Neuroscience

从成人人类脑组织获取人类微胶质

Published: August 30, 2020 doi: 10.3791/61438

Ishan Agrawal¹, Shivanjali Saxena¹, Preethika Nair¹, Deepak Jha², Sushmita Jha¹

¹Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology Jodhpur, ²Department of Neurosurgery, All India Institute of Medical Sciences Jodhpur

Summary

该协议是一种高效、经济、稳健的方法，将原发性微胶质与活的、成人的、人类脑组织隔离在一起。分离的原人类微胶质可以作为研究平衡和疾病细胞过程的工具。

Abstract

微胶质是中枢神经系统（CNS）的生俱来的免疫细胞。微胶质在开发、维持平衡以及感染或损伤期间发挥着关键作用。几个独立的研究小组强调了微胶质在自身免疫性疾病、自身炎综合症和癌症中的核心作用。微胶质在一些神经系统疾病中的激活可能直接参与致病过程。原发性微胶质是了解大脑中免疫反应、细胞-细胞相互作用和疾病中调节不良的微胶质表型的有力工具。原发微胶质比不朽的微胶质细胞系更好地模仿体内微胶质特性。与人类胎儿和啮齿动物微胶质相比，人类成年微胶质表现出不同的特性。该协议为从成人人脑分离原发性微胶质提供了一种有效的方法。研究这些微胶质可以提供关键见解，在中枢机核素的微胶质细胞和其他居民细胞群体之间的细胞-细胞相互作用，包括，寡头细胞，神经元和星细胞。此外，来自不同人类大脑的微胶质可以培养，用于个性化医学和无数治疗应用的独特免疫反应的特征。

Introduction

中枢神经系统（CNS）由神经元和胶质细胞1的复杂网络^组成。在胶质细胞中，微胶质作为^{CNS2，3的先天}^免疫^细胞。微胶质负责维持健康CNS^{4中的平衡。}微胶质在神经发育中也扮演着重要的角色，通过修剪突触^2。微胶质是几种神经系统疾病病理生理学的核心，包括但不限于;阿尔茨海^默病5，帕金森病^6，^{中风7，多}发性硬化^症8，创伤性脑损伤^9，神经病变^疼痛10，脊髓损伤¹¹和脑肿瘤如胶质^瘤12。

与中枢系统平衡和疾病相关的研究利用啮齿动物微胶质，由于缺乏成本效益和时间效率的人类原发性微胶质分离协议^13。在伊巴-1、PU.1、DAP12和M-CSF受体等基因的表达中，罗登特微胶质与原人类微胶质相似，在理解正常和患病的大脑^{13方面是有效的}。有趣的是，几个免疫相关基因，如TLR4，MHC II，西格尔克-11和西格尔克-3的表达在人类和啮齿动物微胶^{质13之间不同}。几个基因的表达在时间表达和神经退行性疾病中也各不相同，在这两个物种^14，15。¹⁴^,这些显著差异使人类微胶质成为研究平衡和疾病中微胶质功能的重要模型。原发性人类微胶质也可以是一个有效的工具，用于临床前筛选潜在的药物候选^者16。上述原因突出表明，越来越需要对分离原人类微胶质的具有成本效益的协议。

我们开发了一种从成人人类脑组织中分离原发性人类微胶质的方案，该机制是为肿瘤切除或其他手术切除而创建的手术窗口。此处的方法与现有方法大不相同。我们能够在从组织采集场开始分离协议后，在从组织采集场大约75分钟的传输时间分离和培养微胶质。我们利用L929成纤维细胞的上一体来促进分离微胶质的生长。该方法特别侧重于仅初级微胶质的培养和发展。由此产生的培养是大约80%的微胶质。虽然其他协议通过密度梯度离心、流式细胞学和磁珠提供丰富的微胶质文化，但该协议是培养^,初级人类微胶质^,17、18、19、20的快速、¹⁷^,¹⁸简单、健壮且具有^{成本效益的方法}。¹⁹能够利用手术切除活的成人脑组织，而不是固定脑组织从尸体证明这种方法的附加优势，相比之下，现有的程序18，21。¹⁸^,²¹

