Summary
Этот протокол является эффективным, экономически эффективным и надежным методом изоляции первичной микроглии от живой, взрослой, человеческой ткани мозга. Изолированная первичная микроглия человека может служить инструментом для изучения клеточных процессов при гомеостазе и болезнях.
Abstract
Микроглии являются резидентами врожденных иммунных клеток центральной нервной системы (ЦНС). Микроглии играют важную роль во время развития, в поддержании гомеостаза, а также во время инфекции или травмы. Несколько независимых исследовательских групп подчеркнули центральную роль, которую микроглии играют в аутоиммунных заболеваниях, аутовоспалительных синдромах и раковых заболеваниях. Активация микроглии при некоторых неврологических заболеваниях может непосредственно участвовать в патогенных процессах. Первичная микроглия является мощным инструментом для понимания иммунных реакций в головном мозге, клеточных клеточных взаимодействий и дисрегулируемых фенотипов микроглии при болезни. Первичная микроглия имитирует микроглиальные свойства vivo лучше, чем увековеченные линии микроглиальных клеток. Человеческая взрослая микроглия обладают различными свойствами по сравнению с человеческими микроглией плода и грызунов. Этот протокол обеспечивает эффективный метод изоляции первичной микроглии от взрослого человеческого мозга. Изучение этих микроглии может обеспечить критическое понимание клеточного взаимодействия между микроглией и другими резидентами клеток в ЦНС, включая олигодендроциты, нейроны и астроциты. Кроме того, микроглии из разных человеческих мозгов могут быть культуры для характеристики уникальных иммунных реакций для персонализированной медицины и множество терапевтических приложений.
Introduction
Центральная нервная система (ЦНС) построена из сложной сети нейронов и глиальных клеток1. Среди глиальных клеток, микроглии функции врожденных иммунных клеток ЦНС2,3. Microglia отвечают за поддержание гомеостаза в здоровом ЦНС4. Microglia также играют важную роль в нейроразвитии, путем обрезки синапсов2. Микроглии занимают центральное место в патофизиологии нескольких неврологических заболеваний, включая, но не ограничиваясь; Болезнь Альцгеймера5, болезнь Паркинсона6, инсульт7, рассеянный склероз8, черепно-мозговая травма9, невропатические боли10, повреждение спинного мозга11 и опухоли головного мозга, такие как глиомы12.
Исследования, связанные с ГОМеостазом ЦНС и заболеваний использовать грызунов микроглии из-за нехватки экономически эффективным и время эффективного человека первичной микроглии изоляции протоколов13. Грызун микроглии напоминают первичной микроглии человека в экспрессии генов, таких как Iba-1, PU.1, DAP12 и M-CSF рецепторов и были эффективными в понимании нормального, а также больной мозг13. Интересно, что экспрессия нескольких ген, связанных с иммунитетом, таких как TLR4, MHC II, Siglec-11 и Siglec-3 варьируется между человеком и грызунами микроглии13. Выражение нескольких генов также варьируется в височной экспрессии и в нейродегенеративных заболеваний у обоих видов14,15. Эти значительные различия делают микроглию человека важной моделью для изучения функции микроглии при гомеостазе и болезни. Первичная человеческая микроглия также может быть эффективным инструментом для доклинического скрининга потенциальных кандидатов наркотиков16. Вышеупомянутые причины подчеркивают растущую потребность в экономически эффективных протоколах для изоляции первичной микроглии человека.
Мы разработали протокол изоляции первичной микроглии человека от тканей мозга взрослого человека, собранного в результате хирургического окна, созданного для резекции опухоли или других хирургических резекций. Метод здесь значительно отличается от существующих методов. Мы смогли изолировать и культуры микроглии после транзита время около 75 минут от места сбора тканей, чтобы начать изоляционный протокол в лаборатории. Мы использовали супернатант клеток фибробластов L929 для содействия росту изолированной микроглии. Этот метод конкретно фокусируется на культуре и развитии только первичной микроглии. Подготовленная в результате культура составляет около 80% микроглии. В то время как другие протоколы обеспечивают обогащенную культуру микроглии по плотности градиента центрифугации, потока цитометрии и магнитных бусин, протокол является быстрым, простым, надежным и экономически эффективным способом культуры первичной человеческой микроглии17,18,19,20. Способность использовать хирургически удалены живой ткани мозга взрослого вместо фиксированных тканей мозга из трупов доказывает дополнительное преимущество этого метода в отличие от существующих процедур18,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все ткани были приобретены после этического разрешения от комитетов по этике института Индийского технологического института Джодхпура и Всеиндийского института медицинских наук (AIIMS) Джодхпура.
