Биомиметика ранее использовалась в качестве инструмента для изучения взаимодействий листовых микроорганизмов. Однако такого инструмента для корней не существует. Здесь мы разрабатываем протокол для формирования синтетических поверхностей, имитирующих микроструктуру поверхности корней для изучения корневых взаимодействий с окружающей средой.
Биомиметика – это использование химии и материальных наук для имитации биологических систем, в частности биологических структур, для улучшения человечества. В последнее время биомиметические поверхности, имитирующие микроструктуру поверхности листьев, были использованы для изучения влияния микроструктуры листьев на взаимодействие листьев-среды. Однако такого инструмента для корней не существует. Мы разработали инструмент, позволяющий синтетическую мимику микроструктуры поверхности корня в искусственную поверхность. Мы полагались на метод мягкой литографии, известный репликацией микроструктур на поверхности листьев, используя двухступенчатый процесс. Первый шаг является более сложным, поскольку он включает в себя биологические ткани. Здесь мы использовали различные полимера и лечения стратегии, опираясь на сильный, жесткий, полиуретан, вылечить УФ для корневой формования. Это позволило нам достичь надежного негативного изображения микроструктуры поверхности корня, включая тонкие, сложные функции, такие как корневые волосы. Затем мы использовали этот отрицательный образ в качестве шаблона для достижения репликации микроструктуры поверхности корня, используя как устоявшиеся полидилил силоксан (PDMS), а также производную целлюлозы, этил целлюлозы, которая представляет собой более тесную имитацию корня и которая также может быть деградирована ферментами целлюлозы, выделяемыми микроорганизмами. Эта вновь сформированная платформа может быть использована для изучения микроструктурных эффектов поверхности в корневых микроорганизмов взаимодействия таким же образом, что ранее было показано в листьях. Кроме того, система позволяет отслеживать расположение микроорганизмов, относительно поверхностных особенностей, а в дальнейшем его активность, в виде секреции целлюлазы.
Репликация микроструктуры поверхности листа является известным методом в области исследований биомиметики1,,2,,3,4. Самые ранние репликации микроструктуры поверхности листа были выполнены с использованием лака для ногтей и резиновых материалов, нанесенных на поверхность листа для лучшей визуализации микроструктуры, в частности stomata5,,6,7,8,9,10. Метод был затем усовершенствован, и передовые полимеры были использованы для имитации микроструктуры поверхности листьев с помощью мягкой литографии, особенно в контексте биомиметики супергикофических поверхностей2,3,4,11,12. В последние годы этот метод был доказан в качестве полезного инструмента в изучении взаимодействия между поверхностью листьев и микроорганизмов, проживающих на поверхности, являются ли они патогенными13,14 или полезным, как часть естественной филлиосферы листьев15. Упрощение естественной системы оказалось чрезвычайно полезным при изучении поверхностно-микроорганизмных взаимодействий даже тогда, когда чисто синтетические системы использовались в качестве поверхностей15,,16,,17,,18.
В то время как репликация микроструктуры поверхности листьев была показана как полезный инструмент для изучения взаимодействия, происходящего на поверхности листа с различными микроорганизмами, такого инструмента для корней растений не существует. Корни растений труднее изучать, так как они находятся под землей, и все взаимодействия происходят в почве. Как и листья, микроструктура поверхности корня, вероятно, будет играть определенную роль в корневых и микроорганизмных взаимодействиях. Однако в настоящее время не существует метода изоляции конкретной роли микроструктуры поверхности корня в сложных корневых и микроорганизмных взаимодействиях. Наиболее изученной микроструктурной особенностью поверхности корня является корневыеволосы 19,,20,,21. Корневые волосы играют важную роль в увеличении площади поверхности и тем, что позволяет более эффективное потребление питательных веществ иводы 22, однако их участие в качестве структурной особенностью в корневых микроорганизмов взаимодействия никогда не были протестированы.
Наиболее широко используемым полимером для мягкой литографии в листьях является полидиметил силоксан (PDMS). PDMS свойства напоминают те из листа кутикулы15,23. Однако, в корнях растений, наиболее распространенным материалом является целлюлоза24,25, которая имеет различные свойства, чем у PDMS26,27,28., Использование PDMS для создания синтетической платформы для изучения эффектов микроструктуры поверхности в корневых взаимодействиях является, следовательно, менее чем идеальным.
Представленный здесь протокол позволяет формировать синтетическую микроструктурную реплику поверхности корня из различных материалов. Как и метод репликации микроструктуры поверхности листа, это двухступенчатый процесс. Первый шаг использует биологическую ткань (корень) в качестве источника для литья в полиуретановую форму (отрицательная реплика). Полиуретановая плесень, которая представляет отрицательное изображение микроструктуры поверхности корня, может быть использована в качестве основы для генерации положительной репликации микроструктуры поверхности корня из различных материалов, включая PDMS и производные целлюлозы. Эта репликация поверхности корня может быть позже использована в качестве платформы для понимания роли структуры поверхности в корневых взаимодействиях микроорганизмов.
Мы представляем новый метод репликации микроструктуры поверхности корня. Этот метод опирается на существующие методы репликации микроструктуры поверхности листа4. Для того, чтобы разработать этот метод, мы должны были настроить существующий метод для листьев. Мы поняли, что проблематичный шаг в копировании метода репликации листьев в корни включает в себя первый шаг корневой литья. Это наиболее чувствительная часть метода, поскольку она включает в себя биологическую ткань. В результате, мы хотели выбрать полимер, который потребует относительно щадящих условий для лечения и, следовательно, вызывая минимальный ущерб биологической ткани. Мы выбрали полиуретан, потому что он может быть полимеризован быстро (в течение 10 мин) под ультрафиолетовым светом29. Кроме того, это очень трудно после полимеризации30, и мы надеялись, что это свойство позволит относительно легкое удаление корня из полиуретановой формы.
