وقد سبق استخدام المحاكا الحيوية كأداة لدراسة التفاعلات بين طرفية. ومع ذلك، لا توجد مثل هذه الأداة للجذور. هنا ، نقوم بتطوير بروتوكول لتشكيل الأسطح الاصطناعية تحاكي البنية المجهرية لسطح الجذر لدراسة تفاعلات بيئة الجذر.
المحاكاة الحيوية هي استخدام الكيمياء وعلوم المواد لمحاكاة النظم البيولوجية، والهياكل البيولوجية على وجه التحديد، من أجل تحسين البشرية. في الآونة الأخيرة، تم استخدام الأسطح المحاكاة الحيوية التي تحاكي البنية المجهرية لسطح الأوراق، لدراسة آثار البنية المجهرية للأوراق على التفاعلات بين بيئة الأوراق. ومع ذلك، لا توجد مثل هذه الأداة للجذور. قمنا بتطوير أداة تسمح للمحاكاة الاصطناعية من بنية سطح الجذر في سطح اصطناعي. اعتمدنا على طريقة الطباعة الحجرية الناعمة ، والمعروفة عن النسخ المتماثل المجهري لسطح الورقة ، باستخدام عملية من خطوتين. الخطوة الأولى هي أكثر تحديا لأنها تنطوي على الأنسجة البيولوجية. هنا، استخدمنا البوليمر مختلفة واستراتيجية علاج، والاعتماد على قوية، جامدة، البولي يوريثين، الشفاء من الأشعة فوق البنفسجية لقالب الجذر. هذا سمح لنا لتحقيق صورة سلبية موثوق بها من المجهرية سطح الجذر بما في ذلك حساسة، وميزات صعبة مثل الشعر الجذري. ثم استخدمنا هذه الصورة السلبية كقالب لتحقيق تكرار البنية المجهرية لسطح الجذر باستخدام كل من البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) الراسخة وكذلك مشتق السليلوز ، السليلوز الإيثيل ، الذي يمثل تقليدًا أقرب للجذور والذي يمكن أيضًا أن يتحلل من أنزيمات cellulase التي تفرزها الكائنات الحية الدقيقة. يمكن استخدام هذه المنصة التي تم تشكيلها حديثًا لدراسة الآثار المجهرية للسطح في تفاعلات الكائنات الدقيقة الجذرية بطريقة مماثلة لما تم عرضه سابقًا في الأوراق. بالإضافة إلى ذلك، تمكننا النظام من تتبع مواقع الكائنات الحية الدقيقة، نسبة إلى ميزات السطح، وفي المستقبل نشاطها، في شكل إفراز الخلايا.
تكرار بنية سطح ورقة هو طريقة معروفة في مجال البحوث الحيوية1،2،3،4. تم تنفيذ النسخ المتماثلة الأولى من بنية سطح ورقة باستخدام طلاء الأظافر والمواد المطاطية المطبقة على سطح ورقة لتصور أفضل من المجهرية، وتحديدا stomata5،,6،,7،,8،,9،,10. ثم تم تحسين الأسلوب ، واستخدمت البوليمرات المتقدمة لتقليد بنية سطح الأوراق باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة ، خاصة في سياق المحاكا الحيوية للأسطح فائقة التحلل2،3،4،11،12. في السنوات الأخيرة، ثبت هذه الطريقة كأداة مفيدة في دراسة التفاعل بين سطح ورقة والكائنات الدقيقة المقيمين على السطح سواء كانت مسببة للأمراض13،14 أو مفيدة ، كجزء من phyllosphere ورقة طبيعية15. وقد ثبت تبسيط النظام الطبيعي مفيدة للغاية في دراسة التفاعلات سطح الكائنات الحية الدقيقة حتى عندما استخدمت نظم اصطناعية بحتة كما السطوح15،16،17،18.
في حين أن تكرار بنية سطح ورقة ثبت أن يكون أداة مفيدة لدراسة التفاعل الذي يحدث على سطح ورقة مع الكائنات الدقيقة المختلفة ، لا توجد مثل هذه الأداة للجذور النباتية. جذور النبات يصعب دراسته لأنها تقع تحت الأرض وجميع التفاعلات تحدث داخل التربة. على غرار الأوراق ، من المرجح أن تلعب البنية المجهرية لسطح الجذر دورًا في تفاعلات الكائنات الدقيقة الجذرية. ومع ذلك، لا توجد حاليا أي طريقة لعزل دور محدد من المجهرية سطح الجذر في التفاعلات الجذر والكائنات الدقيقة المعقدة. الأكثر دراسة الجذر السطح microstructural الميزة هي الشعر الجذري19،20،21. الشعر الجذري له دور مهم في زيادة مساحة السطح وذلك السماح كمية أكثر كفاءة من المواد الغذائية والمياه22، ولكن مشاركتها كميزة هيكلية في التفاعلات الجذور والكائنات الدقيقة لم يتم اختبارها.
