Summary
La biomimetica è stata precedentemente utilizzata come strumento per studiare le interazioni foglia-microrganismo. Tuttavia, tale strumento non esiste per le radici. Qui, sviluppiamo un protocollo per formare superfici sintetiche che imitano la microstruttura della superficie della radice per lo studio delle interazioni radice-ambiente.
Abstract
La biomimetica è l'uso della chimica e delle scienze dei materiali per imitare i sistemi biologici, in particolare le strutture biologiche, per migliorare l'umanità. Recentemente, le superfici biomimetiche che imitano la microstruttura della superficie fogliare, sono state utilizzate per studiare gli effetti della microstruttura foglia sulle interazioni foglia-ambiente. Tuttavia, tale strumento non esiste per le radici. Abbiamo sviluppato uno strumento che permette la mimica sintetica della microstruttura superficiale della radice in una superficie artificiale. Ci siamo affidati al metodo della litografia morbida, noto per la replica della microstruttura delle foglie, usando un processo in due fasi. Il primo passo è quello più impegnativo in quanto coinvolge il tessuto biologico. Qui, abbiamo usato un polimero diverso e una strategia di polimerazione, basandoci sul forte, rigido, poliuretano, curato dai raggi UV per lo stampaggio delle radici. Questo ci ha permesso di ottenere un'immagine negativa affidabile della microstruttura superficiale della radice, comprese le caratteristiche delicate e impegnative come i peli delle radici. Abbiamo quindi usato questa immagine negativa come modello per ottenere la replica della microstruttura superficiale della radice utilizzando sia il silossiano polidimetile ben consolidato (PDMS) sia un derivato di cellulosa, cellulosa etilare, che rappresenta un'imitazione più vicina della radice e che può anche essere degradata da enzimi cellulasi secreti da microrganismi. Questa piattaforma appena costituita può essere utilizzata per studiare gli effetti microstrutturali della superficie nelle interazioni radice-microrganismo in modo simile a quanto precedentemente mostrato nelle foglie. Inoltre, il sistema ci permette di tracciare le posizioni del microrganismo, rispetto alle caratteristiche di superficie, e in futuro la sua attività, sotto forma di secrezione cellulase.
Introduction
La replica della microstruttura superficiale delle foglie è un metodo noto nel campo di ricerca biomimetica1,2,3,4. Le prime repliche della microstruttura della superficie della foglia sono state eseguite utilizzando smalto e materiali in gomma applicati sulla superficie fogliare per una migliore visualizzazione della microstruttura, in particolare stomata5,6,7,8,9,10. Il metodo è stato poi migliorato, e polimeri avanzati sono stati utilizzati per imitare la microstruttura superficiale della foglia utilizzando litografia morbida, soprattutto nel contesto della biomimetica delle superfici superobiche2,3,4,11,12. Negli ultimi anni, questo metodo è stato dimostrato come uno strumento utile nello studio dell'interazione tra la superficie della foglia e i microrganismi che risiedono sulla superficie se sono patogeni13,14 o benefici, come parte della foglia naturale phyllosphere15. La semplificazione del sistema naturale si è dimostrata estremamente utile nello studio delle interazioni superficie-microrganismo anche quando i sistemi puramente sintetici venivano utilizzati come superfici15,16,17,18.
Mentre la replicazione della microstruttura superficiale della foglia è stata dimostrata uno strumento utile per studiare l'interazione che si verifica sulla superficie della foglia con diversi microrganismi, non esiste alcun tale strumento per le radici delle piante. Le radici delle piante sono più difficili da studiare poiché risiedono sotto il suolo e tutte le interazioni si verificano all'interno del suolo. Simile alle foglie, è probabile che la microstruttura superficiale della radice svolga un ruolo nelle interazioni radice-microrganismo. Tuttavia, attualmente non esiste alcun metodo per isolare il ruolo specifico della microstruttura superficiale della radice nelle complesse interazioni radice-microrganismo. La caratteristica microstrutturale superficiale della radice più studiata è la radice peli19,20,21. I peli delle radici hanno un ruolo importante nell'aumentare la superficie e consentendo un'assunzione più efficiente di nutrienti e acqua22, tuttavia il loro coinvolgimento come caratteristica strutturale nelle interazioni radice-microrganismo non è mai stato testato.
