Biomimetikk har tidligere vært brukt som et verktøy for å studere bladmikroorganismeinteraksjoner. Det finnes imidlertid ikke noe slikt verktøy for røtter. Her utvikler vi en protokoll for å danne syntetiske overflater som etterligner rotoverflatemikrostruktur for studiet av rotmiljøinteraksjoner.
Biomimetikk er bruk av kjemi og materialvitenskap for å etterligne biologiske systemer, spesielt biologiske strukturer, for å bedre menneskeheten. Nylig ble biomimetiske overflater som etterligner mikrostrukturen av bladoverflaten, brukt til å studere effekten av bladmikrostruktur på bladmiljøinteraksjoner. Det finnes imidlertid ikke noe slikt verktøy for røtter. Vi utviklet et verktøy som tillater syntetisk etterligning av rotoverflaten mikrostruktur i en kunstig overflate. Vi stolte på den myke litografimetoden, kjent for mikrostrukturreplikasjon av bladoverflaten, ved hjelp av en to-trinns prosess. Det første trinnet er den mer utfordrende som det innebærer det biologiske vevet. Her brukte vi en annen polymer- og herdingsstrategi, avhengig av den sterke, stive, polyuretan, herdet av UV for rotstøpingen. Dette tillot oss å oppnå et pålitelig negativt bilde av rotoverflaten mikrostruktur, inkludert de delikate, utfordrende funksjoner som rothår. Vi brukte deretter dette negative bildet som en mal for å oppnå rotoverflaten mikrostruktur replikering ved hjelp av både veletablert polydimethyl siloxane (PDMS) samt en cellulose derivat, etyl cellulose, som representerer en nærmere etterligning av roten og som også kan degraderes av cellulase enzymer utskilt av mikroorganismer. Denne nyopprettede plattformen kan brukes til å studere de mikrostrukturelle effektene av overflaten i rotmikroorganismeinteraksjoner på samme måte som det som tidligere har blitt vist i blader. I tillegg gjør systemet oss i stand til å spore mikroorganismens steder, i forhold til overflatefunksjoner, og i fremtiden sin aktivitet, i form av cellulasekresjon.
Replikering av bladoverflatemikrostruktur er en kjent metode i biomimetikkforskningsfeltet1,2,3,4. De tidligste replikasjonene av bladoverflaten mikrostrukturen ble utført ved hjelp av neglelakk og gummimaterialer påføres på bladoverflaten for bedre visualisering av mikrostruktur, spesielt stomata5,6,7,8,9,10. Metoden ble deretter forbedret, og avanserte polymerer ble brukt til å etterligne bladoverflaten mikrostruktur ved hjelp av myk litografi, spesielt i sammenheng med biomimetikk av super hydrofobe overflater2,3,4,11,12. I de senere årene ble denne metoden bevist som et nyttig verktøy i studiet av samspillet mellom bladoverflaten og mikroorganismer som bor på overflaten, enten de er patogene13,,14 eller gunstige, som en del av den naturlige blad phyllosphere15. Forenkling av det naturlige systemet ble vist seg svært nyttig i studiet av overflatemikroorganisme interaksjoner selv når rent syntetiske systemer ble brukt som overflater15,16,17,18.
Mens replikering av bladoverflatemikrostruktur viste seg å være et nyttig verktøy for å studere samspillet som forekommer på overflaten av bladet med forskjellige mikroorganismer, finnes det ikke noe slikt verktøy for planterøtter. Planterøtter er vanskeligere å studere siden de ligger under bakken og alle interaksjoner forekommer i jorda. I likhet med blader, er rotoverflaten mikrostruktur sannsynlig å spille en rolle i rot-mikroorganisme interaksjoner. Det finnes imidlertid for tiden ingen metode for å isolere den spesifikke rollen til rotoverflatemikrostruktur i de komplekse rotmikroorganismeinteraksjonene. Den mest studerte rotoverflaten mikrostrukturisk funksjonen er rothårene19,20,21. Rothår har en viktig rolle i å øke overflatearealet, og ved at det gir mer effektivt inntak av næringsstoffer og vann22, men deres engasjement som en strukturell funksjon i rotmikroorganismerinteraksjoner har aldri blitt testet.
