 신경 인구의 절반을 나타내며 눈의 근육을 내면화합니다. 뉴런의 이 두 가지 유형은 구조적으로, 해부학적으로 기능적으로 구별됩니다. Ciliary 뉴런은 홍채와 렌즈에 줄무늬 근육 섬유를 내면으로 고정하여 동공 수축을 담당합니다. 코로이드 뉴런은 코로이드1,10,,,11,,12의부드러운 근육을 내면으로 한다.

닭 섬모 신경절 신경절 뉴런의 배양신경신경은 신경 근육 시냅스와 시냅스 형성1,,5,,9의연구에 유용한 도구로 표시되었습니다. 신경근육 시냅스가13이며,해조류인 신경인구를 사용하여 CG 뉴런이 이전 세포모델(14)에대한 잠재적 대안으로 떠올랐다. 이 모형은 단지 작은 부분이 해병인 이종성 신경 인구에서 이루어져 있습니다. 대안적으로, 섬모 신경절 뉴런은 시험관 내에서 상대적으로 빠르게발전하고, 약 15시간 후에 이미 시냅스1을형성한다. CG 뉴런은 분리와 조작의 상대적으로 용이성 으로 인해, 독특한 연구 연구를 위한 수년에 걸쳐 모델 시스템으로 사용 되었습니다. 이러한 응용 분야는 광유전학 연구, 시냅스 개발, 세포사멸 및 신경 근육 상호 작용14,,15를포함한다.

우리는 배아 일 7 (E7) 병아리 배아에서 섬모 신경신경의 해부, 해리 및 체외 문화에 대한 상세한 절차를 설명합니다. 우리는 콜린성 뉴런의 매우 순수하고 안정적인 세포 배양을 얻기 위해 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 특별한 주의를 필요로하고 신경 문화의 질을 향상시킬 프로토콜의 주요 단계를 강조. 이러한 문화권은 적어도 15일 동안 시험관내에서 유지될 수 있다.

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Protocol

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1. 시약 준비

참고 : 이 절차에 필요한 재료는 다음과 같습니다 : 집게 (nº 5 및 nº 55), 수술 핀셋, 해부 페트리 접시 (검은 바닥), 24 웰 플레이트, 플라스틱 파스퇴르 파이펫, 화재 광택 유리 파스퇴르 파이펫, 10 mL 주사기, 0.22 μm 주사기 필터.

  1. 유리 커버립, 집게(nº 5 및 nº 55), 수술 핀셋, 페트리 접시(검은 바닥), 증류된 H2O, 파이펫 및 수술용 소재를 포함하여 프로토콜에 필요한 모든 재료를 준비하고 살균합니다.
  2. 0.1 mg/mL 폴리-D-리신(PDL) 용액을 준비한다.
    1. 0.1 M 붕산 완충액 (pH 8.2)에서 1 mg / mL (10x 용액)의 농도로 PDL을 재구성합니다.
    2. 희석 1:10 에서 166.6 mM 붕산 완충제 (pH 8.2) 0.1 mg/mL의 최종 농도를 얻을 수 있습니다.
  3. 10 μg/mL 라미닌 용액을 준비합니다.
    1. 10 μg/mL의 최종 농도에 일반 신경 물질 매체에 1 mg/mL 라미닌을 희석.
  4. 행크의 균형 잡힌 소금 솔루션 (HBSS): 5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4,137 mM NaCl, 4.16 mM NaHCO3, 0.34 mMNa2HPO·42H2 O, 5 mM 포도당, 1 mM 나트륨 pyruvate, 10 m HEPES 버퍼, 00 m HEPES 버퍼, 00 mM HEPES.2 pH를 7.2로 조정합니다.
  5. 0.1% 트립신 솔루션을 준비합니다.
    1. 용해 5 트립신 의 mg 1:250 분말 에 5 ML HBSS의 최종 농도0.1%.
    2. 완전히 용해 될 때까지 4 °C의 롤러 믹서에 놓습니다.
    3. 10mL 주사기와 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 필터링합니다.
  6. 글루타민이 없는 신경물질 매체,1X B27(사진 민감성), 열불식 말 혈청 10%, 열비활성화 FBS 2%, U/mL 페니실린/스트렙토마이신(0.25x) 및 2mM 글루타민을 준비한다. 멸균 시약을 사용하고 멸균 조건에서 배지를 준비하십시오.
  7. 고분 검소 전체 매체를 준비 (성장 인자로 보충): 불완전 한 매체에, 추가 5 ng/mL GDNF 와 5 ng/mL CNTF.

