Summary
이 프로토콜은 살아있는, 성인, 인간의 뇌 조직에서 기본 microglia를 격리하는 효율적이고 비용 효율적이며 강력한 방법입니다. 고립 된 1 차적인 인간 microglia는 항상성 및 질병에 있는 세포 프로세스를 공부하기 위한 공구역할을 할 수 있습니다.
Abstract
Microglia는 중추 신경계 (CNS)의 거주자 타고난 면역 세포입니다. Microglia는 개발 중, 항상성을 유지 하며 감염 또는 부상 중에 중요한 역할을 합니다. 몇몇 독립적인 연구 단은 microglia가 자기 면역 질병, 자가 염증성 증후군 및 암에서 재생하는 중앙 역할을 강조했습니다. 몇몇 신경학상 질병에 있는 microglia의 활성화는 병원성 프로세스에 직접 참여할 수 있습니다. 1 차적인 microglia는 두뇌에 있는 면역 반응을 이해하는 강력한 공구입니다, 세포 세포 상호 작용 및 질병에 있는 dysregulated microglia 표현형. 1 차적인 microglia는 불멸한 microglial 세포주 보다는 더 나은 생체 내 microglial 속성에서 모방합니다. 인간 성인 microglia 인간의 태아와 설치류 microglia에 비해 뚜렷한 속성을 전시. 이 프로토콜은 성인 인간의 뇌에서 기본 마이크로 글리아의 격리를위한 효율적인 방법을 제공합니다. 이러한 microglia를 연구 하는 microglia와 CNS에 있는 다른 상주 세포 인구 사이 세포 세포 상호 작용에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다., oligodendrocytes, 뉴런 및 성상 세포. 또한, 다른 인간의 두뇌에서 microglia 개인화 된 약및 치료 응용 프로그램의 무수한에 대 한 독특한 면역 반응의 특성화를 위해 배양 될 수 있습니다.
Introduction
중추 신경계(CNS)는 뉴런 과 신경교 세포1의복잡한 네트워크로 구성된다. 신경교 세포 중, 마이크로글리아는 CNS2,,3의타고난 면역 세포로서 기능한다. Microglia는 건강한 CNS4에서항상성을 유지하는 데 책임이 있습니다. Microglia는 또한 시냅스2를가지치기하여 신경 발달에 중요한 역할을합니다. Microglia는 여러 신경 질환의 병리생리학의 중심이지만 제한되지 는 않습니다. 알츠하이머병5,파킨슨병6,뇌졸중7,다발성 경화증8,외상성 뇌손상9,신경병성 통증10,척수 손상11, 진모(12) 등의 뇌종양이 있다.12
CNS 항상성 및 질병과 관련된 연구는 비용 효율적이고 시간 효율적인 인간 1 차 적인 microglia 격리 프로토콜13의땅때문에 설치류 microglia를 이용합니다. 설치류 마이크로글리아는 Iba-1, PU.1, DAP12 및 M-CSF 수용체와 같은 유전자의 발현에서 1차 인간 마이크로글리아를 유사하게 하며, 병든뇌(13)뿐만아니라 정상을 이해하는 데 효과적이었다. 흥미롭게도, TLR4, MHC II, 시글리크-11 및 시그렉-3과 같은 여러 면역 관련 유전자의 발현은 인간과 설치류마이크로글리아(13)사이에 다릅니다. 여러 유전자의 발현은 또한 두 종14,,15에서측현현 및 신경 퇴행성 질환에서 변화한다. 이러한 중요한 차이는 인간 microglia 항상성 및 질병에 있는 microglia 기능을 공부하는 필수적인 모형을 만듭니다. 1차 인간 마이크로글리아는 잠재적약물후보(16)의전임상 검진을 위한 효과적인 도구가 될 수 있다. 위에서 언급 한 이유는 기본 인간 microglia의 격리를위한 비용 효율적인 프로토콜에 대한 필요성을 강조한다.