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Protocol

所有组织都是在印度理工学院乔德普尔和全印度医学研究所（AIIMS）乔德普尔的伦理委员会进行伦理批准后获得的。

1.组织采集和加工（第 0 天）

收集含有 10 mL 冰冷人工脑脊液（aCSF）的 50 mL 管中的组织（2 mM CaCl₂+2H₂O， 10 mM 葡萄糖， 3 mM KCl， 26 mM NaHCO_3，2.5 mM NaH₂PO_4，1 mM MgCl₂+ 6H₂O， 202 mM 蔗糖）²⁰.如果需要将组织转移到其他位置，请确保将管子放在冰上。
注：在自动处理蒸馏水中准备一个CSF。用层罩中 0.22 μm 注射器过滤器进行过滤。这可以在4°C下储存1个月。
用 70% 的酒精小心擦拭收集管，然后转移到无菌层气流室。
小心丢弃 aCSF，在无菌条件下称重组织。组织重量对于计算后续步骤所需的尝试素-EDTA 体积至关重要。
将组织在37°C下保持新鲜温暖的ACSF5分钟。此步骤对于避免细胞死亡至关重要。
在 37 °C 下丢弃 aCSF，用 1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤组织一次。确保所有血液都经过反复的 PBS 洗涤（根据需要）洗去。
在37°C的暖PBS中孵育组织5分钟。
小心丢弃 PBS，将组织转移到消毒的培养皿中。PBS 可使用移液器去除。这将防止任何组织损失。
使用无菌手术刀将组织切成小块（至少1毫米^3）。细切组织通过 trypsin-EDTA 确保更高的产量，为组织分离提供更高的组织表面积。
将切碎的组织转移到含有 0.25% trypsin-EDTA 10 mL/g 组织的 50 mL 管中，并通过 10 mL 血清移液器移液混合。将 2 mL 的 trypsin/EDTA 添加到培养皿中，并在移液器的帮助下彻底清洗盘子。将此 trypsin 重新添加到猎鹰管中。这最大限度地减少了组织和细胞在切块时的损失。
在 250 rpm 的 37 °C 下，在摇床上孵育管 30 分钟。此步骤增加了细胞与组织的分离。
在孵育结束时，加入10 mL的中和介质（50%DMEM/50%F12与谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素，10%FBS）中和尝试蛋白。与 10 mL 血清移液器混合。添加的中和介质量应等于使用的 trypsin 量。
在 4 °C 下以 2，000 x g 离心管 10 分钟。
丢弃上一甲酸酯，在培养基的1 mL中重新悬浮颗粒（50%DMEM/50%F12与谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素，20%L929上上液，10%FBS）。
注：L929细胞在DMEM中培养（谷氨酰胺DMEM，1%青霉素链霉素，10%FBS）。对于细胞培养，应采用 ATCC 推荐的培养方法。必须从至少 75% 的汇合的培养瓶中收集上流水剂。它可以批量收集，并储存在-80°C，以防止生长因子的退化。建议在烧瓶中单独添加 L929 上大液，而不是添加到库存培养介质中。
将细胞板在T-25烧瓶中，适合粘附细胞，并添加4 mL的额外培养培养。在37°C下用5%CO₂孵育烧瓶。小心地摇动烧瓶，以均匀地分散组织。避免在摇动时将介质带到烧瓶的颈部，因为这样可能会增加污染的机会。