2. 24웰 플레이트용 유리 커버립 준비

  1. 원하는 수의 유리 커버립을 산내 내성 용기 안에 넣고 모든 커버립이 물에 잠길 때까지 65%의 질산을 추가합니다. 컨테이너를 궤도 셰이커에 넣고 실온(RT)에서 하룻밤 동안 1000rpm의 속도로 배양합니다.
  2. 다음 날, 조심스럽게 작은 저수지에 질산을 전송하고 추가 사용을 위해 저장합니다. 질산은 2-3배 재사용할 수 있다.
  3. 조심스럽게, 나머지 질산을 제거하기 위해 커버립에 증류 된 H2O를 추가합니다. 30분 동안 교반에 놓고 세척 용액을 버리고 이 5x를 반복하십시오.
  4. 커버립을 75%의 에탄올로 두 번 헹구습니다.
  5. 알루미늄 호일로 덮인 금속 랙에 개별 커버립을 조심스럽게 분리하고 놓고 50 ºC에서 10-15 분 또는 완전히 건조 할 때까지 배양하십시오.
    참고 : 유리 커버립이 서로 달라 붙는 것처럼 자동 복제하지 마십시오.
  6. 10-15분 동안 자외선 아래에서 커버립을 살균합니다. 신경 조직 배양에 대한 커버립 멸균을 유지합니다.

3. 24웰 플레이트용 유리 커버립 코팅

  1. 멸균 트위저를 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에 하나의 커버슬립을 놓습니다.
  2. 0.1 mg / mL PDL의 500 μL을 추가하고 37 ° C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
  3. 다음 날, 멸균 증류 H2O로 커버립을 두 번 헹구는 다. 그런 다음 각 커버슬립에 증류수 500μL을 추가하고 실온에서 30분 동안 둡니다.
  4. 물을 버리고 각 우물에 10 μg /mL 라미닌 용액의 350 μL을 추가하십시오.
  5. 37°C 인큐베이터에 2시간 동안 배치합니다.
  6. 세포 도금 전에 라미닌 용액을 제거하고 일반 신경 물질 매체로 두 번 씻으시면 됩니다.
    참고 : 커버립이 언제든지 건조하지 않는 것이 중요합니다.
  7. 완전한 중간 크기의 300 μL을 추가하고 도금 시간까지 37 °C및 5 % CO2의 인큐베이터에 둡니다. 세포를 도금하기 전에 이 매체를 제거하십시오.

4. 닭배아로부터 의양성 간골의 문화 (배아일 7)