Il polimero più utilizzato per la litografia morbida nelle foglie è il siloxane polidimetile (PDMS). Le proprietà PDMS assomigliano a quelle della cuticola foglia15,23. Tuttavia, nelle radici delle piante, il materiale più abbondante è la cellulosa24,25 che ha proprietà diverse da quelle del PDMS26,27,28. L'utilizzo del PDMS per costruire una piattaforma sintetica per studiare gli effetti della microstruttura superficiale nelle interazioni radice-ambiente non è quindi ideale.
Il protocollo qui presentato consente la formazione di una replica di microstruttura superficiale della radice sintetica da vari materiali. Come il metodo per la replica della microstruttura della superficie foglia, questo è un processo in due fasi. Il primo passo utilizza il tessuto biologico (radice) come fonte per lo stampaggio in uno stampo di poliuretano (una replica negativa). Lo stampo in poliuretano, che rappresenta l'immagine negativa della microstruttura superficiale della radice, può quindi essere utilizzato come base per generare la replica positiva della microstruttura superficiale della radice da una varietà di materiali, tra cui PDMS e derivati della cellulosa. Questa replica della superficie radice può essere utilizzata in seguito come piattaforma per comprendere il ruolo della struttura superficiale nelle interazioni radice-microrganismo.
Protocol
1. Coltivare le piante e la preparazione delle radici
- Opzione 1: Preparare radici avventurose dal gambo.
- Prendere un vassoio di radicamento per la crescita delle piante.
- Riempire il vassoio con il terreno.
- Aggiungere un seme di cultivar di pomodoro M82 ad ogni cella del vassoio.
- Coprire i semi con un po' di terreno.
- Innaffiare il vassoio dal fondo con un contagocce mentre l'acqua riempie il fondo del vassoio e il terreno assorbe l'acqua.
- Aggiungere 2 mL di fertilizzante per 1 L di acqua sul fondo del vassoio una volta alla settimana.
- Coltivare in una camera di coltivazione a 25 gradi centigradi.
- Usa condizioni di illuminazione di 9 h di luce (7:00-16:00) alternate con 15 h di oscurità.
- Dopo 3 settimane rimuovere la pianta dal terreno.
- Tagliare il sistema radicale dalla pianta nel punto di interazione con lo stelo.
- Mettere la pianta senza radici in un bicchiere pieno d'acqua.
- Dopo alcuni giorni, tagliare le radici avventurose che emergono dal gambo e utilizzarle per la replica.
- Opzione 2: Preparare le radici germinanti dei semi.
- Umide una carta da filtro a base di piatto Petri con acqua.
- Mettere diversi semi M82 (non più di 10) sulla carta, all'interno di un piatto Petri.
- Incubare la piastra a 25 gradi centigradi.
- Idratare la carta ogni giorno.
- Dopo che le radici germinate sono abbastanza lunghe (circa 5 giorni), rimuovere i semi e utilizzare le radici per la replica.
2. Preparazione della replica negativa della radice dal poliuretano
- Per generare una soluzione di replica negativa, aggiungere 9,49 g di diurethane dimethacrylate a una fiala da 20 mL.
- Aggiungere 1,45 mL di methaclato etilico alla fiala.
- Mescolare a temperatura ambiente (RT) fino a quando la soluzione non appare chiara e diventa omogenea.
NOTA: circa 2 h sono sufficienti per raggiungere una soluzione omogenea. - Aggiungere 3 mL di plasticizzatore, ftalato dietile e mescolare per 1 ora a RT.
NOTA: Lo ftalato dietilico è miscibile in monomero acrilato. - Aggiungere 300 l dell'inproitore fotografico, 2-idrossio-2-metilpropiophenone, e mescolare durante la notte a RT. Continuare a mescolare fino a quando tutte le bolle sono state rimosse.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. La soluzione può essere mantenuta in RT.
- Per generare la replica negativa della radice, prendere una diapositiva di vetro pulito e versare 1 mL della soluzione di replica negativa su di esso.
