Biomimetik har tidigare använts som ett verktyg för att studera bladmikroorganisminteraktioner. Det finns dock inget sådant verktyg för rötter. Här utvecklar vi ett protokoll för att bilda syntetiska ytor som efterliknar rotytans mikrostruktur för studier av root-environment interaktioner.
Biomimetik är användningen av kemi och materialvetenskap för att efterlikna biologiska system, särskilt biologiska strukturer, för att förbättra mänskligheten. Nyligen användes biomimetiska ytor som härmar mikrostrukturen av bladytan för att studera effekterna av bladmikrostruktur på bladmiljöinteraktioner. Det finns dock inget sådant verktyg för rötter. Vi utvecklade ett verktyg som gör det möjligt för den syntetiska härmningen av rotytans mikrostruktur till en konstgjord yta. Vi förlitade oss på den mjuka litografimetoden, känd för bladytans mikrostrukturreplikation, med hjälp av en tvåstegsprocess. Det första steget är det mer utmanande eftersom det innebär den biologiska vävnaden. Här använde vi en annan polymer och härdning strategi, förlitar sig på den starka, styva, polyuretan, botas av UV för rotgjutning. Detta gjorde det möjligt för oss att uppnå en tillförlitlig negativ bild av rotytan mikrostruktur inklusive känsliga, utmanande funktioner såsom rot hårstrån. Vi använde sedan denna negativa bild som en mall för att uppnå rotytan mikrostruktur replikering med både väletablerade polydimethyl siloxan (PDMS) samt en cellulosa derivat, etyl cellulosa, som representerar en närmare härma av roten och som också kan brytas ned av cellulasenzymer utsöndras av mikroorganismer. Denna nybildade plattform kan användas för att studera ytans mikrostrukturella effekter i interaktioner mellan rot-mikroorganism på ett liknande sätt som vad som tidigare har visats i löv. Dessutom gör systemet det möjligt för oss att spåra mikroorganismens platser, i förhållande till ytegenskaper, och i framtiden dess aktivitet, i form av cellulassekretion.
Replikering av mikrostruktur med bladytor är en känd metod inom forskningsområdet biomimetik1,,2,,3,4. De tidigaste replikeringarna av bladytans mikrostruktur utfördes med hjälp av nagellack och gummimaterial som applicerades på bladytan för bättre visualisering av mikrostrukturen, särskilt stomata5,,6, 7,,7,8,9,10. Metoden förbättrades sedan, och avancerade polymerer användes för att efterlikna bladytans mikrostruktur med hjälp av mjuk litografi, särskilt i samband med biomimetik av super hydrofoba ytor2,,3,4,,11,12. Under de senaste åren har denna metod visat sig vara ett användbart verktyg i studien av samspelet mellan bladytan och mikroorganismer som bor på ytan oavsett om de är patogena13,,14 eller fördelaktigt, som en del av den naturliga bladfyllosfären15. Förenkling av det naturliga systemet har visat sig vara mycket användbart i studien av yt-mikroorganism interaktioner även när rent syntetiska system användes som ytor15,16,17,18.
Medan replikering av bladytan mikrostruktur visade sig vara ett användbart verktyg för att studera samspelet som förekommer på ytan av bladet med olika mikroorganismer, finns inget sådant verktyg för växtrötter. Växtrötter är svårare att studera eftersom de bor under marken och alla interaktioner förekommer i jorden. I likhet med blad, rot yta mikrostruktur kommer sannolikt att spela en roll i rot-mikroorganism interaktioner. För närvarande finns det dock ingen metod för att isolera den specifika rollen för rotyvattenmikrostruktur i de komplexa interaktionerna mellan rot-mikroorganism. Den mest studerade rotytan mikrostrukturella funktionen är rothår19,20,21. Rothår har en viktig roll för att öka ytan och genom att möjliggöra ett effektivare intag av näringsämnen och vatten22, men deras engagemang som ett strukturellt inslag i rot-mikroorganism interaktioner har aldrig testats.
Den mest använda polymeren för mjuk litografi i blad är polydimetylsiloxan (PDMS). PDMS egenskaper liknar de i blad nagelband15,23. Men i växtrötter, det mest rikliga materialet är cellulosa24,25 som har andra egenskaper än PDMS26,27,28. Att använda PDMS för att bygga en syntetisk plattform för att studera ytmikrostruktureffekterna i interaktioner mellan rotmiljöer är därför mindre än idealiskt.
Det protokoll som presenteras här möjliggör bildandet av syntetiska rot yta mikrostruktur replika från olika material. Liksom metoden för bladytan mikrostruktur replikering detta är en tvåstegsprocess. Det första steget använder den biologiska vävnaden (rot) som en källa för gjutning i en polyuretan mögel (en negativ replika). Den polyuretan mögel, som representerar den negativa bilden av rotytan mikrostruktur, kan sedan användas som bas för att generera positiv replikering av rotytan mikrostruktur från en mängd olika material, inklusive PDMS och cellulosa derivat. Denna rotytareplikering kan senare användas som en plattform för att förstå ytstrukturrollen i interaktioner med rot-mikroorganism.