  1. 섬모 간골의 해부 (CG)
    1. 인큐베이터에서 계란을 제거하고 75 %의 에탄올로 스프레이하십시오.
      참고: 계란은 ~16°C에서 저장되어 7일 동안 37.7°C(또는 원하는 배아 단계)로 배양됩니다. 여기에 사용되는 계란은 로스 치킨 종에서 입니다.
    2. 가위로 계란의 상단을 잘라 숟가락을 사용하여 배아를 꺼내. 얼음차가운 HBSS를 곁들인 페트리 접시에 배아를 놓고 목 부위를 절단하여 머리를 몸과 분리합니다.
      참고: 배아가 계란에서 제거되는 즉시 세포 사멸을 담당하는 프로테아이를 생성할 수 있습니다. 배아가 세포 사멸을 최소화하기 위해 껍질 밖에 있으면 머리를 몸에서 빠르게 분리하는 것이 중요합니다.
    3. 얼음 차가운 HBSS에 태아의 머리를 유지합니다.
    4. 배아 머리를 들고 nº 5 집게로 병아리의 부리에 고정하십시오. 그런 다음 nº 55 포셉을 사용하여 눈 주위의 얇은 피부 층을 제거하기 시작합니다.
    5. 조심스럽게 눈을 제거하고 후방 부분에 액세스하기 위해 회전합니다. 병아리의 머리에서 눈을 분리하는 동안, 시신경이 절제되는 것을 주의하십시오. 이것은 섬모 신경절을 현지화하는 데 도움이됩니다.
    6. 눈이 분리되면 후방 측으로 유지하고 절개 된 시신경과 코로이드 균열에 인접한 섬모 신경절을 확인하십시오. 사전 신경은 아직도 그것의 식별을 용이하게 하는 섬모 신경절에 붙어 있을 지도지도 신경절에 붙어 있을 지도 모릅니다.
    7. 각 눈에서 섬모 신경절을 해부하고 각 신경절 주위의 과잉 조직을 제거하여 아주 잘 청소합니다.
      참고 : ~ 1x106 셀 / mL의 수율을 갖기 위해 ~ 70 개의 CD를 해부하십시오. 얻어진 세포 인구에는 비신경 세포도 포함되어 있습니다. 비신경 세포의 수를 감소시키고, 결과적으로, 신경 인구의 순도를 증가시키기 위해, 모든 과잉 조직을 제거, 가능한 한 섬모 신경을 청소하는 것이 매우 중요하다.
  2. 섬모 적 중의 해리와 문화
    1. 멸균 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 15mL 튜브에 모든 섬모 신경을 수집합니다.
      참고: 파이펫 벽에 신경리아의 부착을 최소화하기 위해 파스퇴르 파이펫을 미리 적재하는 것이 중요합니다.
    2. 200 x g에서2 분 동안 심모 성 간리를 원심 분리합니다.
    3. 조심스럽게, 파스퇴르 파이펫을 사용하여 모든 HBSS 매체를 제거하고 P1000 마이크로 파이프를 제거합니다. 0.1% 트립신 용액 1mL을 넣고 교반 없이 수조에서 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
    4. 200 x g에서2 분 동안 원심 분리기.
    5. 트립신 용액을 즉시 제거하고 불완전한 매체 1mL을 추가합니다.
      참고: 불완전한 매체에는 트립신의 효과를 즉시 중지하는 혈청이 포함되어 있습니다.
    6. 200 x g에서 2 분 동안 원심 분리기를 제거하고 모든 매체를 제거합니다.
    7. 완전한 매체의 350-500 μL을 추가합니다.
      참고: 세포를 해리시키는 데 필요한 부피는 얻어진 섬모 성 졸리아의 수에 따라 달라지며, 따라서 얻어진 펠릿 크기에 따라 달라집니다. ~70 CG의 경우 배지 500 μL을 사용하는 것이 좋습니다.
    8. P1000을 사용하여 10-15배 위아래로 파이프를 한 다음, 불을 닦은 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 10-15배씩 진동하여 CG를 분리합니다. 세포 손실을 최소화하기 위해 기포 형성을 피하십시오.
      참고: 도금될 때까지 셀룰러 서스펜션을 얼음 위에 보관하십시오.
    9. Trypan 블루 솔루션과 표준 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 밀도를 결정합니다.
    10. 플레이트 1 x 104 셀/mL은 완전한 배지의 500 μL에서 적절한 셀 서스펜션 의 적량을 희석시킴으로써 24웰 플레이트의 각 웰에 (10 μM 5'-FDU로 보완).
    11. 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양한다.

5. 모성 뉴런의 면역 세포 화학 및 이미지 분석

  1. 이전에 설명된 바와 같이 본 논문에 제시된 면역세포화학 분석체를,17수행한다.
  2. 마우스 모노클로날 b-III 튜룰린(1:1000, T8578), 닭고기 모노클론 신경필라멘트 M(1:1000, AB5735), 마우스 모노클로날 SV2(1:1000, AB2315387)를 사용한다.
  3. 이차 항체로서, 사용 알렉사 플루오르 568-공주 염소 항 마우스 항체 (1:1000, A11031), 알렉사 플루어 568 -컨쥬게이트 염소 항 닭 항체 (1:1000, A11041), 알렉사 플루어 647 공주 염소 항 마우스 항체 (1:1200, A11041), 알렉사 플루어 647 공주 염소 항 마우스 항체 (1:120).
  4. 탈것은 핵 염색(P36935)을 위해 DAPI가 장착된 배지를 사용하여 커버를 마운트합니다.