Den mest brukte polymeren for myk litografi i blader er polydimetyl siloxan (PDMS). PDMS egenskaper ligner de av blad cuticle15,23. Men i planterøtter er det mest tallrike materialet cellulose24,25 som har forskjellige egenskaper enn pdms26,27,28. Å bruke PDMS til å bygge en syntetisk plattform for å studere overflatemikrostruktureringseffektene i rotmiljøinteraksjoner er derfor mindre enn ideell.
Protokollen som presenteres her gjør det mulig å dannelse av syntetisk rotoverflate mikrostruktur kopi fra ulike materialer. Som metoden for bladoverflate mikrostruktur replikering er dette en to-trinns prosess. Det første trinnet bruker det biologiske vevet (rot) som en kilde for støping til en polyuretanform (en negativ replika). Polyuretanformen, som representerer det negative bildet av rotoverflatens mikrostruktur, kan deretter brukes som base for å generere den positive replikeringen av rotoverflatens mikrostruktur fra en rekke materialer, inkludert PDMS og cellulosederivater. Denne rotoverflatereplikeringen kan senere brukes som en plattform for å forstå overflatestrukturrollen i rotmikroorganismerinteraksjoner.
Vi presenterer en ny metode for replikering av rotoverflatemikrostruktur. Denne metoden er avhengig av eksisterende metoder for mikrostruktur replikering av bladoverflaten4. For å utvikle denne metoden måtte vi justere den eksisterende metoden for blader. Vi innså at det problematiske trinnet i å kopiere bladreplikasjonsmetoden til røtter innebærer det første trinnet i rotstøpingen. Dette er den mest følsomme delen av metoden som det innebærer det biologiske vevet. Som et resultat ønsket vi å velge en polymer som ville kreve relativt milde forhold for herding og dermed forårsaker minimal skade på det biologiske vevet. Vi valgte polyuretan fordi det kan polymeriseres raskt (innen 10 min) under UV-lys29. I tillegg er det veldig vanskelig når polymerisert30, og vi håpet at denne egenskapen ville tillate relativt enkel fjerning av roten fra polyuretanformen.
Den presenterte metoden er en to-trinns tilnærming der det negative bildet (negativ replika) dannes i det første trinnet, og replikeringen dannes i det andre trinnet, basert på den negative replikaen. Dette utvider materialområdet vi kan arbeide med. Bladoverflate mikrostruktur replikering ble hovedsakelig utført på PDMS eller epoxy materialer11,31. Noe arbeid ble gjort med andre materialer, spesielt materialer som støtter mikroorganismevekst13,,32. Dette er fordi denne metoden de siste årene har blitt brukt til å studere mikroorganisme-overflate interaksjoner i sammenheng med bladoverflatestruktur. Imidlertid har ingen celluloselignende materialer blitt brukt i denne metoden i sammenheng med blader. Vi foreslår bruk av en polyuretan negativ kopi som en mold og en rekke materialer for den positive kopien. Med andre ord, å lage den positive kopien, fra en rekke materialer, er relativt enkelt når en god negativ kopi er laget. Vi bruker for tiden cellulosederivater, men utforsker mulighetene for å bruke mer relevante materialer til rotoverflate som pektin og lignin33,34 i kombinasjon med cellulosederivater.