우리는 종양 절제술 또는 그밖 외과 절제술을 위해 생성된 외과 창결과로 집합된 성인 인간 두뇌 조직에서 1 차적인 인간 microglia의 격리를 위한 프로토콜을 개발했습니다. 여기서 방법은 기존 방법과 상당히 다릅니다. 우리는 조직 수집 현장에서 실험실에서 격리 프로토콜을 시작하는 약 75 분의 전송 시간 후에 격리하고 배양 microglia를 할 수 있었습니다. 우리는 격리 된 microglia의 성장을 촉진하기 위해 L929 섬유 아세포 세포의 상체를 사용했습니다. 이 방법은 특히 1 차 microglia의 문화와 개발에 초점을 맞추고 있습니다. 준비된 결과 배양은 약 80% 마이크로글리아입니다. 다른 프로토콜은 밀도 그라데이션 원심 분리, 유동 세포측정 및 자기 구슬에 의해 미세글리아의 농축 된 배양을 제공하지만, 프로토콜은 1차,인간 microglia17,18,19,,20을배양하는 신속하고 간단하며 견고하며 비용 효율적인 방법입니다., 시체에서 고정 된 뇌 조직 대신 외과적으로 제거 된 살아있는 성인 뇌 조직을 활용하는 능력은 기존 절차(18,,21)와는 대조적으로이 방법의 추가 이점을 입증한다.
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Protocol
모든 조직은 인도 공과 대학 조드푸르와 모든 인도 의학 연구소 (AIIMS) Jodhpur의 연구소 윤리위원회에서 윤리적 허가 후 인수되었다.
1.조직 취득 및 처리(0일차)
- 얼음차가운 인공 뇌척수액(aCSF) 10mL(aCSF) (2mM CaCl2∙2H2O,10mM포도당, 3mM KCl, 26m MM NaHCO3,2.5mM NaHCO 3, 2.5mM NaHCO 3, 2.5mM MM MgCl2+6H42,202m)를 함유한50mL튜브에서 조직을 수집하십시오.2 조직을 다른 위치로 옮겨야 하는 경우 튜브를 얼음 위에 보관해야 합니다.
참고: 자동화된 증류수에서 aCSF를 준비합니다. 라미나르 후드에 0.22 μm 주사기 필터로 필터링합니다. 이것은 4 °C에서 1 개월 동안 저장할 수 있습니다. - 수집 튜브를 70% 알코올로 조심스럽게 닦고 무균 라미나르 공기 흐름 챔버로 옮겨보세요.
- aCSF를 신중하게 폐기하고 무균 상태에서 조직을 계량하십시오. 조직 무게는 후속 단계에 필요한 트립신-EDTA의 부피를 계산하는 데 필수적입니다.
- 조직을 37°C에서 5분간 신선한 따뜻한 aCSF로 유지합니다. 이 단계는 세포 사멸을 피하기 위해 중요합니다.
- aCSF를 버리고 37 °C에서 1 x PBS (인산염 완충식염)로 조직을 한 번 씻으십시오. 모든 혈액이 반복되는 PBS 세척(필요에 따라)으로 씻어내도록 하십시오.
- 37°C에서 5분 동안 따뜻한 PBS에서 조직을 배양합니다.
- PBS를 신중하게 폐기하고 조직을 멸균 된 페트리 접시로 옮기십시오. PBS는 파이펫으로 제거될 수 있다. 이것은 조직의 손실을 방지 할 수 있습니다.
- 멸균 메스를 사용하여 조직을 작은 (적어도 1mm3)조각으로 주사위. 잘게 썬 조직은 더 높은 수율을 보장하는 트립신-EDTA에 의한 조직 해리를 위한 더 높은 조직 표면적을 제공합니다.
- 다진 조직을 0.25% 트립신-EDTA의 10mL/g 조직을 포함하는 50mL 튜브로 옮기고 10mL 세로지피펫을 통해 파이펫을 섞는다. 페트리 접시에 트립신/EDTA 2mL을 넣고 파이펫의 도움으로 접시를 철저히 씻으십시오. 이 트립신을 다시 매 튜브에 추가합니다. 이것은 다이싱하는 동안 조직과 세포의 손실을 최소화합니다.