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Representative Results

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이 절차에 대한 예상 기간은 각 특정 실험에 필요한 수율에 따라 밀접하게 달라지므로 격리해야 하는 섬모 간질 수에 따라 달라집니다. 추정 수율 1 x 106 세포/mL의 추정 수율을 위해 약 70개의 섬모 간질(35개의 계란)을 분리합니다. 이 수의 회랑의 경우 해부 절차에 2-3 시간, 총 절차에 대해 총 4-5 시간이 소요됩니다. 격리 프로토콜의 단계별 그림은 도 1A에표시됩니다. 특히 이 프로토콜을 처음 수행할 때 섬모 신경절의 식별이 어려울 수 있습니다. 섬광 신경절은 시신경 과 코로이드균열(도 1B)근처에서 국한된다. 해부 절차의 주요 단계는 그림 2에표시됩니다. 첫째, 배아는 계란에서 제거되고 얼음 차가운 HBSS에 놓습니다. 머리는 몸에서 분리되고, 다시 한 번, 해부 페트리 접시에 얼음 차가운 HBSS에 배치(그림 2A-2C). 이어서, 눈은 병아리의 머리로부터 제거되고 섬모 신경절은 고립된다(도2D-2H).

이 프로토콜로 얻은 배양은 매우 순수합니다. 그러나, 간질을 청소하고 과잉 조직을 제거하는 것은 강하게 문화의 성공과 순도를 지시한다. 세포는 빨리 개발하고 전반적인 실험이 그렇게 요구하는 경우에 배양에 있는 첫번째 일에 이미 이용될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 문화는 15일 이상 유지될 수 있습니다. 배양을 7-8일 이상 사용하는 경우 배양 매체의 3분의 1을 2-3일마다 신선한 배지로 교체해야 합니다. 시험관에서 1 일 후에, CG 신경은 다극성 형태를 보여줍니다. 그러나, 중성성 확장은 급속하게 발생하고, 1차 신경망은 이미 24시간 후에 설치됩니다. 시험관에서 8 일 후에, 뉴런은 이미 호뇌의 한개확장하고 축축을 형성하는 단극성 상태로 전환되었습니다. 신경망은 개발 단계에서 매우 조밀하다(그림3도 4).

Ciliary 신경절 신경은 부교감 신경계에 속하는 콜린성 뉴런입니다. 생체 내에서, 이러한 뉴런은 눈에 근육 내면에 대 한 책임. 이러한 신경 배양신경 근육 시 냅 스의 연구에 대 한 매우 적합. 이를 위해, CG 뉴런은 근육 세포의 상단에 도금 될 수있다. 병아리 가슴 근육은 해부되었고 DIV 4까지 시험관에서 개발하고 매트하게 할 수 있었습니다. CG 뉴런은 근육 층 위에 도금되었고 공동 배양은 3 일 이상 발전할 수 있었습니다. 이 시점에서, 근육 섬유가 형성되고 다중 핵(blue)의 존재에 의해 쉽게 식별될 수 있다. 시냅스 소포 당단백질 2A(SV2) 면역염색, 사전 시냅스 마커는 CG 뉴런 축슨과 근육 섬유 사이에 확립된 시냅스의 존재를나타낸다(도 5).