البوليمر الأكثر استخداما ل lithography لينة في الأوراق هو polydimethyl siloxane (PDMS). خصائص PDMS تشبه تلك التي من بشرة ورقة15،23. ومع ذلك ، في جذور النبات ، والمواد الأكثر وفرة هوالسليلوز 24،25 التي لها خصائص مختلفة من تلك PDMS26،27،28. وبالتالي فإن استخدام نظام إدارة المباني لبناء منصة اصطناعية لدراسة آثار البنية المجهرية السطحية في تفاعلات البيئة الجذرية هو أقل من مثالي.
البروتوكول المقدم هنا يتيح تشكيل النسخة المتماثلة المجهرية التركيبية لسطح الجذر الاصطناعية من مواد مختلفة. مثل طريقة النسخ المتماثل المجهرية سطح ورقة هذا هو عملية من خطوتين. الخطوة الأولى يستخدم النسيج البيولوجي (الجذر) كمصدر للصب في قالب البولي يوريثين (نسخة طبق الأصل السلبية). يمكن بعد ذلك استخدام قالب البولي يوريثين، الذي يمثل الصورة السلبية للهندسة المجهرية لسطح الجذر، كقاعدة لتوليد النسخ المتماثل الإيجابي للمجهر السطحي الجذري من مجموعة متنوعة من المواد، بما في ذلك PDMS ومشتقات السليلوز. ويمكن فيما بعد استخدام هذا النسخ المتماثل السطح الجذر كمنصة لفهم دور هيكل السطح في تفاعلات الكائنات الحية الدقيقة الجذرية.
نقدم طريقة جديدة لتكرار بنية سطح الجذر. يعتمد هذا الأسلوب على الأساليب الموجودة في النسخ المتماثل المجهري لسطح ورقة4. من أجل تطوير هذه الطريقة، كان علينا أن قرص الأسلوب الحالي للأوراق. أدركنا أن الخطوة الإشكالية في نسخ طريقة النسخ المتماثل لأوراق الشجر في الجذور تتضمن الخطوة الأولى من صب الجذر. هذا هو الجزء الأكثر حساسية من الطريقة لأنها تنطوي على الأنسجة البيولوجية. ونتيجة لذلك، أردنا اختيار البوليمر الذي من شأنه أن يتطلب ظروفا لطيف نسبيا لعلاج وبالتالي التسبب في الحد الأدنى من الضرر للأنسجة البيولوجية. اخترنا البولي يوريثين لأنه يمكن أن تكون بالمبلمرة بسرعة (في غضون 10 دقيقة) تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية29. بالإضافة إلى ذلك، فمن الصعب جدا مرة واحدةبلمرة 30 وكنا نأمل أن هذه الخاصية من شأنه أن يسمح لإزالة سهلة نسبيا من الجذر من قالب البولي يوريثين.
الأسلوب المعروض هو أسلوب من خطوتين الذي يتم تشكيل الصورة السالبة (النسخة المتماثلة السلبية) في الخطوة الأولى ويتم تشكيل النسخ المتماثل في الخطوة الثانية استناداً إلى النسخة المتماثلة السالبة. هذا يوسع نطاق المواد التي يمكننا العمل معها. تم إجراء النسخ المتماثل البنية المجهرية لسطح الورقة بشكل رئيسي على PDMS أو مواد الايبوكسي11،31. تم القيام ببعض الأعمال مع مواد أخرى، وعلى وجه التحديد المواد التي تدعم نمو الكائنات الحية الدقيقة13،32. وذلك لأن في السنوات الأخيرة تم استخدام هذه الطريقة لدراسة التفاعلات الكائنات الحية الدقيقة السطحية في سياق بنية سطح ورقة. ومع ذلك، لم يتم استخدام أي مواد تشبه السليلوز في هذه الطريقة في سياق الأوراق. نقترح استخدام نسخة طبق الأصل السلبية البولي يوريثين كقالب ومجموعة متنوعة من المواد للنسخة المتماثلة إيجابية. وبعبارة أخرى، جعل النسخة المتماثلة إيجابية، من مجموعة متنوعة من المواد، من السهل نسبيا مرة واحدة يتم إجراء نسخة طبق الأصل سلبية جيدة. نحن نستخدم حاليا مشتقات السليلوز، ولكن يتم استكشاف إمكانيات استخدام مواد أكثر صلة لتجذر السطح مثل البكتين وlignin33،34 في تركيبة مع مشتقات السليلوز.
