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Bioengineering

सॉफ्ट लिथोग्राफी के परिवर्तन का उपयोग करके रूट सरफेस माइक्रोस्ट्रक्चर की बायोमिमेटिक प्रतिकृति

doi: 10.3791/61437 Published: August 5, 2020

Summary

बायोमिमेटिक्स का उपयोग पहले पत्ती-सूक्ष्मजीव बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया गया है। हालांकि, जड़ों के लिए ऐसा कोई उपकरण मौजूद नहीं है। यहां, हम जड़-पर्यावरण बातचीत के अध्ययन के लिए जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर की नकल करते हुए सिंथेटिक सतहों को बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करते हैं।

Abstract

बायोमिमेटिक्स बेहतर मानव जाति के लिए जैविक प्रणालियों, विशेष रूप से जैविक संरचनाओं की नकल करने के लिए रसायन विज्ञान और भौतिक विज्ञान का उपयोग है। हाल ही में, पत्ती की सतह के माइक्रोस्ट्रक्चर की नकल करने वाली बायोमिमेटिक सतहों का उपयोग पत्ती-पर्यावरण बातचीत पर पत्ती माइक्रोस्ट्रक्चर के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जाता था। हालांकि, जड़ों के लिए ऐसा कोई उपकरण मौजूद नहीं है। हमने एक उपकरण विकसित किया है जो जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर की सिंथेटिक नकल को कृत्रिम सतह में अनुमति देता है। हम नरम लिथोग्राफी विधि पर भरोसा करते थे, जो दो-चरण की प्रक्रिया का उपयोग करके पत्ती की सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रतिकृति के लिए जाना जाता है। पहला कदम अधिक चुनौतीपूर्ण है क्योंकि इसमें जैविक ऊतक शामिल हैं। यहां, हमने रूट मोल्डिंग के लिए यूवी द्वारा ठीक किए गए मजबूत, कठोर, पॉलीयूरेथेन पर निर्भर करते हुए एक अलग बहुलक और इलाज रणनीति का उपयोग किया। इससे हमें जड़ के बाल जैसी नाजुक, चुनौतीपूर्ण विशेषताओं सहित जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर की विश्वसनीय नकारात्मक छवि प्राप्त करने की अनुमति मिली। इसके बाद हमने इस नकारात्मक छवि को एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया ताकि अच्छी तरह से स्थापित पॉलीडिमिथाइल साइलोक्सेन (पीडीएमएस) के साथ-साथ सेल्यूलोज डेरिवेटिव, एथिल सेल्यूलोज दोनों का उपयोग करके जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रतिकृति प्राप्त की जा सके, जो जड़ की करीब नकल का प्रतिनिधित्व करता है और जिसे सूक्ष्मजीवों द्वारा गुप्त किए गए सेल्यूलास एंजाइमों द्वारा भी अपमानित किया जा सकता है। इस नवगठित मंच का उपयोग जड़-सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन में सतह के सूक्ष्मसंरचना प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो पहले पत्तियों में दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, सिस्टम हमें सूक्ष्मजीव के स्थानों को ट्रैक करने में सक्षम बनाता है, सतह सुविधाओं के सापेक्ष, और भविष्य में इसकी गतिविधि, सेल्यूलस स्राव के रूप में।

Introduction

पत्ती की सतह की प्रतिकृति माइक्रोस्ट्रक्चर बायोमिमेटिक्स अनुसंधान क्षेत्र में एक ज्ञात विधि है1,2,3,,4. पत्तियों की सतह की शुरुआती प्रतिकृतिएं माइक्रोस्ट्रक्चर के बेहतर दृश्य के लिए पत्ती की सतह पर लागू नेल पॉलिश और रबर सामग्री का उपयोग करके की गई थीं, विशेष रूप से स्टोमाता5,,6, 7,,7,8,,9,,10। तब विधि में सुधार किया गया था, और उन्नत पॉलिमर का उपयोग नरम लिथोग्राफी का उपयोग करके पत्ती की सतह माइक्रोस्ट्रक्चर की नकल करने के लिए किया गया था, विशेष रूप से सुपर हाइड्रोफोबिक सतहों के बायोमिमेटिक्स के संदर्भ में2,,3,,4,11,,12।, हाल के वर्षों में, यह विधि सतह पर रहने वाले पत्ती की सतह और सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत के अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण के रूप में सिद्ध हुई थी चाहे वे रोगजनक13,,14 या लाभकारी हों, प्राकृतिक पत्ती फिलोस्फीयर15के हिस्से के रूप में। सतह - सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन के अध्ययन में प्राकृतिक प्रणाली का सरलीकरण अत्यंत उपयोगी साबित हुआ , जब विशुद्ध रूप से सिंथेटिक प्रणालियों का उपयोग सतहों15 , 16,,17,,18के रूप में कियागयाथा ।