2.细胞培养（第2天）

通过收集每个管中等量的介质，从第 0 天准备的 T-25 培养瓶中收集介质，在三个 1.5 mL 离心管中收集介质。用 1 x PBS 清洗烧瓶一次。轻轻摇动烧瓶，清除任何残存的组织碎片。避免烧瓶剧烈摇晃，因为任何残块不会对文化产生负面影响。将 5 mL 新鲜文化介质添加到烧瓶中。
在 4 °C 下以 1，466 x g （4000 rpm）将收集的介质离心 4 分钟。
丢弃每个管中的上流水液，并将 1 mL 培养介质添加到其中一根管中。与移液器彻底混合。串行将带细胞的混合介质添加到其他管中。与移液器彻底混合，将细胞混合在一个管中。
将细胞板在单独的T-25烧瓶中，适合粘附细胞。加入4 mL的培养基，在37°C下用5%CO_{2孵育烧瓶}。

3.细胞培养（第4天）

丢弃两个烧瓶的介质，并在烧瓶中加入新鲜的 5 mL 文化介质。
在37°C下用5%CO2孵育_烧瓶2天。

4. 细胞培养（第6天）

细胞将准备好进行进一步的实验。

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Representative Results

通过使用上述协议（图1），我们能够将原人类微胶质从活的手术切除的脑组织中分离。培养细胞被染色的利西努斯共融质蛋白-1（RCA-1）乳胶微胶质（绿色）和胶质纤维酸蛋白（GFAP）为星形细胞（红色）（图2），如前面描述^的22，23，24，25，26。^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶4°，6-二米迪诺-2-苯酚多勒（DAPI）用于染色核（蓝色）。在实验开始的第六天，细胞已经做好了进一步实验的准备。染色细胞被计算为盲微胶质和星细胞存在于培养中。大约80%的主要培养是微胶质（图2）。

图1：从成人大脑分离原发微胶质图。 手术切除的组织被收集在50 mL管中的冰冷10mL的ACSF中，并转移到实验室。组织分别用ACSF和PBS清洗，并切碎，与三辛-EDTA的帮助分离，并镀在T-25烧瓶中。第二天，媒体被收集并离心。丸子混合在新鲜介质中，镀在T-25烧瓶中。新的介质被添加到第一个烧瓶。在交替的天数中，两个烧瓶中的介质都发生了变化。细胞已准备好在6日进行进一步实验。请单击此处查看此图的较大版本。

图2：分离原人类 微胶质的免疫细胞化学.（A）分离细胞镀在两井室幻灯片中，并染色为星形细胞的GFAP（绿色第一面板）或RCA微胶质（绿色二面板）。核被染成蓝色与 DAPI 。RCA 和 GFAP 的二级抗体对照显示在内嵌中。（B）分离的细胞被镀在两井室的幻灯片中，并染色为 RCA 的微胶质（绿色）和用于星形细胞的 GFAP（红色）。第二行显示 RCA 的对照和 GFAP 的二级抗体控制。核被染成蓝色与 DAPI 。（C）细胞由盲控计数。定量代表一个盲目的控制计数。大约80%的细胞是微胶质。请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

Microglia确保正常大脑中的平衡，并在各种神经系统疾病的病理生理学中发挥核心^作用。微胶质是神经发育和突触2^{形成的核心}。微胶质研究已证明对了解各种神经系统疾病的发展和发展至关重要^。啮齿动物微胶质是初级微胶质研究的首选模式，尽管在关键方面，啮齿动物微胶质与原人类微胶质^不同。开发具有成本效益、高产、用于隔离原人类微胶质的协议可能有助于弥合这一差距。我们已经开发了一种方案，将原发性人类微胶质从活的、手术切除的成人、人类脑组织中分离出来。我们能够达到约80%的微胶纯度，经7^日检查。

该协议最关键的步骤之一是将获得的组织运至实验室进行加工。由于传输时间约为75分钟，我们很可能无法分离任何细胞。我们使用只有 10 mL 的 aCSF 的 50 mL 管来管理这一点。aCSF 提供所需的营养物质，管内的剩余空间有助于呼吸 aCSF 和组织。在过渡期间，神经元和其他细胞有相当的死亡。虽然这有助于微胶质的分离，但该协议可能对于分离其他神经细胞不有效。我们能够从268毫克的解剖组织中分离出微胶质细胞。我们还通过避免聚D-lysine的烧瓶涂层，实现了微胶的显著纯度。虽然这可能导致微胶质的一些损失，这也避免了其他胶质种群粘附在烧瓶上。此外，这避免了摇烧瓶和收集微胶质的额外步骤。有可能有些细胞没有粘附在第 0 天准备的烧瓶中。我们从初始培养中收集了非粘附细胞，并在第2天再次在另一瓶瓶中镀上，这也产生了微胶质细胞。应该注意的是，精细切分组织是重要的，因为它会增加组织的表面面积。这将允许三平素访问大部分组织和分离更多的细胞。