- Posizionare le radici di 2-u20123 sulla soluzione. Non lasciare che le radici siano completamente coperte dalla soluzione.
- Mantenere il vetrino sotto 8 W ultra viola (UV) lampada per 8-u201210 min. Non tenere la soluzione sotto la luce UV per troppo tempo.
NOTA: È importante non mantenere la soluzione sotto la luce UV troppo a lungo poiché rende il poliuretano troppo duro, rendendo impossibile rimuovere la radice. - Spegnere la lampada UV, rimuovere la replica dal vetrino di vetro e metterla in un piatto Petri pieno di etanolo, per rimuovere il monomero non reagito.
- Per ottenere la replica negativa, rimuovere la radice dalla replica molto lentamente utilizzando forceps.
3. Preparare la replica positiva radice da PDMS.
- Per generare la miscela per la replica positiva, mettere 10 g di silossia dimetilo in un bicchiere di carta.
- Aggiungere 1 g di agente di polimerità e mescolare accuratamente.
- Tenere il composto in un desiccatore sotto vuoto per 2 h per rimuovere le bolle d'aria.
- Per generare la replica positiva, posizionare la replica negativa del poliuretano in un piatto di Petri.
- Versare la miscela PDMS sopra la replica negativa.
- Applicare il vuoto per 2 h per assicurare la copertura della microstruttura.
- Conservare il piatto Petri per una notte al RT.
- Separare la replica positiva curata dalla replica negativa a mano.
4. Preparare la radice replica positiva dalla cellulosa etilare.
- Per generare la soluzione di cellulosa etilare, mettere 1,32 ml di pthalate diethyl come plastificato in una tazza da 100 ml.
- Aggiungere 20 mL di etanolo e mescolare a Rt per 2 ore.
- Aggiungere 3,3 g di cellulosa etiliale e mescolare durante la notte.
- Per generare la replica positiva, posizionare la replica negativa del poliuretano in un piatto di Petri.
- Versare la soluzione di cellulosa etilale sopra la replica negativa.
- Conservare il piatto Petri per una notte al RT sotto il cofano.
- Rimuovere la replica positiva dalla replica negativa molto lentamente con le pinze.
Representative Results
Per formare la replica della microstruttura della superficie radice, è necessario scegliere una radice per lo stampaggio. Coltiviamo piante di pomodoro nel terreno, rendendo estremamente impegnativo l'uso della radice naturale dal sistema radicale. La rimozione del suolo dal sistema radicale può essere difficile e inoltre, le radici del sistema radicale sono fragili e possono rompersi su tentativi di stampaggio. Si consiglia quindi di utilizzare prima radici più rigide, per stabilire il protocollo in laboratorio. La formazione di tali radici è descritta nella Figura 1A. Il sistema radicale della pianta viene rimosso dopo che la pianta è stata coltivata per 3 settimane e la pianta senza radici viene posta in acqua per circa una settimana fino a quando le radici avventurose emergono dal gambo. Tali radici possono essere utilizzate per la replica durante la creazione del protocollo. Una volta che il protocollo è stato ben stabilito, si desidera una struttura superficiale radice più realistica. Qui suggeriamo di evitare le radici coltivate nel terreno come la completa rimozione del terreno in estremamente impegnativo. Invece suggeriamo l'uso di radici germinanti, fornendo preziose informazioni sulla microstruttura superficiale della radice di una pianta geneticamente specifica. La crescita di tali radici è descritta nella Figura 1B. I semi sono posti su una carta da filtro bagnata e incubati a 25 gradi centigradi. Dopo circa 5 giorni, durante i quali la carta da filtro viene mantenuta umida, le radici germinate sono abbastanza lunghe per la replica. Queste radici sono più fragili delle radici precedentemente suggerite e richiedono cure più delicate.