Figure 1
그림 1: 해부 프로토콜 및 섬모 신경절의 구성표입니다. (A)격리 및 배양 프로토콜의 다이어그램. (B)눈의 후방 부분에서 병아리 섬모 신경절 국소화의 계획. 시신경, 섬모 신경절 및 코로이드 균열은 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: E7 병아리 섬모 신경절의 해부. (A)가위를 사용하여 계란의 상단을 잘라. (B)숟가락으로 계란에서 배아를 제거하고 얼음 차가운 HBSS와 해부 페트리 접시에 놓습니다. (C)목 부위에서 절단하여 머리를 몸으로부터 분리합니다. (D)부리에 배아의 머리를 고정하고, 포스p nº 5로 들고 있다. (E)포스p nº 55를 사용하여 부드러운 회전으로 눈을 제거합니다. (F)눈의 후방 보기. 화살표는 시신경, 코로이드 균열 및 섬모 신경의 국소화를 나타냅니다. (G)섬모 신경절을 해부한다. (H)해부 된 섬모 신경절. 과잉 조직은 제거되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 체외에서 Ciliary 신경절 뉴런 개발. DIV 1, 3, 8 및 15에서 CG 뉴런의 위상 대비 이미지. CG 뉴런이 도금되면 즉시 중성염을 시작합니다. DIV 15에서 축축산 네트워크는 매우 조밀하며이 단계에서 중성염은 완전히 원점과 축축으로 분화됩니다. 위상 대비-이미지는 계획-아포크로마트 20x ph2 목표를 가진 공초점 현미경을 사용하여 획득되었다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: DIV 8에서 CG 뉴런의 면역 세포 화학. CG 뉴런은 시험관에서 8 일 후에 잘 확립 된 뉴런 네트워크를 보여줍니다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었고 축축은 b-III 튜룰린 (빨간색)으로 염색되었다. 형광 심상은 계획 - 아포크로마트 20배 목표를 가진 공초점 현미경을 사용하여 획득되었다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 배양 된 CG 뉴런은 근육 섬유와 시냅스를 설정합니다. CG 뉴런-가슴 근육 공동 배양의 면역 세포화학 이미지. 대시 라인에 의해 확인된 근육 섬유는 DAPI (파란색)로 염색 된 여러 핵을 제시한다. 축 축 은 신경 필라멘트에 대 한 표시 했다 (빨 강) 시 냅 스 소포 SV2에 대 한 표시 되었다 (시안). 이미지는 계획 - 아포크로마트 63x 오일 목표를 가진 공초점 현미경을 사용하여 획득되었다. 스케일 바: 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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이 프로토콜에서 CG 뉴런을 준비하고 배양하는 방법을 시연했습니다. 섬모 신경절의 식별 및 해부는 경험이없는 사용자에게 어려울 수 있습니다. 따라서, 우리는 E7 병아리 섬모 신경통을 효율적으로 해부하고, 조직을 해리하고, 적어도 15 일 동안 유지 될 수있는 신경 배양을 준비하는 상세하고 단계별 절차를 제시한다. 이 프로토콜로 얻은 섬모 신경절 뉴런은 근육 세포와의 공동 배양에도 적합합니다.

병아리 배아 발달의 다른 발달 단계에서 Ciliary 신경리아는 연구의 목적에 따라 세포 모델로 사용될 수 있다. 그러나, CG 뉴런의 배양에 대해서는 배아일 7일과8일사이에 병아리 배아로부터 분리되는 것이 좋습니다. 배아 단계에서 E8, CG 뉴런은 아직 뉴런 사멸 과정을 거치지 않았으며 비신경 세포의 수는 뉴런세포(18)와비교하여 감소된다. 이것은 엄격한 해부 절차와 아주 잘 청소된 신경통과 함께 섬유아세포 나 신경세포와 같은 비 신경 세포에 의한 오염이 거의 없는 섬모 신경절 뉴런의 매우 순수한 배양에 기여할 것입니다.

CG 뉴런을 격리하는 동안 중요한 점 중 하나는 CG의 식별 및 세척입니다. 이러한 작은 구조의 해부는 섬모 신경절과 마찬가지로, 국소화, 신경절 자체의 크기뿐만 아니라 신경절을 식별하는 기능을 고려하기 어려울 수 있다. 해부 중에 검정이 집게에 부착할 수 있는 것은 정상입니다. 고품질 해부 계측기는 성공적인 해부에 매우 중요하며 집게에 대한 간질의 부착을 최소화합니다. GC를 청소하는 것은 비 신경 세포에 오염을 방지하기 위해 중요하다. 약 70개의 신경리아를 분리하여 ~1x106 세포/mL의 세포 밀도를 얻기 위해, 5-15배 더 많은 수의 신경질3가3있는 말초 신경계의 다른 신경 조직과 는 대조적으로 분리할 필요가 있다.

배양에서, 완전한 배지에 5'-FDU를 첨가하면 비신경 세포로 GC 배양의 오염이 감소한다. 5'-FDU는 세포 증식, 즉 신경교 세포 및 섬유아세포의 증식을 억제하는 항 미토틱 화합물입니다. 배지에 첨가된 5'-FDU의 농도는 S상에서 세포 주기를 멈추기에 충분하지만 CG 뉴런3,,19,,20의정상적인 발달에 해롭지 않다. 5'-FDU로 치료 시간을 조정할 수 있습니다. 그러나 CG 뉴런이 단기간에 조밀한 축축네트워크를 확립하기 때문에 5'-FDU를 도금 시초에 배양에 추가해야 한다.