1.Tissue приобретения и обработки (День 0)
- Соберите ткань в трубке 50 мл, содержащей 10 мл ледяной искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) (2 mM CaCl22H2O, 10 мМ глюкозы, 3 мМ ККл, 26 мМ NaHCO3, 2,5 мМ НГ2PO4, 1 мМ МгCl26H2O, 202 мМ сахароза)20. Убедитесь, что трубка хранится на льду, если ткань должна быть перенесена в другое место.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка aCSF в автоклаведированной дистиллированной воде. Фильтр его с 0,22 мкм шприц фильтр в ламинар капюшон. Это может храниться в течение 1 месяца при 4 градусов по Цельсию. - Протрите трубку сбора тщательно с 70% алкоголя и передачи в асептической ламинар воздуха потока камеры.
- Откажитесь от aCSF тщательно и взвесить ткани в асептическом состоянии. Вес тканей необходим для расчета объема трипсина-ЭДТА, необходимого для последующих шагов.
- Держите ткань в свежем теплом aCSF при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут. Этот шаг имеет решающее значение, чтобы избежать гибели клеток.
- Откажитесь от aCSF и мыть ткань один раз с 1x PBS (фосфат буферизированный солевой раствор) при 37 градусов по Цельсию. Убедитесь, что вся кровь смывается с повторными PBS моет (по мере необходимости).
- Инкубировать ткань в теплом PBS, при 37 градусов по Цельсию, в течение 5 мин.
- Откажитесь от PBS тщательно и передать ткани стерилизованной чашки Петри. PBS может быть удален с помощью пипетки. Это предотвратит любую потерю ткани.
- Нарезать ткань мелкими (не менее 1 мм3)кусочками с помощью стерильного скальпеля. Мелко нарезанная ткань обеспечивает более высокую площадь поверхности тканей для диссоциации тканей trypsin-EDTA, обеспечивая более высокую урожайность.
- Перенесите нарезанную кубиками ткань в трубку 50 мл, содержащую 10 мл/г ткани 0,25% трипсина-ЭДТА и смешайте с помощью пипетки через серологическую пипетку размером 10 мл. Добавьте 2 мл трипсина/ЭДТА в блюдо Петри и тщательно промойте тарелку с помощью пипетки. Добавьте этот трипсин обратно в сокольничую трубку. Это сводит к минимуму потерю тканей и клеток во время dicing.
- Инкубировать трубку на шейкере в течение 30 минут при 37 градусах при 250 об/мин. Этот шаг увеличивает диссоциацию клеток от тканей.
- В конце инкубации, добавить 10 мЛ нейтрализующей среды (50% DMEM/50% F12 с глутамином, 1% пенициллин-стрептомицин, 10% FBS) для нейтрализации трипсина. Смешайте с серологическим пипеткой 10 мЛ. Количество добавленных нейтрализующих носителей должно быть равно количеству использованных трипсин.
- Центрифуга трубки на 2000 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
- Откажитесь от супернатанта и повторно приостановить гранулы в 1 мЛ культуры среды (50% DMEM/50% F12 с глутамином, 1% пенициллин-стрептомицин, 20% L929 супернатант, 10% FBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: L929 клетки культуры в DMEM (DMEM с глутамином, 1% пенициллин-стрептомицин, 10% FBS). ATCC рекомендуемый метод культуры следует следовать для клеточной культуры. Супернатант должен быть собран из культуры колбы, которая, по крайней мере 75% слияния. Он может быть собран оптом и храниться при -80 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить деградацию факторов роста. Рекомендуется добавлять супернатант L929 отдельно в фляги вместо добавления в среду фондовой культуры. - Плита клетки в Т-25 колбу, подходит для адепта клетки, и добавить 4 мл дополнительной среде культуры. Инкубировать колбу при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2. Тщательно встряхните колбу, чтобы однородно разогнать ткань. Избегайте привлечения средств массовой информации к шее колбы, в то время как тряска, так как это может увеличить шансы загрязнения.