जबकि पत्ती की सतह माइक्रोस्ट्रक्चर की प्रतिकृति को विभिन्न सूक्ष्मजीवों के साथ पत्ती की सतह पर होने वाली बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण दिखाया गया था, पौधों की जड़ों के लिए ऐसा कोई उपकरण मौजूद नहीं है। पौधों की जड़ों का अध्ययन करना कठिन होता है क्योंकि वे जमीन के नीचे रहते हैं और सभी बातचीत मिट्टी के भीतर होती हैं। पत्तियों के समान, रूट-सतह माइक्रोस्ट्रक्चर रूट-सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन में भूमिका निभाने की संभावना है। हालांकि, वर्तमान में जटिल रूट-माइक्रोऑर्गेल इंटरैक्शन में रूट सतह माइक्रोस्ट्रक्चर की विशिष्ट भूमिका को अलग करने के लिए कोई विधि मौजूद नहीं है। सबसे अधिक अध्ययन की जाने वाली जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चरल विशेषता रूट हेयर19,20,21है ।21 सतह क्षेत्र को बढ़ाने में रूट बाल की महत्वपूर्ण भूमिका होती है और इसके द्वारा पोषक तत्वों और पानी22के अधिक कुशल सेवन की अनुमति दी जाती है, हालांकि रूट-सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन में एक संरचनात्मक विशेषता के रूप में उनकी भागीदारी का कभी परीक्षण नहीं किया गया है।

पत्तियों में नरम लिथोग्राफी के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला बहुलक पॉलीडिमेथाइल सिलोक्सेन (पीडीएमएस) है। पीडीएमएस गुण पत्ती क्यूटिकल15,23के समान हैं . हालांकि, पौधों की जड़ों में, सबसे प्रचुर मात्रा में सामग्री सेल्यूलोज24,,25 है जिसमें पीडीएमएस26, 27,,,28की तुलना में अलग-अलग गुण हैं।27 जड़ पर्यावरण बातचीत में सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सिंथेटिक मंच बनाने के लिए पीडीएमएस का उपयोग करना, इसलिए आदर्श से कम है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विभिन्न सामग्रियों से सिंथेटिक रूट सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रतिकृति के गठन में सक्षम बनाता है। पत्ती की सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रतिकृति के लिए विधि की तरह यह एक दो कदम की प्रक्रिया है। पहला कदम एक पॉलीयूरेथेन मोल्ड (एक नकारात्मक प्रतिकृति) में मोल्डिंग के लिए एक स्रोत के रूप में जैविक ऊतक (जड़) का उपयोग करता है। पॉलीयूरेथेन मोल्ड, जो रूट सतह माइक्रोस्ट्रक्चर की नकारात्मक छवि का प्रतिनिधित्व करता है, फिर पीडीएमएस और सेल्यूलोज डेरिवेटिव सहित विभिन्न सामग्रियों से जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर की सकारात्मक प्रतिकृति उत्पन्न करने के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस जड़ सतह प्रतिकृति को बाद में जड़-सूक्ष्मजीव बातचीत में सतह संरचना की भूमिका को समझने के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

1. पौधों और जड़ तैयार करने बढ़ रही है

  1. विकल्प 1: स्टेम से साहसी जड़ें तैयार करें।
    1. पौधों को उगाने के लिए एक पक्ष ट्रे लें।
    2. ट्रे को मिट्टी से भरें।
    3. ट्रे में प्रत्येक सेल में M82 टमाटर की खेती का एक बीज जोड़ें।
    4. बीजों को थोड़ी मिट्टी से ढक दें।
    5. नीचे से ट्रे को ड्रॉपर के साथ पानी दें क्योंकि पानी ट्रे के नीचे भरता है और मिट्टी पानी को सोख लेती है ।
    6. सप्ताह में एक बार ट्रे के नीचे प्रति 1 एल उर्वरक का 2 एमएल जोड़ें।
    7. 25 डिग्री सेल्सियस पर एक बढ़ते कक्ष में बढ़ें।
    8. 9 घंटे प्रकाश (7:00-16:00) की प्रकाश स्थिति का उपयोग करें जो 15 घंटे के अंधेरे के साथ वैकल्पिक है।
    9. 3 सप्ताह के बाद पौधे को मिट्टी से हटा दें।
    10. तने के साथ बातचीत के बिंदु पर पौधे से रूट सिस्टम को काटें।
    11. जड़हीन पौधे को पानी से भरे बीकर में डाल दें।
    12. कुछ दिनों के बाद, तने से निकलने वाली साहसी जड़ों को काट लें और उन्हें प्रतिकृति के लिए उपयोग करें।
  2. विकल्प 2: बीज अंकुरित जड़ों को तैयार करें।
    1. पानी के साथ एक पेट्री डिश आकार फिल्टर पेपर गीला।
    2. एक पेट्री डिश के अंदर, कागज पर कई M82 बीज (10 से अधिक नहीं) रखो।
    3. थाली को 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. हर दिन पेपर को हाइड्रेट करें।
    5. अंकुरित जड़ों के बाद काफी लंबी होती है (लगभग 5 दिन), बीजों को हटा दें और प्रतिकृति के लिए जड़ों का उपयोग करें।