Представленный метод представляет собой двухступенчатый подход, при котором отрицательное изображение (отрицательная реплика) формируется на первом этапе, а репликация формируется на втором этапе, основанном на отрицательной реплике. Это расширяет спектр материалов, с которых мы можем работать. Репликация микроструктуры поверхности листьев в основном проводилась на PDMS или эпоксидных материалах11,,31. Некоторая работа была сделана с другими материалами, специфически материалами поддерживая рост микроорганизмов13,,32. Это связано с тем, что в последние годы этот метод используется для изучения взаимодействий между микроорганизмами и поверхностью в контексте структуры поверхности листьев. Однако в этом методе в контексте листьев не использовались материалы, похожие на целлюлозу. Мы предлагаем использовать полиуретановую отрицательную реплику в качестве формы и различные материалы для положительной реплики. Другими словами, сделать положительную копию из различных материалов, относительно легко, как только хорошая отрицательная реплика сделана. В настоящее время мы используем производные целлюлозы, но исследуем возможности использования более релевантных материалов для корневой поверхности, таких как пектин и лигнин33,34 в сочетании с производными целлюлозы.
Метод также расширяет существующий метод репликации микроструктуры поверхности листа, так как лист представляет собой 2D-поверхность, в то время как корневая поверхность изогнута и, следовательно, является 3D-поверхностью. Наш метод не позволяет реплицировать всю поверхность, так как встраивание всего корня в полиуретановой раствор не позволяет его высвобождение. Таким образом, одна сторона корня должна быть выбрана при репликации микроструктуры поверхности корня. Образуемая синтетическая поверхность изогнута и представляет примерно половину поверхности, но не все. Мы предполагаем, что структурные особенности поверхности корня в основном симметричны по оси вдоль длины корня. Однако в исследованиях, где такая симметрия не предполагается, следует быть осторожным, чтобы выбрать соответствующий боковой корень для репликации.
Мы представляем два варианта для корней, которые будут использоваться в качестве формы. Во-первых, вариант авантюрных корней, выращенных из стебля, а второй вариант проросли корни на бумаге. Первый вариант в основном предназначен для оказания помощи исследователям в практике метода, как эти корни являются более надежными и легче работать. Второй вариант представляет генетические различия, которые могут быть найдены между корнями различных сортов, независимо от условий окружающей среды. Эти поверхности могут быть использованы в качестве важных инструментов исследования, однако, следует знать, что окружающая среда может иметь сильное влияние на структуру поверхности корня, в частности почвы, в которой корни выращиваются35,36. Из-за механического стресса, нанесенного почвой, некоторые морфологические изменения обязательно произойдет, в дополнение к раны, направляющиеся на поверхности, как корень проникает в почву37. Удаление корней из почвы, а также их очистка, не повреждая их структуру, является очень сложной задачей. Таким образом, мы не оптимистично настроены в отношении способности использовать этот метод для надежной имитации микроструктуры корневой поверхности корней, выращенных в почве. Однако для исследований, которые сосредоточены на генетических различиях или экологических различиях, где изменение микроструктуры заметно ясно, этот метод может быть использован в качестве инструмента для изучения влияния микроструктуры поверхности корня.
Наш метод создает инертную поверхность, имитируя только микроструктурные свойства корневой поверхности. Хотя этот метод предназначен для отделения структурных эффектов в корневой среде взаимодействий от всех других эффектов, мы не можем игнорировать химических соединений в этих взаимодействиях. Некоторые микроорганизмы не могут выжить или функционировать на поверхности без добавления соединений, в частности питательных веществ. Следующим шагом в развитии этой платформы будет контролируемое добавление химических соединений для изучения их воздействия на различные взаимодействия в сочетании со структурой.
Этот метод был разработан как первый шаг в развитии синтетической платформы для изучения корневых взаимодействий микроорганизмов. Здесь мы имитируем микроструктуру поверхности корня, и эта начальная платформа может быть использована для изучения влияния поверхностной микроструктуры на поведение микроорганизмов. Тем не менее, эта платформа ограничена, так как ей не хватает многих других элементов из естественной системы. Эта платформа должна быть дополнительно разработана с использованием правильных материалов для генерации поверхности и с добавлением других, критических, химических веществ в систему. На более продвинутой платформе мы также можем представить пространственное распределение химических веществ. Однако, поскольку в настоящее время нет другого метода, чтобы изолировать структурные эффекты в корневых микроорганизмов взаимодействий, мы надеемся, что исследователи могли бы использовать эту начальную платформу, чтобы задать структуры конкретных вопросов в этих взаимодействиях.
The authors have nothing to disclose.
Исследование было поддержано семенными фондами от Организации Сельскохозяйственных исследований до МК.
2-hydroxy-2-methylpropiophenone | Sigma | 405655 | |
Diethyl phthalate | Across | 114520010 | |
Diurethane dimetharylate | Sigma | 436909 | |
Ethyl cellulose | Across | 232705000 | |
Ethyl methacrylate | Sigma | 234893 | |
Shaphir Solution | GAT fertilizer | 6-2-4 | |
Sylgard 184 kit | Polymer-G | 510018400500 |