Metoden utvider også på den eksisterende metoden for bladoverflate mikrostruktur replikering siden bladet er en 2D-overflate mens rotoverflaten er buet og dermed er en 3D-overflate. Vår metode muliggjør ikke replikering av hele overflaten siden innebygging av hele roten i polyuretanløsningen tillater ikke frigjøring. Derfor må den ene siden av roten velges når du replikerer rotoverflaten mikrostruktur. Den genererte syntetiske overflaten er buet og representerer omtrent halvparten av overflaten, men ikke alt. Vår antagelse er at de strukturelle egenskapene til rotoverflaten for det meste er symmetriske om aksen langs rotlengden. Men i studier der slik symmetri ikke antas, bør man være forsiktig med å velge riktig siderot for å replikere.
Vi presenterer to alternativer for røtter som skal brukes som former. Den første er muligheten for adventitious røtter vokst fra stammen og den andre er muligheten for spirende røtter på papir. Det første alternativet er for det meste ment å hjelpe forskere med å praktisere metoden, da disse røttene er mer robuste og lettere å jobbe med. Det andre alternativet representerer de genetiske forskjellene som finnes mellom røtter av forskjellige sorter, uavhengig av miljøforholdene. Disse overflatene kan brukes som viktige forskningsverktøy, men man bør være klar over at miljøet kan ha en sterk innflytelse på rotoverflatestrukturen, spesielt jorda der røttene dyrkes35,36. På grunn av det mekaniske stresset påført av jorda, er noen morfologiske endringer bundet til å skje, i tillegg til sår som påløper på overflaten som roten trenger inn i jorda37. Fjerning av røtter fra jord, samt rengjøring av dem, uten å skade deres struktur er en svært vanskelig oppgave. Derfor er vi ikke optimistiske med hensyn til evnen til å bruke denne metoden til å etterligne rotoverflaten mikrostruktur av røtter dyrket i jord. Men for forskning som fokuserer på genetiske forskjeller eller miljøforskjeller der endringen i mikrostruktur er merkbart klar, kan denne metoden brukes som et verktøy for å studere påvirkning av rotoverflatemikrostruktur.
Vår metode produserer en inert overflate som bare etterligner de mikrostrukturelle egenskapene til rotoverflaten. Selv om denne metoden er utformet for å skille de strukturelle effektene i rotmiljøinteraksjoner fra alle andre effekter, kan vi ikke ignorere de kjemiske forbindelsene i disse interaksjonene. Noen mikroorganismer kan ikke overleve eller fungere på overflaten uten tilsetning av forbindelser, spesielt næringsstoffer. Det neste trinnet i utviklingen av denne plattformen vil være kontrollert tillegg av kjemiske forbindelser for å studere deres effekter på de ulike interaksjonene når de kombineres med struktur.
Denne metoden ble utviklet som et første skritt i utviklingen av en syntetisk plattform for å studere rotmikroorganismeinteraksjoner. Her etterligner vi mikrostrukturen på rotoverflaten, og denne første plattformen kan brukes til å studere påvirkning av overflatemikrostruktur på mikroorganismeatferd. Denne plattformen er imidlertid begrenset siden den mangler mange andre elementer fra det naturlige systemet. Denne plattformen bør videreutvikles med bruk av de riktige materialene for å generere overflaten og med tilsetning av andre, kritiske, kjemikalier i systemet. I en mer avansert plattform kan vi også forestille oss romlig distribusjon av kjemikaliene. Men siden det for tiden ikke finnes noen annen metode for å isolere strukturelle effekter i rotmikroorganismerinteraksjoner, håper vi at forskere kan bruke denne første plattformen til å stille strukturspesifikke spørsmål i disse interaksjonene.
The authors have nothing to disclose.
Forskning ble støttet av frømidler fra The Agricultural Research Organization til MK.
2-hydroxy-2-methylpropiophenone | Sigma | 405655 | |
Diethyl phthalate | Across | 114520010 | |
Diurethane dimetharylate | Sigma | 436909 | |
Ethyl cellulose | Across | 232705000 | |
Ethyl methacrylate | Sigma | 234893 | |
Shaphir Solution | GAT fertilizer | 6-2-4 | |
Sylgard 184 kit | Polymer-G | 510018400500 |