2. पॉलीयूरेथेन से रूट नकारात्मक प्रतिकृति की तैयारी

  1. नकारात्मक प्रतिकृति समाधान उत्पन्न करने के लिए, 20 एमएल शीशी में 9.49 ग्राम मूत्रथेन डाइमेथाक्रिलेट जोड़ें।
    1. शीशी में एथिल मेथाक्रिलेट का 1.45 एमएल जोड़ें।
    2. कमरे के तापमान (आर टी) पर हिलाओ जब तक समाधान स्पष्ट लग रहा है और सजातीय हो जाता है ।
      नोट: लगभग 2 घंटे एक सजातीय समाधान तक पहुंचने के लिए पर्याप्त है।
    3. प्लास्टिलाइजर, डायथाइल थैलेट के 3 एमएल जोड़ें, और आरटी में 1 घंटे के लिए हलचल करें।
      नोट: डाईथाइल थैलेट एक्रिलेट मोनोमर में गलत है।
    4. फोटो सर्जक, 2-हाइड्रोक्सी-2-मिथाइलप्रोपिओफेनोन के 300 माइक्रोन जोड़ें, और आरटी में रात भर हिलाएं। जब तक सभी बुलबुले हटा न जाएं तब तक सरगर्मी जारी रखें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । समाधान आरटी में रखा जा सकता है।
  2. जड़ की नकारात्मक प्रतिकृति उत्पन्न करने के लिए, एक साफ ग्लास स्लाइड लें और उस पर नकारात्मक प्रतिकृति समाधान का 1 एमएल डालें।
    1. समाधान पर 2\u20123 जड़ें रखें। जड़ों को पूरी तरह से समाधान से ढककर न जाने दें।
    2. 8 \u201210 मिनट के लिए 8 डब्ल्यू अल्ट्रा वायलेट (यूवी) लैंप के तहत स्लाइड रखें । समाधान को यूवी लाइट के नीचे ज्यादा देर तक न रखें।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि समाधान को यूवी लाइट के नीचे बहुत लंबे समय तक न रखें क्योंकि यह पॉलीयूरेथेन को बहुत कठिन बनाता है, जिससे जड़ को हटाना असंभव हो जाता है।
    3. यूवी लैंप को स्विच ऑफ करें, ग्लास स्लाइड से प्रतिकृति को हटा दें और इसे इथेनॉल से भरे पेट्री डिश में डाल दें, ताकि अप्रतिक्रियाई मोनोमर को हटाया जा सके।
    4. नकारात्मक प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए, संदंश का उपयोग करके प्रतिकृति से जड़ को बहुत धीरे-धीरे हटा दें।

3. पीडीएमएस से रूट पॉजिटिव प्रतिकृति तैयार करें।

  1. सकारात्मक प्रतिकृति के लिए मिश्रण उत्पन्न करने के लिए, एक पेपर कप में 10 ग्राम डाइमेथिल साइलोकेन रखें।
    1. 1 ग्राम इलाज एजेंट जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 2 घंटे के लिए वैक्यूम के तहत एक डेसीकेटर में मिश्रण रखें।
  2. सकारात्मक प्रतिकृति उत्पन्न करने के लिए, पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति को पेट्री डिश में रखें।
    1. नकारात्मक प्रतिकृति के शीर्ष पर पीडीएमएस मिश्रण डालो।
    2. माइक्रोस्ट्रक्चर के कवरेज को आश्वस्त करने के लिए 2 घंटे के लिए वैक्यूम लागू करें।
    3. आरटी में पेट्री डिश को रात भर रखें।
    4. ठीक सकारात्मक प्रतिकृति को हाथ से नकारात्मक प्रतिकृति से अलग करें।

4. एथिल सेल्यूलोज से रूट सकारात्मक प्रतिकृति तैयार करें।

  1. एथिल सेल्यूलोज समाधान उत्पन्न करने के लिए, 100 मिलीलीटर कप में प्लास्टिलाइजर के रूप में 1.32 मिलीलीटर डिथाइल प्लालेट डालें।
    1. इथेनॉल के 20 एमएल जोड़ें और 2 घंटे के लिए आरटी पर हलचल।
    2. एथिल सेल्यूलोज के 3.3 ग्राम जोड़ें और रात भर हिलाएं।
  2. सकारात्मक प्रतिकृति उत्पन्न करने के लिए, पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति को पेट्री डिश में रखें।
    1. नकारात्मक प्रतिकृति के शीर्ष पर एथिल सेल्यूलोज समाधान डालो।
    2. पेट्री डिश को रात भर आरटी में हुड के नीचे रखें।
    3. बहुत धीरे-धीरे संदंश द्वारा नकारात्मक प्रतिकृति से सकारात्मक प्रतिकृति निकालें।

