Biomimetik er tidligere blevet brugt som et redskab til at studere blad-mikroorganisme interaktioner. Men, ikke et sådant værktøj findes for rødder. Her udvikler vi en protokol til at danne syntetiske overflader efterligne rodoverflade mikrostruktur til undersøgelse af rod-miljø interaktioner.
Biomimetik er brugen af kemi og materialevidenskab til at efterligne biologiske systemer, specielt biologiske strukturer, for at forbedre menneskeheden. For nylig, biomimetiske overflader efterligne mikrostruktur af bladoverflade, blev brugt til at studere virkningerne af blad mikrostruktur på blad-miljø interaktioner. Men, ikke et sådant værktøj findes for rødder. Vi udviklede et værktøj, der tillader syntetisk efterligning af rodoverfladen mikrostruktur i en kunstig overflade. Vi stolede på den bløde litografi metode, kendt for blad overflade mikrostruktur replikation, ved hjælp af en to-trins proces. Det første skridt er den mere udfordrende, da det involverer det biologiske væv. Her brugte vi en anden polymer og hærdning strategi, bygger på den stærke, stive, polyurethan, hærdet af UV til rodstøbning. Dette gav os mulighed for at opnå et pålideligt negativt billede af rodoverfladens mikrostruktur, herunder de delikate, udfordrende funktioner som rodhår. Vi brugte derefter dette negative billede som en skabelon for at opnå rodoverfladen mikrostruktur replikation ved hjælp af både den veletablerede polydimethyl siloxane (PDMS) samt en cellulose derivat, ethyl cellulose, som repræsenterer en tættere efterligne af roden, og som også kan nedbrydes af cellulase enzymer udskilles af mikroorganismer. Denne nydannede platform kan bruges til at studere de mikrokonstruktionelle virkninger af overfladen i root-mikroorganisme interaktioner på samme måde som hvad der tidligere har været vist i blade. Derudover gør systemet det muligt for os at spore mikroorganismens placeringer i forhold til overfladefunktioner og i fremtiden dets aktivitet i form af cellulasekretion.
Replikering af mikrostrukturer af bladoverfladen er en kendt metode i biomimetikforskningsfelt1,,2,,3,4. De tidligste replikationer af bladoverfladens mikrostruktur blev udført ved hjælp af neglelak og gummimaterialer , der blev anvendt på bladoverfladen for bedre visualisering af mikrokonstruktionen , specielt stomata5,6,7,8,9,10. Metoden blev derefter forbedret, og avancerede polymerer blev anvendt til at efterligne mikrostrukturer af bladoverfladen ved hjælp af blød litografi, især i forbindelse med biomimetik af super hydrofobiskeoverflader 2,,3,4,11,12. I de seneste år, denne metode blev bevist som et nyttigt redskab i undersøgelsen af samspillet mellem bladets overflade og mikroorganismer bosat påoverfladen,om de er patogene13,14 eller gavnlige, som en del af det naturlige blad phyllosfæren15. Forenkling af natursystemet har vist sig at være yderst nyttig i forbindelse med undersøgelsen af samspillet mellem overflade og mikroorganisme , selv når rent syntetiske systemer blev anvendt somoverflader 15,16,17,18.
Mens replikering af bladoverflademikrostruktur viste sig at være et nyttigt redskab til at studere den interaktion, der forekommer på bladets overflade med forskellige mikroorganismer, findes der ikke et sådant værktøj til planterødder. Planterødder er sværere at studere, da de bor under jorden og alle interaktioner forekommer i jorden. Svarende til blade, rod overflade mikrostruktur vil sandsynligvis spille en rolle i rod-mikroorganisme interaktioner. Men på nuværende tidspunkt findes der ingen metode til at isolere den specifikke rolle, som rodoverflademikrostruktur spiller i de komplekse rodmikroorganismeinteraktioner. Den mest undersøgte rod overflade mikrostrukural funktion er roden hår19,,20,,21. Rodhår har en vigtig rolle i at øge overfladearealet og ved at tillade mere effektiv indtagelse af næringsstofferog vand 22,men deres engagement som et strukturelt træk i root-mikroorganisme interaktioner er aldrig blevet testet.