كما تتوسع الطريقة على الطريقة الحالية للنسخ المتماثل للسطح ورقة المجهرية منذ ورقة هو سطح 2D بينما هو سطح الجذر منحنية وبالتالي هو سطح 3D. أسلوبنا لا تمكن من تكرار السطح كله منذ تضمين الجذر كله في حل البولي يوريثين لا يسمح لاطلاقه. لذلك، يجب اختيار جانب واحد من الجذر عند تكرار البنية المجهرية لسطح الجذر. السطح الاصطناعية المولدة منحنية وتمثل ما يقرب من نصف السطح، ولكن ليس كل ذلك. لدينا افتراض هو أن السمات الهيكلية لسطح الجذر هي في معظمها متناظرة حول المحور على طول الجذر. ومع ذلك، في الدراسات التي لا يفترض مثل هذا التماثل، ينبغي للمرء أن يكون حذراً لاختيار الجذر الجانبي المناسب لتكرار.
نقدم خيارين للجذور لاستخدامها كقوالب. الأول هو خيار الجذور المُغرّحة التي تنمو من الجذع والثاني هو خيار الجذور المُنبتَة على الورق. الخيار الأول هو في الغالب لمساعدة الباحثين في ممارسة الأسلوب لأن هذه الجذور هي أكثر قوة وأسهل للعمل مع. أما الخيار الثاني فيمثل الاختلافات الجينية التي يمكن أن توجد بين جذور أصناف مختلفة، بغض النظر عن الظروف البيئية. ويمكن استخدام هذه السطوح كأدوات البحث الهامة، ومع ذلك، ينبغي للمرء أن يدرك أن البيئة يمكن أن يكون لها تأثير قوي على بنية سطح الجذر، وتحديدا التربة التي تزرع جذور35،36. بسبب الإجهاد الميكانيكي الذي تسببه التربة ، لا بد أن تحدث بعض التغيرات المورفولوجية ، بالإضافة إلى الجروح المتراكمة على السطح حيث يخترق الجذر التربة37. إزالة الجذور من التربة، فضلا عن تنظيفها، دون الإضرار هيكلها مهمة صعبة للغاية. وبالتالي، نحن لسنا متفائلين فيما يتعلق بالقدرة على استخدام هذه الطريقة لمحاكاة موثوق المجهرية سطح الجذر من الجذور التي تزرع في التربة. ومع ذلك، بالنسبة للبحوث التي تركز على الاختلافات الجينية أو الاختلافات البيئية حيث يكون التغير في البنية المجهرية واضحا بشكل ملحوظ، يمكن استخدام هذه الطريقة كأداة لدراسة تأثير البنية المجهرية لسطح الجذر.
لدينا طريقة تنتج سطح خامل محاكاة فقط خصائص microstructural سطح الجذر. وفي حين أن هذه الطريقة مصممة لفصل الآثار الهيكلية في تفاعلات البيئة الجذرية عن جميع الآثار الأخرى، لا يمكننا تجاهل المركبات الكيميائية في تلك التفاعلات. قد لا تبقى بعض الكائنات الحية الدقيقة أو تعمل على السطح دون إضافة المركبات، وعلى وجه التحديد المواد المغذية. وستكون الخطوة التالية في تطوير هذه المنصة هي إضافة المركبات الكيميائية الخاضعة للرقابة لدراسة آثارها على التفاعلات المختلفة عند دمجها مع البنية.
وقد تم تطوير هذه الطريقة كخطوة أولى في تطوير منصة اصطناعية لدراسة التفاعلات الجذور والكائنات الحية الدقيقة. هنا نحن تقليد البنية المجهرية لسطح الجذر ويمكن استخدام هذه المنصة الأولية لدراسة تأثير microstructure السطح على سلوك الكائنات الحية الدقيقة. ومع ذلك ، فإن هذا البرنامج محدود لأنه يفتقر إلى العديد من العناصر الأخرى من النظام الطبيعي. وينبغي مواصلة تطوير هذا المنبر باستخدام المواد المناسبة لتوليد السطح وإضافة مواد كيميائية أخرى حاسمة إلى النظام. في منصة أكثر تقدما، يمكننا أيضا أن نتصور التوزيع المكاني للمواد الكيميائية. ومع ذلك ، بما أنه لا توجد حاليًا طريقة أخرى لعزل الآثار الهيكلية في تفاعلات الكائنات الدقيقة الجذرية ، نأمل أن يتمكن الباحثون من استخدام هذه المنصة الأولية لطرح أسئلة خاصة بالبنك في تلك التفاعلات.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم البحوث من خلال الأموال الأوليّة من منظمة البحوث الزراعية إلى شركة MK.
2-hydroxy-2-methylpropiophenone | Sigma | 405655 | |
Diethyl phthalate | Across | 114520010 | |
Diurethane dimetharylate | Sigma | 436909 | |
Ethyl cellulose | Across | 232705000 | |
Ethyl methacrylate | Sigma | 234893 | |
Shaphir Solution | GAT fertilizer | 6-2-4 | |
Sylgard 184 kit | Polymer-G | 510018400500 |