Representative Results

रूट सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रतिकृति बनाने के लिए, मोल्डिंग के लिए एक जड़ को चुना जाना चाहिए। हम मिट्टी में टमाटर के पौधे उगाते हैं, जिससे रूट सिस्टम से प्राकृतिक जड़ का उपयोग बेहद चुनौतीपूर्ण हो जाता है। जड़ प्रणाली से मिट्टी को हटाने मुश्किल हो सकता है और इसके अतिरिक्त, जड़ प्रणाली जड़ों नाजुक है और मोल्डिंग प्रयास पर तोड़ सकते हैं । इसलिए हम पहले और अधिक कठोर जड़ों का उपयोग करने के लिए, प्रयोगशाला में प्रोटोकॉल स्थापित करने का सुझाव देते हैं । ऐसी जड़ों के गठन का वर्णन चित्र 1एमें किया गया है . पौधे को 3 सप्ताह तक उगाए जाने के बाद पौधे की जड़ प्रणाली को हटा दिया जाता है और रूटलेस पौधे को लगभग एक सप्ताह तक पानी में रखा जाता है जब तक कि साहसिक जड़ें तने से निकलती हैं। उन जड़ों प्रोटोकॉल स्थापना के दौरान प्रतिकृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक बार प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित हो जाने के बाद, अधिक यथार्थवादी जड़ सतह संरचना वांछित है। यहां हम बेहद चुनौतीपूर्ण में मिट्टी के पूर्ण हटाने के रूप में मिट्टी में उगाई जड़ों से बचने का सुझाव देते हैं । इसके बजाय हम जड़ों को अंकुरित करने के उपयोग का सुझाव देते हैं, आनुवंशिक रूप से विशिष्ट पौधे की जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर पर मूल्यवान जानकारी की आपूर्ति करते हैं। ऐसी जड़ों की वृद्धि का वर्णन चित्रा 1बीमें किया गया है . बीजों को गीले फिल्टर पेपर पर रखा जाता है और 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया जाता है। लगभग 5 दिनों के बाद, जिसके दौरान फिल्टर पेपर को नम रखा जाता है, अंकुरित जड़ें प्रतिकृति के लिए काफी लंबी होती हैं। उन जड़ों पहले से सुझाव दिया जड़ों की तुलना में अधिक नाजुक है और अधिक नाजुक देखभाल की आवश्यकता है ।

जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रतिकृति का उत्पादन एक दो कदम की प्रक्रिया है। पहले चरण में प्राकृतिक जड़ को पॉलीयूरेथेन आधारित मोल्ड (नकारात्मक प्रतिकृति) में ढाला जा रहा है। इस चरण का लाभ यह है कि पॉलीयूरेथेन मोल्ड के लिए सभी सामग्री तैयार की जा रही है और रूट को यूवी के 10 मिनट के जोखिम के लिए बहुत अंत में तैयार समाधान के शीर्ष पर रखा गया है। नतीजतन, जैविक ऊतक बहुत लंबे समय तक कठोर परिस्थितियों के संपर्क में नहीं है और प्रक्रिया के अंत में धीरे-धीरे संभाला जा सकता है। यदि सभी प्रोटोकॉल चरणों का पालन किया जाता है, तो एक अच्छी नकारात्मक प्रतिकृति उत्पन्न होती है। यह प्रतिकृति जड़ की सतह की कोशिका संरचना के साथ-साथ रूट बाल(चित्रा 2 ए)के स्थान का प्रतिनिधित्व करने वाले छेद दिखाएगी। यदि प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदमों का पालन नहीं किया जा रहा है, तो प्रक्रिया विफल हो जाएगी । ऐसा ही एक कदम इलाज से पहले पॉलीयूरेथेन समाधान पर जड़ का प्लेसमेंट है। पॉलीयूरेथेन समाधान में इसके डूबने से बचने के लिए जड़ को बहुत धीरे से रखा जाना चाहिए। इस तरह के डूब, जड़ के किसी भी हिस्से के, इसे हटाने की क्षमता के साथ कठिन बहुलक में जड़ के फंसाने का कारण होगा । यदि ऐसी घटना होती है, तो जड़ ठीक होने के बाद नकारात्मक प्रतिकृति के भीतर रहेगी(चित्रा 2B)। एक और महत्वपूर्ण कदम यूवी प्रकाश द्वारा इलाज के समय के बारे में है । अनुशंसित इलाज का समय 8\u201210 मिनट है। पिछले 10 मिनट जाने से एक बेहद कठिन पॉलीयूरेथेन मोल्ड होगा, जिससे पॉलीयूरेथेन मोल्ड के भीतर इसे तोड़े बिना जड़ को हटाना असंभव हो जाएगा। जड़ का टूटना कभी-कभी नग्न आंखों को दिखाई दे सकता है, उदाहरण के लिए, जब एक बड़ा टुकड़ा टूट जाता है(चित्रा 2C,शीर्ष, बैंगनी तीर के साथ चिह्नित)। हालांकि, कभी-कभी सामग्री में छोटे रूट टुकड़े छोड़े जाते हैं जिन्हें नग्न आंखों से हाजिर करना मुश्किल होता है और एक माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाना चाहिए(चित्र 2 सी, नीचे, बैंगनीतीर के साथ चिह्नित)। हम यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई अवशिष्ट जड़ मौजूद नहीं है, प्रोटोकॉल को जारी रखने से पहले माइक्रोस्कोप के साथ पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति की सावधानीपूर्वक जांच करने की सलाह देते हैं।