La produzione della replica della microstruttura della superficie della radice è un processo in due fasi. Nel primo passo la radice naturale viene modellata in uno stampo a base di poliuretano (la replica negativa). Il vantaggio di questo passaggio è che tutti i materiali per lo stampo in poliuretano vengono preparati e la radice viene posizionata sopra la soluzione preparata alla fine per un'esposizione di 10 min ai raggi UV. Di conseguenza, il tessuto biologico non è esposto a condizioni difficili per troppo tempo e può essere delicatamente maneggiato alla fine del processo. Se vengono seguiti tutti i passaggi del protocollo, viene generata una buona replica negativa. Questa replica mostrerà la struttura cellulare della superficie radice e i fori che rappresentano la posizione dei peli radice (Figura 2A). Se alcuni passaggi critici nel protocollo non vengono seguiti, la procedura avrà esito negativo. Uno di questi passaggi è il posizionamento della radice sulla soluzione di poliuretano prima della stagionatura. La radice deve essere posizionata molto delicatamente per evitare la sommergazione di esso nella soluzione di poliuretano. Tale sommersione, di qualsiasi parte della radice, causerà l'intrappolamento della radice nel polimero duro senza capacità di rimuoverla. Se si verifica un evento di questo tipo, la radice rimarrà all'interno della replica negativa dopo la sua cura (Figura 2B). Un altro passo cruciale è per quanto riguarda il tempo di stagionatura dalla luce UV. Il tempo di stagionatura raccomandato è di 8,u201210 min. La rottura della radice a volte può essere visibile ad occhio nudo, ad esempio, quando un pezzo di grandi dimensioni viene rotto (Figura 2C, superiore, contrassegnata con frecce viola). Tuttavia, a volte piccoli pezzi di radice sono lasciati nel materiale che sono difficili da individuare ad occhio nudo e un microscopio deve essere utilizzato (Figura 2C, in basso, contrassegnato con frecce viola). Si consiglia di esaminare attentamente la replica negativa del poliuretano con un microscopio prima della continuazione del protocollo per assicurarsi che non sia presente alcuna radice residua.
Una volta preparata la replica negativa del poliuretano; molti materiali possono essere utilizzati per la preparazione della replica positiva. La preparazione della replica positiva, utilizzando la replica negativa del poliuretano come stampo, è semplice e dipende completamente dalla qualità della replica negativa del poliuretano. Per generare la replica positiva abbiamo usato sia PDMS - come è ben noto nel campo della litografia morbida (Figura 3A)- e cellulosa etilale come materiale che imita meglio le proprietà della superficie della radice che è per lo più composta di cellulosa (Figura 3B). L'immagine SEM della replica PDMS mostra i peli radice molto chiaramente. I peli sono nella zona di allungamento, dove cominciano ad emergere. Quindi, la lunghezza dei peli delle radici varia lungo la superficie della radice man mano che diventano più lunghi, proprio come nella radice naturale (Figura 3A). La cellulosa etiliale genera pellicole più dure e meno flessibili del PDMS. Quindi, la rimozione di esso dallo stampo negativo richiede più cura. Tuttavia, alcuni peli e la microstruttura superficiale sono visibili al microscopio luminoso (Figura 3B). Abbiamo usato questi due materiali per generare la replica positiva, tuttavia, qualsiasi materiale che può formare un film sarà un buon candidato per la replica positiva, utilizzando la replica negativa in poliuretano.