Den mest udbredte polymer til blød litografi i blade er polydimethyl siloxan (PDMS). PDMS-egenskaber ligner egenskaberne i bladstulatet15,23. I planterødder er det mest rigelige materiale imidlertid cellulose24,25, som har andre egenskaber end PDMS26,27,28., Brug pdms til at opbygge en syntetisk platform til at studere overfladen mikrostruktur effekter i rod-miljø interaktioner er derfor mindre end ideel.
Den protokol, der præsenteres her, gør det muligt at danne syntetisk rodoverflademikrostrukturreplika fra forskellige materialer. Ligesom metoden til blad overflade mikrostruktur replikering dette er en to-trins proces. Det første skridt bruger det biologiske væv (rod) som en kilde til støbning i en polyurethan skimmel (en negativ replika). Polyurethanformen, som repræsenterer det negative billede af rodoverfladens mikrostruktur, kan derefter bruges som base for at generere den positive replikation af rodoverfladens mikrostruktur fra en række forskellige materialer, herunder PDMS og cellulosederivater. Denne rodoverfladereplikering kan senere bruges som en platform til at forstå overfladestrukturens rolle i root-microorganism interaktioner.
Vi præsenterer en ny metode til replikering af rodoverfladen mikrostruktur. Denne metode bygger på eksisterende metoder til bladoverfladens mikrostrukturreplikation4. For at udvikle denne metode, vi var nødt til at justere den eksisterende metode til blade. Vi indså, at det problematiske skridt i at kopiere bladet replikering metode til rødder indebærer det første skridt i roden støbning. Dette er den mest følsomme del af metoden, da det involverer det biologiske væv. Som følge heraf ønskede vi at vælge en polymer, der ville kræve relativt skånsomme betingelser for hærdning og dermed forårsage minimal skade på det biologiske væv. Vi valgte polyurethan, fordi det kan polymeriseres hurtigt (inden for 10 min) under UV-lys29. Derudover er det meget svært, når polymeriseret30, og vi håbede, at denne egenskab ville give mulighed for relativt nem fjernelse af roden fra polyurethanformen.
Den præsenterede metode er en to-trins tilgang, hvor det negative billede (negativ replika) dannes i det første trin, og replikeringen dannes i det andet trin, baseret på den negative replika. Dette udvider den vifte af materialer, vi kan arbejde med. Replikation af bladoverfladens mikrostruktur blev hovedsagelig udført på PDMS – eller epoxymaterialer11,31. Noget arbejde blev udført med andre materialer , specielt materialer, der understøtter mikroorganismevækst 13,32. Dette skyldes, at denne metode i de senere år er blevet anvendt til at studere mikroorganisme-overflade interaktioner i forbindelse med bladoverfladestruktur. Der er imidlertid ikke anvendt celluloselignende materialer i denne metode i forbindelse med blade. Vi foreslår brug af en polyurethan negativ replika som en støbeform og en række materialer til den positive replika. Med andre ord, hvilket gør den positive replika, fra en række forskellige materialer, er relativt let, når en god negativ replika er lavet. Vi bruger i øjeblikket cellulose derivater, men er ved at undersøge mulighederne for at bruge mere relevante materialer til rodoverfladen såsom pektin og lignin33,34 i kombination med cellulose derivater.