एक बार पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति तैयार हो जाने के बाद; सकारात्मक प्रतिकृति की तैयारी के लिए कई सामग्रियों का उपयोग किया जा सकता है। सकारात्मक प्रतिकृति की तैयारी, मोल्ड के रूप में पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति का उपयोग करके, सीधे आगे है और पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति की गुणवत्ता पर पूरी तरह से निर्भर करता है। सकारात्मक प्रतिकृति उत्पन्न करने के लिए हमने पीडीएमएस दोनों का उपयोग किया है - क्योंकि यह नरम लिथोग्राफी(चित्रा 3 ए)- और एथिल सेल्यूलोज के क्षेत्र में एक ऐसी सामग्री के रूप में जाना जाता है जो जड़ सतह के गुणों की बेहतर नकल करता है जो ज्यादातर सेल्यूलोज(चित्रा 3 बी)से बना होता है। पीडीएमएस प्रतिकृति की एसईएम छवि जड़ बाल बहुत स्पष्ट रूप से दिखाती है। बाल विस्तार क्षेत्र में होते हैं, जहां वे उभरने लगते हैं। इसलिए, जड़ बालों की लंबाई जड़ सतह के साथ भिन्न होती है क्योंकि वे लंबे समय तक हो जाते हैं, प्राकृतिक जड़(चित्रा 3A)की तरह। एथिल सेल्यूलोज पीडीएमएस की तुलना में कठिन और कम लचीली फिल्म उत्पन्न करता है। इसलिए, नकारात्मक मोल्ड से इसे हटाने के लिए अधिक देखभाल की आवश्यकता होती है। हालांकि, कुछ बाल और सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रकाश माइक्रोस्कोप(चित्रा 3B)के तहत दिखाई दे रहे हैं । हमने सकारात्मक प्रतिकृति उत्पन्न करने के लिए उन दो सामग्रियों का उपयोग किया, हालांकि, कोई भी सामग्री जो एक फिल्म बना सकती है, पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति का उपयोग करके सकारात्मक प्रतिकृति के लिए एक अच्छा उम्मीदवार होगी।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिकृति के लिए टमाटर के पौधे की जड़ें। (A)एक टमाटर (M82) पौधे को 9 घंटे की रोशनी और 15 घंटे के अंधेरे के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है । 3 सप्ताह के बाद, पौधे को मिट्टी से हटा दिया जाता है और रूट सिस्टम को काट दिया जाता है। रूटलेस पौधे को पानी में तब तक डाला जाता है जब तक कि लगभग एक सप्ताह के बाद अवाप्ति की जड़ें तने से निकलती हैं। ये जड़ें जड़ प्रणाली से जड़ों के रूप में सटीक संरचना नहीं दिखाती हैं, लेकिन वे एक अच्छे मॉडल का प्रतिनिधित्व करती हैं। उन जड़ों जड़ प्रणाली जड़ों की तुलना में कम नाजुक है और इसलिए जब प्रयोगशाला में तकनीक की स्थापना के साथ काम करने के लिए पसंद कर रहे हैं । (ख)टमाटर (एम82) बीज को एक पेट्री डिश में गीले फिल्टर पेपर पर डाल दिया जाता है और 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया जाता है । कागज हर दिन हाइड्रेटेड होता है और बीज अंकुरित होते हैं। जड़ें बढ़ रही हैं और लगभग 5 दिनों के बाद प्रतिकृति के लिए उपयोग किए जाने के लिए पर्याप्त हैं। ये जड़ें जेंटलर हैं और विधि अच्छी तरह से स्थापित होने के बाद इसका उपयोग किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति की माइक्रोस्कोपी छवियां। (A)सभी चरणों के बाद एक प्रोटोकॉल के अनुसार बनाई गई पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति की एसईएम छवि। सेल संरचना स्पष्ट रूप से दिखाई देती है। पीले तीर जड़ में बाल द्वारा गठित छेद पर इंगित करते हैं। (ख)पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति की हल्की माइक्रोस्कोपी छवियां इसके अंदर एक जड़ के साथ क्योंकि यह पूरी तरह से समाधान के साथ कवर किया गया था और इसे हटाना असंभव था । पॉलीयूरेथेन निगेटिव अंदर जड़ से ठीक हो गया था। जड़ आंखों से दिखाई देती है और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करती है। इस जड़ को ठीक प्रतिकृति से हटाना असंभव है। (ग)पॉलीयूरेथेन निगेटिव प्रतिकृति की हल्की माइक्रोस्कोपी छवियां जिन्हें यूवी लाइट के नीचे बहुत लंबे समय तक रखा गया था । नतीजतन, जड़ को पॉलीमर से पूरी तरह से हटाया नहीं जा सकता है, जिसमें आंखों द्वारा दिखाई जाने वाले बड़े कण (शीर्ष छवि, बैंगनी तीर के साथ चिह्नित) या छोटे अंश केवल माइक्रोस्कोप (कम छवि, बैंगनी तीर के साथ चिह्नित) द्वारा दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सकारात्मक प्रतिकृति के माइक्रोस्कोप छवियां। (एक)पीडीएमएस से बनी सकारात्मक प्रतिकृति का एसईएम माइक्रोग्राफ। इज़ाफ़ा जड़ बाल से पता चलता है। (ख)एथिल सेल्यूलोज से बनी सकारात्मक प्रतिकृति की हल्की माइक्रोस्कोपी छवियां । दाईं ओर छवियों में बाल दिखाए जाते हैं जबकि बाईं ओर छवि में सतह बनावट दिखाई देती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हम जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर की प्रतिकृति के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि पत्ती की सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रतिकृति4के मौजूदा तरीकों पर निर्भर करती है । इस विधि को विकसित करने के लिए, हमें पत्तियों के लिए मौजूदा विधि को ट्विक करना पड़ा। हमने महसूस किया कि जड़ों में पत्ती प्रतिकृति विधि की नकल में समस्याग्रस्त कदम जड़ मोल्डिंग का पहला कदम शामिल है । यह विधि का सबसे संवेदनशील हिस्सा है क्योंकि इसमें जैविक ऊतक शामिल हैं। नतीजतन, हम एक बहुलक चुनना चाहते थे जो इलाज के लिए अपेक्षाकृत कोमल स्थितियों की मांग करेगा और इसलिए जैविक ऊतक को न्यूनतम क्षति पहुंचाता है। हमने पॉलीयूरेथेन को चुना क्योंकि इसे यूवी लाइट29के तहत जल्दी (10 मिनट के भीतर) पॉलीमराइज्ड किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एक बार30 को बहुलीकृत करना बहुत मुश्किल है और हमें आशा है कि यह संपत्ति पॉलीयूरेथेन मोल्ड से जड़ को अपेक्षाकृत आसान हटाने की अनुमति देगी।