2.Культура клетки (День 2)
- Собирайте средства массовой информации из Фляги культуры Т-25, подготовленной в день 0 в трех 1,5-мла центрифугах, собирая равный объем носителей в каждой трубе. Вымойте колбу один раз с 1 х PBS. Встряхните колбу осторожно, чтобы удалить все остатки фрагментов ткани слева. Избегайте резкого встряхивания колбы, так как любые фрагменты остатков не повлияют на культуру. Добавьте 5 мл свежих средств массовой информации культуры в колбу.
- Центрифуга собранных носителей при 1466 х г (4000 об/мин) при 4 градусах Цельсия в течение 4 минут.
- Отбросьте супернатант из каждой трубки и добавьте 1 мл культурной среды к одной из трубок. Тщательно перемешать с пипеткой. Серийно добавляйте смешанные носители с клетками в другие трубки. Тщательно перемешать с пипеткой и объединить клетки в одной трубке.
- Плита клетки в отдельной колбе Т-25, подходит для адепта клеток. Добавьте 4 мл культурной среды и инкубировать колбу при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.
3.Культура клетки (День 4)
- Отбросьте средства массовой информации из обеих колб и добавьте в колбу свежие 5 мЛ культурных носителей.
- Инкубировать колбу при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 в течение 2 дней.
4. Культура клеток (День 6)
- Клетки будут готовы к дальнейшим экспериментам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя вышеупомянутый протокол(Рисунок 1),мы смогли изолировать первичную микроглию человека от живых хирургически резекированных тканей мозга. Культурные клетки были окрашены Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) лектин для микроглии (зеленый) и с Глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) для астроцитов (красный)(Рисунок 2), как описано ранее22,23,24,25,26. Для окрашивания ядер (синих) использовался 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). На шестой день с начала эксперимента клетки были готовы к дальнейшим экспериментам. Запятнанные клетки считались слепыми для микроглии и астроцитов, присутствующих в культуре. Около 80% первичной культуры были микроглии(Рисунок 2).
Рисунок 1: Схема первичной изоляции микроглии от взрослого мозга. Хирургически удаленная ткань была собрана в ледяной 10 мл aCSF в трубке 50 мл и передана в лабораторию. Ткань промывали aCSF и PBS соответственно и мелко намазали кубиками, размягчивали с помощью трипсина-ЭДТА и поминовали в колбе Т-25. На второй день средства массовой информации были собраны и центрифугированные. Пелле смешивали в свежих носителях и покрыли в колбе Т-25. Свежие носители были добавлены в первую колбу. Средства массовой информации были изменены в обеих колбах в альтернативные дни. Клетки были готовы к дальнейшим экспериментам на 6-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Иммуноцитохимия изолированных первичных микроглии человека. ()Изолированные клетки были покрыты в два хорошо камеры слайд и были окрашены GFAP для астроцитов (Зеленый-первая панель) или RCA для микроглии (Зеленая-вторая панель). Ядра были окрашены в синий цвет DAPI. Контроль для RCA и вторичного контроля антител для GFAP показан в вставке. (B) Изолированные клетки были покрыты в двух хорошо камеры слайд и были окрашены RCA для микроглии (зеленый) и GFAP для астроцитов (красный). Второй ряд показывает контроль для RCA и вторичного контроля антител для GFAP. Ядра были окрашены в синий цвет DAPI. (C) Клетки были подсчитаны слепым контролем. Количественная оценка является репрезентативной для подсчета одним слепым элементом управления. Около 80% клеток были микроглии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микроглии обеспечивают гомеостаз в нормальном мозге и играют центральную роль в патофизиологии различных неврологических заболеваний4. Микроглии имеют центральное значение для нейроразвития и формирования синапсов2. Микроглиальные исследования оказались ключевыми в понимании развития и прогрессирования различных неврологических заболеваний4. Грызун микроглии являются распространенной моделью выбора для первичных микроглиальных исследований, хотя, грызунов микроглии отличаются от первичной микроглии человека в ключевых аспектах13. Разработка экономически эффективных, высокодоходных протоколов изоляции первичной микроглии человека может помочь преодолеть этот разрыв. Мы разработали протокол изоляции первичной микроглии человека от живой, хирургически резектной, взрослой, человеческой ткани мозга. Мы смогли достичь микроглиальной чистоты около 80%, как проверили на7-й день.