Figura 1: Radici delle piante di pomodoro per la replica. (A) Una pianta di pomodoro (M82) viene coltivata a 25 gradi centigradi con 9 h di luce e 15 h di oscurità. Dopo 3 settimane, la pianta viene rimossa dal terreno e l'impianto radicale viene tagliato. La pianta senza radici viene messa in acqua fino a quando le radici avventurose emergono dallo stelo dopo circa una settimana. Queste radici non mostrano la struttura esatta come le radici del sistema radicale, ma rappresentano un buon modello. Queste radici sono meno fragili delle radici del sistema radicale e quindi sono preferite lavorare con quando si stabilisce la tecnica in laboratorio. (B) I semi di pomodoro (M82) vengono messi su una carta da filtro bagnata in un piatto di Petri e incubati a 25 gradi centigradi. La carta viene idratata ogni giorno e i semi stanno germogliando. Le radici sono in crescita e dopo circa 5 giorni sono abbastanza lunghe da essere utilizzate per la replica. Queste radici sono più dolci e dovrebbero essere utilizzate una volta che il metodo è ben stabilito. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Microscopia delle immagini della replica negativa del poliuretano. (A) Immagine SEM della replica negativa in poliuretano realizzata secondo un protocollo che segue tutti i passaggi. La struttura cellulare è chiaramente visibile. Le frecce gialle puntano ai fori formati dai peli nella radice. (B) Immagini microscopia leggera di replica negativa poliuretano con una radice all'interno in quanto era completamente coperta con la soluzione e la sua rimozione era impossibile. Il negativo del poliuretano è stato curato con la radice all'interno. La radice è visibile a occhio e utilizzando la microscopia leggera. È impossibile rimuovere questa radice dalla replica curata. (C) Immagini microscopiche leggere di replica negativa poliuretano che è stata tenuta sotto la luce UV per troppo tempo. Di conseguenza, la radice non poteva essere completamente rimossa dal polimero con particelle grandi visibili ad occhio (immagine superiore, contrassegnata con frecce viola) o piccole frazioni visibili solo dal microscopio (immagine inferiore, contrassegnata con frecce viola). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini al microscopio di replica positiva. (A) Micrografo SEM di una replica positiva ricostituita da PDMS. L'ingrandimento mostra i peli della radice. (B) Immagini microscopiche leggere di una replica positiva in cellulosa etiliale. I capelli vengono visualizzati nelle immagini a destra mentre la texture della superficie è visibile nell'immagine a sinistra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Vi presentiamo un nuovo metodo per la replica della microstruttura superficiale della radice. Questo metodo si basa sui metodi esistenti di replica della microstruttura della superficie fogliare4. Al fine di sviluppare questo metodo, abbiamo dovuto modificare il metodo esistente per le foglie. Ci siamo resi conto che il passo problematico nella copia del metodo di replica foglia nelle radici comporta il primo passo dello stampaggio della radice. Questa è la parte più sensibile del metodo in quanto coinvolge il tessuto biologico. Di conseguenza, volevamo scegliere un polimero che richiedesse condizioni relativamente delicate per la stagionatura e quindi causando danni minimi al tessuto biologico. Abbiamo scelto il poliuretano perché può essere polimerizzato rapidamente (entro 10 min) sotto la luce UV29. Inoltre, è molto difficile una volta polimerizzato30 e speravamo che questa proprietà avrebbe permesso la rimozione relativamente facile della radice dallo stampo poliuretano.
Il metodo presentato è un approccio in due passaggi in cui l'immagine negativa (replica negativa) viene formata nel primo passaggio e la replica viene formata nel secondo passaggio, in base alla replica negativa. Questo estende la gamma di materiali con cui possiamo lavorare. La replica della microstruttura di superficie fogliare è stata eseguita principalmente su PDMS o su materiali epossidici11,31. Alcuni lavori sono stati fatti con altri materiali, in particolare materiali a sostegno della crescita del microrganismo13,32. Questo perché negli ultimi anni questo metodo è stato utilizzato per studiare le interazioni microrganismi-superficie nel contesto della struttura della superficie fogliare. Tuttavia, nessun materiale simile alla cellulosa è stato utilizzato in questo metodo nel contesto delle foglie. Suggeriamo l'uso di una replica negativa in poliuretano come stampo e una varietà di materiali per la replica positiva. In altre parole, rendere la replica positiva, da una varietà di materiali, è relativamente facile una volta che viene fatta una buona replica negativa. Attualmente utilizziamo derivati di cellulosa, ma stiamo esplorando le possibilità di utilizzare materiali più rilevanti per la superficie della radice come la pectina e la lignina33,34 in combinazione con i derivati della cellulosa.