Metoden udvider også den eksisterende metode til bladoverflade mikrostruktur replikation, da bladet er en 2D-overflade, mens rodoverfladen er buet og dermed er en 3D-overflade. Vores metode gør det ikke muligt at replikere hele overfladen, da indlejring af hele roden i polyurethanopløsningen ikke giver mulighed for dens frigivelse. Derfor skal den ene side af roden vælges, når roden overflade mikrostruktur. Den genererede syntetiske overflade er buet og repræsenterer omkring halvdelen af overfladen, men ikke det hele. Vores antagelse er, at de strukturelle træk ved rodoverfladen er for det meste symmetriske om aksen langs rodlængden. Men i undersøgelser, hvor en sådan symmetri ikke antages, bør man være omhyggelig med at vælge den passende side rod til at replikere.
Vi præsenterer to muligheder for rødder, der skal bruges som forme. Den første er muligheden for utilsigtede rødder dyrket fra stilken og den anden er muligheden for spirede rødder på papir. Den første mulighed er for det meste beregnet til at hjælpe forskere med at praktisere metoden, da disse rødder er mere robuste og lettere at arbejde med. Den anden mulighed repræsenterer de genetiske forskelle, der kan findes mellem rødderne af forskellige sorter, uanset de miljømæssige forhold. Disse overflader kan bruges som vigtige forskningsværktøjer, men man skal være opmærksom på, at miljøet kan have en stærk indflydelse på rodens overfladestruktur, især den jord, hvor rødderne dyrkes35,36. På grund af den mekaniske belastning, som jorden, nogle morfologiske ændringer er bundet til at ske, ud over sår påfængt på overfladen som roden trængerind i jorden 37. Fjernelse af rødder fra jorden, samt rengøring dem, uden at beskadige deres struktur er en meget vanskelig opgave. Derfor er vi ikke optimistiske med hensyn til evnen til at bruge denne metode til pålideligt at efterligne roden overflade mikrostruktur af rødder dyrket i jord. Men for forskning, der fokuserer på genetiske forskelle eller miljømæssige forskelle, hvor ændringen i mikrostruktur er mærkbart klar, kan denne metode bruges som et redskab til at undersøge indflydelsen af rodoverfladen mikrostruktur.
Vores metode producerer en inert overflade efterligner kun de mikrostrulige egenskaber af rodoverfladen. Mens denne metode er designet til at adskille de strukturelle virkninger i rod-miljø interaktioner fra alle andre effekter, Vi kan ikke ignorere de kemiske forbindelser i disse interaktioner. Nogle mikroorganismer kan ikke overleve eller fungere på overfladen uden tilsætning af forbindelser, specielt næringsstoffer. Det næste skridt i udviklingen af denne platform vil være kontrolleret tilsætning af kemiske forbindelser til at studere deres virkninger på de forskellige interaktioner, når de kombineres med struktur.
Denne metode blev udviklet som et første skridt i udviklingen af en syntetisk platform til at studere root-mikroorganisme interaktioner. Her efterligner vi mikrokonstruktionen af rodoverfladen, og denne første platform kan bruges til at studere overfladens mikrostrukturs indflydelse på mikroorganismens adfærd. Men denne platform er begrænset, da den mangler mange andre elementer fra det naturlige system. Denne platform bør videreudvikles ved hjælp af de rigtige materialer til at generere overfladen og med tilsætning af andre, kritiske kemikalier i systemet. I en mere avanceret platform kan vi også forestille os rumlig fordeling af kemikalierne. Men da der i øjeblikket ikke findes nogen anden metode til at isolere strukturelle virkninger i root-mikroorganisme interaktioner, vi håber forskere kunne bruge denne oprindelige platform til at stille struktur-specifikke spørgsmål i disse interaktioner.
The authors have nothing to disclose.
Forskning blev støttet af frø midler fra The Agricultural Research Organization til MK.
2-hydroxy-2-methylpropiophenone | Sigma | 405655 | |
Diethyl phthalate | Across | 114520010 | |
Diurethane dimetharylate | Sigma | 436909 | |
Ethyl cellulose | Across | 232705000 | |
Ethyl methacrylate | Sigma | 234893 | |
Shaphir Solution | GAT fertilizer | 6-2-4 | |
Sylgard 184 kit | Polymer-G | 510018400500 |