- 250 rpm에서 37 °C에서 30 분 동안 셰이커에 튜브를 배양하십시오. 이 단계는 조직에서 세포의 해리를 증가시킵니다.
- 인큐베이션의 끝에서, 중화 매체의 10 mL을 추가 (50% DMEM / 50% F12 글루타민, 1% 페니실린 연쇄 절제술, 10% FBS) 트립신을 중화. 10mL 세로지오피펫과 섞으세요. 추가된 중화 매체의 양은 사용된 트립신의 양과 같아야 합니다.
- 10 분 동안 4 °C에서 2,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
- 상체를 버리고 배양 배지 의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오 (글루타민50% DMEM/50% F12, 페니실린-연쇄 절제술 1%, 20% L929 상류제, 10% FBS).
참고: L929 세포는 DMEM에서 배양(글루타민을 가진 DMEM, 1% 페니실린 연쇄절제술, 10% FBS)입니다. ATCC 권장 배양 방법은 세포 배양을 위해 따라야 한다. 수퍼네티트는 적어도 75% 컨실업인 문화 플라스크에서 수집해야 합니다. 그것은 대량으로 수집 및 성장 인자의 저하를 방지하기 위해 -80 °C에 저장 할 수 있습니다. 주식 문화 배지에 추가하는 대신 플라스크에 L929 상체를 별도로 추가하는 것이 좋습니다. - T-25 플라스크에서 세포를 플레이트, 부착 세포에 적합, 추가 배양 배지의 4 mL을 추가. 플라스크를 37°C에서 5% CO2로배양한다. 플라스크를 조심스럽게 흔들어 균질적으로 조직을 분산시하십시오. 오염의 가능성을 증가시킬 수 있기 때문에, 흔들면서, 플라스크의 목에 미디어를 가져 오지 마십시오.
2.세포 배양(2일차)
- T-25 배양 플라스크에서 미디어를 수집하여 각 튜브에서 동일한 양의 미디어를 수집하여 3개의 1.5mL 원심분리기 튜브에서 0일에 제조됩니다. 플라스크를 1 x PBS로 한 번 씻으세요. 플라스크를 부드럽게 흔들어 남은 조직 조각을 제거합니다. 남은 조각이 문화에 부정적인 영향을 미치지 않기 때문에 플라스크의 가혹한 흔들림을 피하십시오. 플라스크에 5mL 의 신선한 문화 미디어를 추가합니다.
- 수집된 매체를 4°C에서 4°C에서 1,466xg(4000rpm)에서 4분간 원심분리합니다.
- 각 튜브에서 상체를 버리고 튜브 중 하나에 1 mL의 배양 매체를 추가합니다. 파이펫과 철저히 섞으세요. 연일 다른 튜브에 셀이 혼합 된 미디어를 추가합니다. 파이펫과 철저히 섞고 세포를 하나의 튜브에 풀로 두세요.
- 분리된 T-25 플라스크에서 세포를 플레이트, 부착 세포에 적합. 배양 배지 4mL를 추가하고 플라스크를 37°C에서 5% CO2로배양한다.
3.세포 배양(4일차)
- 플라스크에서 미디어를 폐기하고 플라스크에 새로운 5mL의 문화 매체를 추가합니다.
- 플라스크를 37°C에서 2일 동안 5%CO2로 배양한다.
4. 세포 배양 (6일차)
- 세포는 추가 실험을 위해 준비될 것입니다.
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Representative Results
위에서 언급한 프로토콜(도1)을사용하여, 우리는 1차 인간 마이크로글리아를 외과적으로 절제된 뇌 조직으로부터 분리할 수 있었다. 배양된 세포는 미세글리아(green)에 대한 리시누스 공동체 agglutin-1(RCA-1) 렉틴과 성상세포(red)(도 2)를 위해 염색하였다(도2)이전에 설명된 바와 같이22,,23,,24,,25,,26. 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI)은 핵(blue)을 염색하는 데 사용되었다. 실험 시작후 6일째에 세포는 추가 실험을 위한 준비가 되었다. 스테인드 세포는 배양에 존재하는 microglia 및 성상 세포에 대한 맹인으로 계산되었다. 1차 배양의 약 80%가 마이크로글리아(그림2)였다.