प्रस्तुत विधि एक दो कदम दृष्टिकोण है जिसमें नकारात्मक छवि (नकारात्मक प्रतिकृति) पहले चरण में बनाई जाती है और प्रतिकृति नकारात्मक प्रतिकृति के आधार पर दूसरे चरण में बनाई जाती है। यह सामग्री हम साथ काम कर सकते है की सीमा का विस्तार । पत्ती की सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रतिकृति मुख्य रूप से पीडीएमएस या एपॉक्सी सामग्री पर की जाती थी11,31. कुछ काम अन्य सामग्रियों के साथ किया गया था, विशेष रूप से सूक्ष्मजीव विकास13,,32का समर्थन करने वाली सामग्री। इसका कारण यह है कि हाल के वर्षों में इस विधि का उपयोग पत्ती की सतह संरचना के संदर्भ में सूक्ष्मजीव-सतह बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया गया है। हालांकि, पत्तियों के संदर्भ में इस विधि में कोई सेल्यूलोज जैसी सामग्री का उपयोग नहीं किया गया है। हम एक मोल्ड के रूप में पॉलीयूरेथेन नकारात्मक प्रतिकृति का उपयोग और सकारात्मक प्रतिकृति के लिए विभिन्न प्रकार की सामग्रियों का सुझाव देते हैं। दूसरे शब्दों में, सकारात्मक प्रतिकृति बनाने, सामग्री की एक किस्म से, अपेक्षाकृत आसान है एक बार एक अच्छा नकारात्मक प्रतिकृति बना दिया है । वर्तमान में हम सेल्यूलोज डेरिवेटिव का उपयोग करते हैं, लेकिन सेल्यूलोज डेरिवेटिव के संयोजन में पेक्टिन और लिग्निन33, 34,34 जैसे सतह को जड़ में करने के लिए अधिक प्रासंगिक सामग्रियों का उपयोग करने की संभावनाओं की खोज कर रहे हैं।

यह विधि पत्ती की सतह माइक्रोस्ट्रक्चर प्रतिकृति की मौजूदा विधि पर भी फैलती है क्योंकि पत्ती एक 2D सतह है जबकि जड़ की सतह घुमावदार है और इसलिए एक 3 डी सतह है। हमारी विधि पूरी सतह की प्रतिकृति को सक्षम नहीं करती है क्योंकि पॉलीयूरेथेन समाधान में पूरी जड़ को एम्बेड करने से इसकी रिहाई की अनुमति नहीं मिलती है। इसलिए, जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर को दोहराते समय जड़ के एक तरफ चुना जाना चाहिए। उत्पन्न सिंथेटिक सतह घुमावदार है और लगभग आधी सतह का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन यह सब नहीं है। हमारी धारणा यह है कि जड़ सतह की संरचनात्मक विशेषताएं ज्यादातर जड़ लंबाई के साथ धुरी के बारे में सममित हैं। हालांकि, अध्ययनों में जहां ऐसी समरूपता नहीं ली जाती है, किसी को दोहराने के लिए उपयुक्त पक्ष जड़ का चयन करने के लिए सावधान रहना चाहिए।

हम जड़ों के लिए दो विकल्प प्रस्तुत करने के लिए मोल्ड के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा । पहला तने से उगाई जाने वाली साहसी जड़ों का विकल्प है और दूसरा कागज पर अंकुरित जड़ों का विकल्प है । पहला विकल्प ज्यादातर विधि का अभ्यास करने में शोधकर्ताओं की सहायता करने के लिए है क्योंकि ये जड़ें अधिक मजबूत और काम करने में आसान हैं। दूसरा विकल्प आनुवंशिक मतभेदों का प्रतिनिधित्व करता है जो पर्यावरणीय स्थितियों की परवाह किए बिना विभिन्न खेती की जड़ों के बीच पाया जा सकता है। इन सतहों को महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि, किसी को इस बात की जानकारी होनी चाहिए कि पर्यावरण की जड़ सतह संरचना पर एक मजबूत प्रभाव हो सकता है, विशेष रूप से मिट्टी जिसमें जड़ें35,,36हो जाती हैं। मिट्टी द्वारा दिए गए यांत्रिक तनाव के कारण, सतह पर अर्जित घावों के अलावा कुछ रूपात्मक परिवर्तन होने के लिए बाध्य हैं क्योंकि जड़ मिट्टी37में प्रवेश करती है। मिट्टी से जड़ों को हटाना, साथ ही उन्हें साफ करना, उनकी संरचना को नुकसान पहुंचाए बिना एक बहुत ही मुश्किल काम है। इसलिए, हम मिट्टी में उगाई जाने वाली जड़ों की जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर की मज़बूती से नकल करने के लिए इस विधि का उपयोग करने की क्षमता के रूप में आशावादी नहीं हैं। हालांकि, अनुसंधान के लिए जो आनुवंशिक मतभेदों या पर्यावरणीय मतभेदों पर केंद्रित है जहां माइक्रोस्ट्रक्चर में परिवर्तन काफ़ी स्पष्ट है, इस विधि का उपयोग जड़ सतह माइक्रोस्ट्रक्चर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकता है।