Il metodo si espande anche sul metodo esistente di replica della microstruttura della superficie fogliare poiché la foglia è una superficie 2D mentre la superficie della radice è curva e quindi è una superficie 3D. Il nostro metodo non consente la replica dell'intera superficie poiché l'incorporamento dell'intera radice nella soluzione di poliuretano non ne consente il rilascio. Pertanto, un lato della radice deve essere scelto durante la replica della microstruttura della superficie della radice. La superficie sintetica generata è curva e rappresenta circa la metà della superficie, ma non tutta. Il presupposto è che le caratteristiche strutturali della superficie della radice siano per lo più simmetriche attorno all'asse lungo la lunghezza della radice. Tuttavia, negli studi in cui tale simmetria non è assunta, si dovrebbe fare attenzione a scegliere la radice laterale appropriata da replicare.
Vi presentiamo due opzioni per le radici da utilizzare come stampi. Il primo è la possibilità di radici avventurose coltivate dal gambo e il secondo è la possibilità di radici germinate sulla carta. La prima opzione è per lo più destinata ad assistere i ricercatori nella pratica del metodo in quanto queste radici sono più robuste e più facili da lavorare. La seconda opzione rappresenta le differenze genetiche che si possono trovare tra le radici di diverse cultivar, indipendentemente dalle condizioni ambientali. Queste superfici possono essere utilizzate come importanti strumenti di ricerca, tuttavia, bisogna essere consapevoli del fatto che l'ambiente può avere una forte influenza sulla struttura della superficie della radice, in particolare sul terreno in cui le radici sono cresciute35,36. A causa della sollecitazione meccanica inflitta dal suolo, alcuni cambiamenti morfologici sono destinati ad accadere, oltre alle ferite che maturano sulla superficie come la radice penetra il suolo37. La rimozione delle radici dal suolo, così come la pulizia, senza danneggiare la loro struttura è un compito molto difficile. Pertanto, non siamo ottimisti sulla capacità di utilizzare questo metodo per imitare in modo affidabile la microstruttura superficiale della radice delle radici coltivate nel suolo. Tuttavia, per la ricerca che si concentra sulle differenze genetiche o ambientali in cui il cambiamento nella microstruttura è notevolmente chiaro, questo metodo può essere utilizzato come strumento per studiare l'influenza della microstruttura superficiale della radice.
Il nostro metodo produce un'inerte superficie che imita solo le proprietà microstrutturali della superficie della radice. Mentre questo metodo è progettato per separare gli effetti strutturali nelle interazioni radice-ambiente da tutti gli altri effetti, non possiamo ignorare i composti chimici in tali interazioni. Alcuni microrganismi non possono sopravvivere o funzionare sulla superficie senza l'aggiunta di composti, in particolare i nutrienti. Il prossimo passo nello sviluppo di questa piattaforma sarà l'aggiunta controllata di composti chimici per studiare i loro effetti sulle diverse interazioni quando combinato con la struttura.
Questo metodo è stato sviluppato come primo passo nello sviluppo di una piattaforma sintetica per studiare le interazioni radice-microrganismo. Qui imitiamo la microstruttura della superficie della radice e questa piattaforma iniziale può essere utilizzata per studiare l'influenza della microstruttura superficiale sul comportamento del microrganismo. Tuttavia, questa piattaforma è limitata in quanto manca di molti altri elementi del sistema naturale. Questa piattaforma dovrebbe essere ulteriormente sviluppata con l'uso dei materiali giusti per generare la superficie e con l'aggiunta di altri prodotti chimici critici nel sistema. In una piattaforma più avanzata, possiamo anche immaginare la distribuzione spaziale delle sostanze chimiche. Tuttavia, poiché attualmente non esiste un altro metodo per isolare gli effetti strutturali nelle interazioni radice-microrganismo, speriamo che i ricercatori possano utilizzare questa piattaforma iniziale per porre domande specifiche della struttura in tali interazioni.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca è stata sostenuta da fondi di sementi da The Agricultural Research Organization a MK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-hydroxy-2-methylpropiophenone | Sigma | 405655 | |
| Diethyl phthalate | Across | 114520010 | |
| Diurethane dimetharylate | Sigma | 436909 | |
| Ethyl cellulose | Across | 232705000 | |
| Ethyl methacrylate | Sigma | 234893 | |
| Shaphir Solution | GAT fertilizer | 6-2-4 | |
| Sylgard 184 kit | Polymer-G | 510018400500 |
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