그림 1: 성인 뇌에서 1 차 적인 microglia 격리의 회로도. 외과적으로 제거된 조직은 50mL 튜브에서 aCSF의 얼음 감기 10mL에서 채취되어 실험실로 옮겨졌다. 조직은 aCSF와 PBS로 각각 세척되고 잘게 썬, 트립신-EDTA의 도움으로 해리되고 T-25 플라스크에서 도금되었다. 둘째 날, 언론은 수집되고 원심분리되었다. 펠렛은 신선한 미디어에 혼합되었고 T-25 플라스크에 도금되었습니다. 신선한 미디어가 첫 번째 플라스크에 추가되었습니다. 미디어는 대체 일에 두 플라스크에서 변경되었습니다. 세포는 6일째에 추가 실험을 위해 준비되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 분리된 1차 인간 microglia의 면역세포화학. (A)분리된 세포는 2개의 잘 챔버 슬라이드에서 도금되었고, 성상세포(Green-first panel) 또는 마이크로글리아(Green-second panel)에 대한 GFAP로 염색하였다. 핵은 DAPI와 파란색으로 염색되었다. GFAP에 대한 RCA 및 이차 항체 제어를 위한 제어는 인세트에 도시된다. (B)분리된 세포는 2개의 잘 챔버 슬라이드에서 도금되었고, 성상세포(red)에 대한 마이크로글리아(녹색) 및 GFAP에 대한 RCA로 염색하였다. 두 번째 행은 GFAP에 대한 RCA 및 이차 항체 제어에 대한 제어를 나타낸다. 핵은 DAPI와 파란색으로 염색되었다. (C)세포는 맹목적인 대조군에 의해 계산되었다. 정량화는 하나의 블라인드 컨트롤에 의해 계산을 대표한다. 세포의 대략 80%는 microglia이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Microglia는 정상적인 뇌의 항상성을 보장하고 다양한 신경 질환4의 병리4생리학에서 중심적인 역할을한다. Microglia는 신경 발달과 시냅스2의형성의 중심입니다. Microglial 연구는 다양한 신경질환4의발달과 진행을 이해하는 데 중추적 인 것으로 입증되었습니다. 설치류 microglia는 1 차적인 microglial 연구 결과를 위한 선택의 널리 퍼진 모형입니다, 비록, 설치류 microglia는 주요 양상에 있는 1 차적인 인간 microglia와 다릅니다13. 비용 효율적인, 높은 항복, 기본 인간 microglia의 격리를 위한 프로토콜의 개발이 격차를 해소하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 살아있는에서 1 차적인 인간 microglia의 격리를 위한 프로토콜을 개발했습니다, 외과적으로 절제된, 성인, 인간 적인 두뇌 조직. 우리는 7일에 확인된 대로 약 80 %의 미세 글리아엘 순도를 달성 할 수있었습니다.