हमारी विधि जड़ सतह के केवल सूक्ष्मसंरचना गुणों की नकल करने वाली एक निष्क्रिय सतह पैदा करती है। हालांकि इस विधि को अन्य सभी प्रभावों से रूट-पर्यावरण इंटरैक्शन में संरचनात्मक प्रभावों को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, हम उन इंटरैक्शन में रासायनिक यौगिकों की अनदेखी नहीं कर सकते हैं। कुछ सूक्ष्मजीव यौगिकों, विशेष रूप से पोषक तत्वों के अलावा के बिना सतह पर जीवित या कार्य नहीं कर सकते हैं। इस मंच के विकास में अगला कदम संरचना के साथ संयुक्त होने पर विभिन्न बातचीत पर उनके प्रभावों का अध्ययन करने के लिए रासायनिक यौगिकों का नियंत्रित जोड़ होगा।

इस विधि को जड़-सूक्ष्मजीव बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक सिंथेटिक मंच के विकास में पहले कदम के रूप में विकसित किया गया था। यहां हम जड़ की सतह के माइक्रोस्ट्रक्चर की नकल करते हैं और इस प्रारंभिक मंच का उपयोग सूक्ष्मजीव व्यवहार पर सतह माइक्रोस्ट्रक्चर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यह मंच सीमित है क्योंकि इसमें प्राकृतिक प्रणाली से कई अन्य तत्वों का अभाव है। इस मंच को सतह उत्पन्न करने के लिए सही सामग्रियों के उपयोग के साथ और सिस्टम में अन्य, महत्वपूर्ण, रसायनों के अलावा विकसित किया जाना चाहिए। एक अधिक उन्नत मंच में, हम रसायनों के स्थानिक वितरण की कल्पना भी कर सकते हैं। हालांकि, चूंकि वर्तमान में रूट-सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन में संरचनात्मक प्रभावों को अलग करने के लिए कोई अन्य विधि मौजूद नहीं है, हमें उम्मीद है कि शोधकर्ता इस प्रारंभिक मंच का उपयोग उन बातचीत में संरचना-विशिष्ट प्रश्न पूछने के लिए कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कृषि अनुसंधान संगठन से एमके तक बीज निधि द्वारा अनुसंधान का समर्थन किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-hydroxy-2-methylpropiophenone Sigma 405655
Diethyl phthalate Across 114520010
Diurethane dimetharylate Sigma 436909
Ethyl cellulose Across 232705000
Ethyl methacrylate Sigma 234893
Shaphir Solution GAT fertilizer 6-2-4
Sylgard 184 kit Polymer-G 510018400500