이 모델의 주요 한계 중 하나는 생리적 조건하에서 CG 뉴런의 정상적인 발달을 대표하지 않는다는 것입니다. 오보에서는, CG 뉴런의 대략 반은 병아리 태아 발달의 8일과 14사이에서 정지합니다. 배양에서는, 배지가생존1,,6,614를허용하는 신경영양인으로 보충될 때 CG 뉴런의 수가 감소하지 않는다.

병아리 섬모 신경절의 해부에서 얻은 신경 인구는 자율 신경계에 속하는 콜린성 뉴런의 균일 한 인구입니다. CG의 코로이드 집단에서 신경 전달 물질의 발현이 표적 구동이며, 이는 공동배양(24)에사용되는 근육의 종류에 따라 방해받을 수 있다. 연구의 목적이 운동 신경 자체의 유전 적 정체성 또는 하위 유형과 관련이있는 경우, CG 뉴런은 가장 적합한 신경 모델이 아닐 수도 있습니다. 또한, 근육 섬유의 내부변성에서 운동 뉴런의 특이성은 CG 뉴런 공동배양을 사용할 때 달성되지 않을 수 있으며, 이 경우 근육 섬유는25를증식할 수 있다. 그러나, 이러한 신경 배양은 몇 가지 장점이 있으며, 계란을 유지하고 배양하기 위한 기본 장비만 필요하며, 합리적으로 저렴한 절차이며, 더 중요한 것은 CG 뉴런 신경 전달 메커니즘이 척추 운동 뉴런에서 발생하는 것과 매우 유사하기 때문에 신경 근육 시냅스1의연구를 위한 우수한 모델을 제공한다. 이전에 이러한 유형의 연구에 사용된 세포 모델은 척수12,,21,,22,,23에서감각 뉴런이었다. 그러나, 이들 공동배양은 뉴런의 이기종 집단으로 구성되었고, 모든 해급이 아니고, 따라서 뉴런의 작은 부분만이 근육세포1과기능적 접촉을 확립할 수 있었다. 이 작업에서 입증된 발달 분석(면역세포화학) 외에 다른 분석은 전기생리학 및 뉴런 생존과 같은 CG 배양에서 수행될 수 있다.

이 프로토콜에 기초하여 추가 과학적 질문을 해결할 수 있습니다., 예를 들어 특정 mRNAs와 단백질의 세포 극 산화 시 냅 스 형성 및 기능을 조절 하는 방법. 더욱이, 신경 근육 공동 배양은 쉽게 확립될 수 있고 상해의 사이트가 신경 근육 접합일 때 신경 근육 질병을 연구하기 위하여 더 이용될 수 있습니다. 신경 근육 질환은 기능 장애가 근육 자체, 말초 신경 또는 신경 근육접합부 (26)와연관될 수 있다는 점에서 자연에서 이질적입니다. 따라서, 이러한 공동 배양을 통해 궁극적으로 신경 근육 질환의 개발 및 진행의 기초 신경 근육 접합 변경을 연구 할 수있을 것입니다. 또 다른 흥미로운 가능성은 마우스 삼차 시스템에이 프로토콜을 적응하는 것입니다. 이 뉴런은 쉽게 접근 할 수 있으며, 그들의 발달 패턴은 잘 알려져있다 27. 마우스는 유전 적 조작에 순종하고 삼차 시스템은 잘 지형지도 형성의 관점에서 특성화되어 뉴런 개발을 연구하는 삼차 기반 프로토콜을 사용하여 새로운 가능성이 발생합니다.

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Disclosures

저자는 그들이 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 작업은 센트로 2020 지역 운영 프로그램을 통해 유럽 지역 개발 기금(ERDF)에 의해 조달되었으며, CENTRO-01-0145-FEDER-000008: BRAINHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-0145-FEDER-000003:pAGE CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, 그리고 경쟁 및 국제화 및 FCT를 통한 포르투갈 국가 기금 운영 프로그램 – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., 프로젝트 UIDB/04539/2020, 프로젝트 UIDB/04539/2020 UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, 개인 보조금 SFRH/BD/141092/20 118 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009(R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011(J.R.P.) 및 마리 퀴리 액션 - IRG, 7번째 프레임워크 프로그램

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

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References

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독실성 신경절 뉴런의 고립과 문화
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Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).More

Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

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