프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 처리를 위한 실험실에 취득한 조직의 수송이었습니다. 환승 시간은 약 75분이었기 때문에 세포를 분리하지 못할 수도 있습니다. 우리는 aCSF의 단지 10 mL와 50 mL 튜브를 사용하여이를 관리. aCSF는 필요한 영양소를 제공했고 튜브에 남은 공간은 aCSF와 조직을 방출하는 데 도움이되었습니다. 환승 기간 동안 뉴런과 다른 세포의 상당한 죽음이 있었을 가능성이 있다. 이것은 microglia의 격리에 도움이 되는 동안, 이 프로토콜은 그밖 신경 세포의 격리를 위해 효율적이지 않을 수 있습니다. 우리는 해부 된 조직의 268 mg에서 마이크로 글리아세포를 분리 할 수 있었습니다. 우리는 또한 폴리 D-리신에 의한 플라스크의 코팅을 피함으로써 마이크로글리아의 상당한 순도를 달성 할 수있었습니다. 이것은 microglia의 일부 손실 귀착될 수 있습니다 하는 동안, 이것은 또한 플라스크에 준수에서 그밖 신경교 인구를 피했습니다. 또한, 이것은 플라스크를 흔들고 마이크로 글리아를 수집하는 여분의 단계를 피했다. 일부 세포가 0일째에 준비된 플라스크에 부착되지 않았을 수도 있었습니다. 우리는 초기 배양에서 비 부착 세포를 수집하고 또한 microglia 세포를 산출 2 일에 다른 플라스크에서 다시 도금. 조직을 미세하게 다이는 것이 조직의 표면을 증가시킬 것이기 때문에 중요하다는 점에 유의해야합니다. 이것은 트립신이 조직의 대부분에 접근하고 더 많은 세포를 해리하는 것을 허용할 것입니다.
배양에서 마이크로글리아의 성장을 촉진하기 위해, 우리는 L929 세포의 상퍼로 배양 배지를 조절하였다27,,28. 이것은 대식세포 증식을 향상시키는 보충으로 과립구 대식세포 식민지 자극 인자 (GM-CSF)의 풍부한 소스를제공하며,이는 대식세포 증식 을 향상시킵니다27,29. 이 여러 microglial 기본 격리 프로토콜의 주류 는 추가 비싼 성장 보충에 대 한 비용을 줄일 수 도움이. L929 상체를 추가하는 것은 프로토콜에서 microglia의 효율적인 격리 및 성장에 매우 중요합니다. 그러나 L929 세포 배양이 없는 실험실의 경우, 추가 성장 보충제가 필요하므로 프로토콜의 전반적인 비용을 고려한 제한 단계가 됩니다. 우리는 문화 조건에서 약 80 %의 미세 글리아를 얻을 수 있었습니다. 이것은 일부 게시된 프로토콜보다 작지만 특정 microglial 마커에 대한 자기 구슬을 사용하는 것과 같은 특정 프로토콜을 통해 추가적인 격리 라운드를 함으로써 이를 극복할 수 있습니다. 약 80%의 배양 순도에서, 프로토콜은 면역 세포화학같이 많은 실험에 능률적입니다. 그러나, 단백질 정제, 단백질 식별 및 서양 블로팅과 같은 실험을 위해서는 배양의 추가정화가 필요할 수 있다. 1 차 적인 문화의 높은 순도에도, 문화권에 존재하는 그밖 세포가 더 긴 배양 기간으로 증가할 수 있는 가능성은 항상 있습니다. 우리는 성공적으로 한 번 통과하여 9 일 동안 고립 된 microglia를 배양했습니다. 프로토콜의 배양 조건은 microglia의 격리 및 성장을 선호하지만, 다른 세포의 존재는 더 긴 기간 동안 배양을 유지할 때 고려해야한다.
기본 microglia를 격리하기 위한 이 프로토콜은 효과적이고 견고하며 비용 효율적입니다. 성인 뇌 조직에서 기본 인간의 microglia의 격리에 대 한 이러한 프로토콜 면역 기능에 적시 연구를 활성화 합니다., 세포 생리학 및 성인 두뇌에 질병 응답. 추가적으로, 환자 파생된 1 차적인 microglia는 개인화한, 미래 치료 개발에 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
SJ의 실험실은 IITJ의 기관 보조금으로 설립되었으며 생명공학부(BT/PR12831/MED/30/1489/2015)와 인도 전자정보기술부(No.4(16호)/2019-ITEA의 보조금으로 지원받고 있습니다. 인간의 뇌 조직 섹션은 기관 윤리위원회 허가 후 의학의 모든 인도 연구소 (AIIMS) Jodhpur에서 얻은. 비디오 그래피 지원을 위해 디자인 및 예술 협회 IIT Jodhpur의 B.Tech 학생 회원인 마야크 라토르에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
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