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References

  1. Bhushan, B., Jung, Y. C., Niemietz, A., Koch, K. Lotus-Like Biomimetic Hierarchical Structures Developed by the Self-Assembly of Tubular Plant Waxes. Langmuir. 25, 1659-1666 (2009).
  2. Koch, K., Barthlott, W. Superhydrophobic and superhydrophilic plant surfaces: an inspiration for biomimetic materials. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 367, 1487-1509 (2009).
  3. Schulte, A. J., Koch, K., Spaeth, M., Barthlott, W. Biomimetic replicas: Transfer of complex architectures with different optical properties from plant surfaces onto technical materials. Acta Biomaterialia. 5, 1848-1854 (2009).
  4. Koch, K., Schulte, A., Fischer, A., Gorb, S., Barthlott, W. A fast, precise and low-cost replication technique for nano- and high-aspect-ratio structures of biological and artificial surfacese. Bioinspiration & Biomimetics. 3, 046002 (2008).
  5. Weyers, J. D. B., Johansen, L. G. Accurate Estimation of Stomatal Aperture From Silicone Rubber Impressions. New Phytology. 101, 109-115 (1985).
  6. Hilu, K. W., Randall, J. L. Convenient Method for Studying Grass Leaf Epidermis. Taxon. 33, 413-415 (1984).
  7. Sampson, J. A. Method of replicating Dry or Moist Surfaces for Examination by Light. Nature. 191, 932-933 (1961).
  8. Weyers, J. B. D., Travis, A. J. Selection and Preparation of Leaf Epidermis for Experiments on Stomatal Physiology. Journal of experimental botany. 32, 837-850 (1981).
  9. Groot, J. The Use of Silicone Rubber Plastic for Replicating Leaf Surfaces. Acta Botanica. Neerlandica. 18, 703-708 (1969).
  10. Wu, S., Zhao, B. Using Clear Nail Polish to Make Arabidopsis Epidermal Impressions for Measuring the Change of Stomatal Aperture Size in Immune Response. Plant Pattern Recognition Receptors. 243-248 (2017).
  11. Wu, W., Guijt, R., Silina, Y., Koch, M., Manz, A. Plant leaves as templates for soft lithography. RSC Advances. 6, 22469-22475 (2016).
  12. Barthlott, W., Mail, M., Bhushan, B., Koch, K. Plant Surfaces: Structures and Functions for Biomimetic Innovations. Nano-Micro Letters. 9, 23 (2017).
  13. Zhang, B., et al. Fabrication of biomimetically patterned surfaces and their application to probing plant-bacteria interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 6, 12467-12478 (2014).
  14. Szyndler, M. W., Haynes, K. F., Potter, M. F., Corn, R. M., Loudon, C. Entrapment of bed bugs by leaf trichomes inspires microfabrication of biomimetic surfaces. Journal of the Royal Society Interface. 10, 20130174 (2013).
  15. Doan, H. K., Leveau, J. H. J. Artificial Surfaces in Phyllosphere Microbiology. Phytopathology. 105, 1036-1042 (2015).
  16. Chung, K. K., et al. Impact of engineered surface microtopography on biofilm formation of Staphylococcus aureus. Biointerphases. 2, 89-94 (2007).
  17. Sirinutsomboon, B., Delwiche, M. J., Young, G. M. Attachment of Escherichia coli on plant surface structures built by microfabrication. Biosystems Engineering. 108, 244-252 (2011).
  18. Bhattacharjee, A., Khan, M., Kleiman, M., Hochbaum, A. I. Effects of Growth Surface Topography on Bacterial Signaling in Coculture Biofilms. ACS Applied Materials and Interfaces. 9, 18531-18539 (2017).
  19. Measuring roots: an updated approach. Mancuso, S. Springer Science & Business Media. (2011).
  20. Schneider, K., Wells, B., Dolan, L., Roberts, K. Structural and genetic analysis of epidermal cell differentiation in Arabidopsis primary roots. Development. 1798, 1789-1798 (1997).
  21. Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 2474, 2465-2474 (1994).
  22. Leitner, D., et al. A dynamic model of nutrient uptake by root hairs. New Phytology. 185, 792-802 (2010).
  23. Soffe, R., Bernach, M., Remus-emsermann, M. N. P., Nock, V. Replicating Arabidopsis Model Leaf Surfaces for Phyllosphere Microbiology. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  24. Sorieul, M., Dickson, A., Hill, S. J., Pearson, H. Plant fibre: Molecular structure and biomechanical properties, of a complex living material, influencing its deconstruction towards a biobased composite. Materials. 9, 618 (2016).
  25. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9, 2749-2766 (2012).
  26. Poletto, M., Pistor, V., Zattera, A. J. Structural characteristics and thermal properties of native cellulose. Cellulose-fundamental aspects. 45-68 (2013).
  27. Moon, R. J., Martini, A., Nairn, J. A., Simonsen, J., Youngblood, J. Cellulose Nanomaterials Review: Structure, Properties. Chemical Society Reviews. 40, 3941-3994 (2011).
  28. Johnston, I., McCluskey, D., Tan, C., Tracey, M. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24, 035017 (2014).
  29. Yan-yan, W., Ying-wu, L., Bao-fang, L., Bo-geng, L. Water-soluble UV curable urethane methyl acrylate coating: preparation and properties. Journal of Zhejiang University-SCIENCE A. 5, 906-911 (2004).
  30. Bao, L., Huang, Y. Synthesis and Properties of UV Curable Waterborne Polyurethane Acrylate Based on Modified Castor Oil. The pharmaceutical and chemical journal. 4, 34-40 (2017).
  31. Sharma, V., Orejon, D., Takata, Y., Krishnan, V., Harish, S. Gladiolus dalenii Based Bioinspired Structured Surface via Soft Lithography and Its Application in Water Vapor Condensation and Fog Harvesting. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 6, 6981-6993 (2018).
  32. Soffe, R., Altenhuber, N., Bernach, M., Remus-Emsermann, M. N. P., Nock, V. Comparison of replica leaf surface materials for phyllosphere microbiology. PloS one. 14, 1-19 (2019).
  33. Whitehead, D. C., Buchan, H., Hartlay, R. D. Composition and decomposition of roots of ryegrass and red clover. Soil Biology and Biochemistry. 11, 619-628 (1979).
  34. Ververis, C., Georghiou, K., Christodoulakis, N., Santas, P., Santas, R. Fiber dimensions, lignin and cellulose content of various plant material and their suitability for paper production. Industrial crops and products. 19, 245-254 (2004).
  35. Croser, C., Bengough, A. G., Pritchard, J. The effect of mechanical impedance on root growth in pea (Pisum sativum). II. Cell expansion and wall rheology during recovery. Physiologia Plantarum. 109, 150-159 (2000).
  36. Lipiec, J., Horn, R., Pietrusiewicz, J., Siczek, A. Effects of soil compaction on root elongation and anatomy of different cereal plant species. Soil and Tillage Research. 121, 74-81 (2012).
  37. Potocka, I., Szymanowska-Pulka, J. Morphological responses of plant roots to mechanical stress. Annals of botany. 122, 711-723 (2018).
सॉफ्ट लिथोग्राफी के परिवर्तन का उपयोग करके रूट सरफेस माइक्रोस्ट्रक्चर की बायोमिमेटिक प्रतिकृति
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Kumari, P., Sayas, T., Kleiman, M. Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography. J. Vis. Exp. (162), e61437, doi:10.3791/61437 (2020).More

Kumari, P., Sayas, T., Kleiman, M. Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography. J. Vis. Exp. (162), e61437, doi:10.3791/61437 (2020).

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