为了促进培养中微胶质的生长，我们用L929细胞^27、28的上能^调节^培养媒介。这为粒细胞-巨噬细胞群刺激因子（GM-CSF）提供了丰富的来源作为补充，从而增强巨噬细胞增殖^27，29。²⁷^,这有助于降低作为几个微胶质初级隔离协议支柱的额外昂贵生长补充剂的成本。添加 L929 上大液对于协议中微胶的高效隔离和生长至关重要。然而，对于没有L929细胞培养的实验室来说，考虑到协议的总体成本，这成为一个限制步骤，因为需要额外的生长补充剂。我们能够在文化条件下获得约80%的微胶质人口。这一点比一些已发布的协议要少，但是可以通过特定协议（如使用磁珠作为特定的微胶质标记）进行额外的隔离来克服这一点。在约80%的培养纯度下，该协议对于许多实验（如免疫细胞化学）是有效的。然而，对于蛋白质纯化、蛋白质识别和西印等实验，可能需要对培养物进行额外的纯化。即使初级培养物纯度高，也始终有可能随着培养时间越长而增加培养中的其他细胞。我们已经成功地培养孤立的微胶质9天，通过他们一次。虽然协议中的培养条件有利于微胶质的分离和生长，但当长期保持培养时，应考虑其他细胞的存在。

该隔离初级微胶质的协议有效、可靠且具有成本效益。这种将原发性人类微胶质从成人脑组织中分离出的协议将有助于及时研究成人大脑中的免疫功能、细胞生理学和疾病反应。此外，患者衍生的原发性微胶质胶可能有助于开发个性化的未来治疗。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

SJ的实验室由国际工业技术委员会提供机构赠款，由生物技术部（BT/PR12831/MED/30/1489/2015）和印度电子和信息技术部（第4号（16）/2019-ITEA）提供资助。人体脑组织部分是在机构伦理委员会批准后从全印度医学研究所（AIIMS）Jodhpur获得的。我们感谢设计与艺术协会 IIT Jodhpur 的 B.Tech 学生成员 Mayank Rathor 提供摄像支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic solution	Himedia	A002
Calcium chloride	Sigma	223506
Centrifuge (4 °C)	Sigma	146532
Centrifuge tubes	Abdos	P10203
CO₂ incubator	New Brunswik	Galaxy 170 S
D-Glucose	Himedia	GRM077
DMEM medium with glutamine	Himedia	AL007S
Fetal bovine serum	Himedia	RM9955
Flacon tube (50 ml)	Thermo Fsiher Scientific	50CD1058
Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1	Vector	FL-1081
Fluorescent microscope	Leica	DM2000LED
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
GFAP antibody	GA5	3670S
Incubator shaker	New Brunswik Scientific	Innova 42
L929 cell line	ATCC	NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1)
Laminar air flow	Thermo Fsiher Scientific	1386
Magnesium chloride	Himedia	MB040
Monosodium phosphate	Merck	567545
Nutrient Mixture F-12 Ham Medium	Himedia	Al106S
Petri dish	Duran Group	237554805
Phosphate buffered saline	Himedia	ML023
Potassium chloride	Himedia	MB043
Serological pipette	Labware	LW-SP1010
Sodium bicarbonate	Himedia	MB045
Sucrose	Himedia	MB025
Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter)	Axiva	SFPV25R
T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture.	Himedia	TCG4-20X10NO
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056