Vi presenterar en ny metod för replikering av rotytan mikrostruktur. Denna metod bygger på befintliga metoder för mikrostrukturreplikation av bladytor4. För att utveckla denna metod var vi tvungna att justera den befintliga metoden för löv. Vi insåg att det problematiska steget i att kopiera bladreplikeringsmetoden till rötter innebär det första steget i rotgjutningen. Detta är den känsligaste delen av metoden eftersom det innebär den biologiska vävnaden. Som ett resultat ville vi välja en polymer som skulle kräva relativt milda förhållanden för härdning och därmed orsaka minimal skada på den biologiska vävnaden. Vi valde polyuretan eftersom det kan polymeriseras snabbt (inom 10 min) under UV-ljus29. Dessutom är det mycket svårt när polymeriserade30 och vi hoppades att denna egenskap skulle möjliggöra relativt enkelt avlägsnande av roten från polyuretan mögel.
Den presenterade metoden är en tvåstegsmetod där den negativa bilden (negativ replik) bildas i det första steget och replikeringen bildas i det andra steget, baserat på den negativa repliken. Detta utökar utbudet av material vi kan arbeta med. Replikation av bladytans mikrostruktur utfördes huvudsakligen på PDMS- eller epoximaterial11,,31. En del arbete utfördes med andra material, särskilt material som stöder mikroorganismtillväxt13,,32. Detta beror på att denna metod under de senaste åren har använts för att studera interaktioner mellan mikroorganism och yta i samband med bladytans struktur. Emellertid, inga cellulosa-liknande material har använts i denna metod i samband med blad. Vi föreslår användning av en polyuretan negativ replika som en form och en mängd olika material för den positiva replika. Med andra ord, att göra den positiva replika, från en mängd olika material, är relativt lätt när en bra negativ replika görs. Vi använder för närvarande cellulosaderivat, men undersöker möjligheterna att använda mer relevanta material till rotyta som pektin och lignin33,34 i kombination med cellulosaderivat.
Metoden expanderar också på den befintliga metoden för bladyta mikrostruktur replikering eftersom bladet är en 2D yta medan rotytan är böjd och därmed är en 3D-yta. Vår metod gör det inte möjligt att replikering av hela ytan eftersom inbäddning av hela roten i polyuretanlösningen inte tillåter dess frisättning. Därför måste en sida av roten väljas när du replikerar rotytans mikrostruktur. Den genererade syntetiska ytan är böjd och representerar ungefär halva ytan, men inte allt. Vårt antagande är att de strukturella egenskaperna hos rotytan är mestadels symmetriska om axeln längs rotlängden. Men i studier där en sådan symmetri inte antas, bör man vara noga med att välja lämplig sida rot att replikera.
Vi presenterar två alternativ för rötter som ska användas som formar. Den första är möjligheten till oavsiktliga rötter som odlas från stammen och den andra är möjligheten att gro rötter på papper. Det första alternativet är mest tänkt att hjälpa forskare att öva metoden eftersom dessa rötter är mer robusta och lättare att arbeta med. Det andra alternativet representerar de genetiska skillnader som finns mellan rötter av olika sorter, oavsett miljöförhållanden. Dessa ytor kan användas som viktiga forskningsverktyg, men man bör vara medveten om att miljön kan ha en stark inverkan på rotytan struktur, särskilt den jord där rötterna odlas35,36. På grund av den mekaniska stress som orsakas av jorden, vissa morfologiska förändringar är bundna att hända, förutom sår som tillkommer på ytan som roten tränger in i jorden37. Avlägsnande av rötter från jord, samt rengöring dem, utan att skada deras struktur är en mycket svår uppgift. Därför är vi inte optimistiska om förmågan att använda denna metod för att på ett tillförlitligt sätt efterlikna rotytan mikrostrukturen av rötter som odlas i jord. Men för forskning som fokuserar på genetiska skillnader eller miljöskillnader där förändringen i mikrostrukturen är märkbart tydlig, kan denna metod användas som ett verktyg för att studera påverkan av rotytemikrostruktur.
Vår metod producerar en inert yta som härmar endast de mikrostrukturella egenskaperna hos rotytan. Även om denna metod är utformad för att skilja de strukturella effekterna i root-environment interaktioner från alla andra effekter, vi kan inte ignorera de kemiska föreningarna i dessa interaktioner. Vissa mikroorganismer kanske inte överlever eller fungerar på ytan utan tillsats av föreningar, särskilt näringsämnen. Nästa steg i utvecklingen av denna plattform kommer att vara kontrollerad tillsats av kemiska föreningar för att studera deras effekter på de olika interaktionerna i kombination med struktur.
Denna metod utvecklades som ett första steg i utvecklingen av en syntetisk plattform för att studera interaktioner mellan rot-mikroorganism. Här efterliknar vi rotytans mikrostruktur och denna första plattform kan användas för att studera påverkan av ytmikrostruktur på mikroorganismbeteende. Denna plattform är dock begränsad eftersom den saknar många andra element från det naturliga systemet. Denna plattform bör vidareutvecklas med hjälp av rätt material för att generera ytan och med tillsats av andra, kritiska, kemikalier i systemet. I en mer avancerad plattform kan vi också tänka oss rumslig distribution av kemikalierna. Men eftersom det för närvarande inte finns någon annan metod för att isolera strukturella effekter i root-mikroorganism interaktioner, hoppas vi forskare skulle kunna använda denna första plattform för att ställa strukturspecifika frågor i dessa interaktioner.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen fick stöd av såddfonder från Jordbruksforskningsorganisationen till MK.
2-hydroxy-2-methylpropiophenone | Sigma | 405655 | |
Diethyl phthalate | Across | 114520010 | |
Diurethane dimetharylate | Sigma | 436909 | |
Ethyl cellulose | Across | 232705000 | |
Ethyl methacrylate | Sigma | 234893 | |
Shaphir Solution | GAT fertilizer | 6-2-4 | |
Sylgard 184 kit | Polymer-G | 510018400500 |