Одним из наиболее важных этапов протокола была транспортировка приобретенных тканей в лабораторию для переработки. Поскольку время транзита составляло около 75 минут, было вероятно, что мы не сможем изолировать какие-либо клетки. Мы справились с этим, используя 50 мЛ трубки только с 10 мл aCSF. aCSF предоставил необходимые питательные вещества, а оставшееся пространство в трубке помогло аэрировать aCSF и ткани. Существует вероятность того, что в период транзита произошла значительная гибель нейронов и других клеток. Хотя это помогает с изоляцией микроглии, этот протокол не может быть эффективным для изоляции других неврологических клеток. Нам удалось изолировать микроглиальные клетки из 268 мг расчлененной ткани. Мы также смогли достичь значительной чистоты микроглии, избегая также покрытия колбы поли-D-лизин. Хотя это, возможно, привело к некоторой потере микроглии, это также избегало других популяций от прилипа к колбе. Кроме того, это позволило избежать дополнительного шага встряхивания колбы и сбора микроглии. Вполне возможно, что некоторые клетки, возможно, не придерживались в колбе, подготовленной в день 0. Мы собрали клетки, не придерживающиеся первоначальной культуры и покрыли его снова в другой колбе на второй день, который также дал клетки микроглии. Следует отметить, что мелко dicing ткани имеет важное значение, как это увеличит поверхность площади ткани. Это позволит trypsin получить доступ к большей части ткани и отмежевать больше клеток.
Для содействия росту микроглии в культуре, мы обусловили культуры среды с супернатантом L929 клеток27,28. Это обеспечивает богатый источник Гранулоцит-макрофагов колонии стимулирующий фактор (GM-CSF) в качестве дополнения, которое усиливает распространение макрофагов27,,29. Это помогло снизить стоимость дополнительных дорогостоящих добавок роста, которые являются основой нескольких микроглиальных протоколов первичной изоляции. Добавление супернатанта L929 имеет решающее значение для эффективной изоляции и роста микроглии в протоколе. Однако для лабораторий без культуры Клеток L929, это становится ограничивающим шагом, учитывая общую стоимость протокола, поскольку потребуются дополнительные добавки роста. Мы смогли получить микроглиальной популяции около 80% в условиях культуры. Это меньше, чем некоторые опубликованные протоколы, но это может быть преодолено путем дополнительного раунда изоляции через конкретные протоколы, такие как использование магнитных бусин для конкретных микроглиальных маркеров. При 80% чистоте культуры, протокол эффективен для многих экспериментов, таких как иммуноцитохимия. Однако для таких экспериментов, как очищение белка, идентификация белка и западное пятно, может потребоваться дополнительное очищение культуры. Даже при высокой чистоте первичных культур, всегда есть возможность того, что другие клетки, присутствующие в культуре может увеличиться с более длительной продолжительностью культуры. Мы успешно культивируем изолированные микроглии в течение 9 дней, пропуская их один раз. В то время как культурные условия в протоколе благоприятствуют изоляции и росту микроглии, присутствие других клеток следует учитывать при сохранении культуры в течение более длительного времени.
Этот протокол для изоляции первичной микроглии является эффективным, надежным и экономически эффективным. Такие протоколы по изоляции первичной микроглии человека от ткани мозга взрослого человека позволят своевременно исследовать иммунные функции, физиологию клеток и реакции на заболевания у взрослого мозга. Кроме того, пациент производных первичной микроглии может помочь в разработке персонализированных, будущих терапевтических средств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Лаборатория SJ была создана на институциональных грантах от IITJ и финансируется за счет грантов Департамента биотехнологии (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) и Министерства электроники и информационных технологий Правительства Индии (No 4 (16)/2019-ITEA). Участки ткани мозга человека были получены из Всеиндийского института медицинских наук (AIIMS) Jodhpur после институционального разрешения комитета по этике. Мы благодарим Майанк Ратор, B.Tech Студент член дизайна и искусства общества IIT Jodhpur, за поддержку видеосъемки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
