Summary
Este protocolo é um método eficiente, econômico e robusto de isolar microglia primária de tecido cerebral vivo, adulto e humano. A microglia humana primária isolada pode servir como ferramenta para estudar processos celulares em homeostase e doenças.
Abstract
Microglia são células imunes inatas residentes do sistema nervoso central (SNC). A microglia desempenha um papel crítico durante o desenvolvimento, na manutenção da homeostase, e durante a infecção ou lesão. Vários grupos de pesquisa independentes têm destacado o papel central que a microglia desempenha em doenças autoimunes, síndromes autoinflamatórias e cânceres. A ativação da microglia em algumas doenças neurológicas pode participar diretamente de processos patogênicos. A microglia primária é uma ferramenta poderosa para entender as respostas imunes no cérebro, interações células-células e fenótipos de microglia desregulados na doença. Microglia primária imita propriedades microgliais in vivo melhor do que linhas de células microgliais imortalizadas. Microglia adulta humana apresenta propriedades distintas em comparação com microglia fetal e roedora humana. Este protocolo fornece um método eficiente para o isolamento da microglia primária do cérebro humano adulto. Estudar essas microglias pode fornecer insights críticos sobre as interações célula-células entre microglia e outras populações celulares residentes no CNS, incluindo oligodenrócitos, neurônios e astrócitos. Além disso, a microglia de diferentes cérebros humanos pode ser cultivada para caracterização de respostas imunes únicas para medicina personalizada e uma miríade de aplicações terapêuticas.
Introduction
O sistema nervoso central (SNC) é construído de uma complexa rede de neurônios e células gliais1. Entre as células gliais, a microglia funciona como as células imunes inatas do CNS2,3. A Microglia é responsável pela manutenção da homeostase no CNS4saudável . A microglia também desempenha um papel importante no neurodesenvolvimento, podando as sinapses2. A microglia é central para a fisiopatologia de várias doenças neurológicas, incluindo, mas não restritas; Doença de Alzheimer5, Doença de Parkinson6, derrame7, esclerose múltipla8,lesão cerebral traumática9,dor neuropática10,lesão medular11 e tumores cerebrais como gliomas12.
Estudos relacionados à homeostase e doenças do CNS utilizam microglia de roedores devido à escassez de protocolos de isolamento primário primário humano13. A microglia de roedores se assemelha à microglia humana primária na expressão de genes como Iba-1, PU.1, DAP12 e receptor M-CSF e tem sido eficaz na compreensão do cérebro normal e doente13. Curiosamente, a expressão de vários genes relacionados imunológicos como TLR4, MHC II, Siglec-11 e Siglec-3 varia entre microglia humana eroedora 13. A expressão de vários genes também varia na expressão temporal e em doenças neurodegenerativas em ambas as espécies14,15. Essas diferenças significativas fazem da microglia humana um modelo essencial para estudar a função da microglia na homeostase e na doença. A microglia humana primária também pode ser uma ferramenta eficaz para a triagem pré-clínica de potenciais candidatos a medicamentos16. As razões acima mencionadas sublinham a crescente necessidade de protocolos econômicos para o isolamento da microglia humana primária.
Desenvolvemos um protocolo para isolamento da microglia humana primária do tecido cerebral humano adulto coletado como resultado de uma janela cirúrgica criada para ressecções tumorais ou outras ressecções cirúrgicas. O método aqui é consideravelmente diferente dos métodos existentes. Conseguimos isolar e cultivar microglia após um tempo de trânsito de cerca de 75 minutos do local de coleta de tecidos para iniciar o protocolo de isolamento em laboratório. Usamos o supernascer de células fibroblastos L929 para promover o crescimento de microglia isolada. Este método foca especificamente na cultura e desenvolvimento apenas de microglia primária. A cultura resultante preparada é de cerca de 80% de microglia. Enquanto outros protocolos fornecem uma cultura enriquecida de microglia por centrífuga de gradiente de densidade, citometria de fluxo e contas magnéticas, o protocolo é uma maneira rápida, simples, robusta e econômica de cultivar microglia humana primária17,,18,,19,,20. A capacidade de utilizar tecido cerebral adulto vivo removido cirurgicamente em vez de tecidos cerebrais fixos de cadáveres prova uma vantagem adicional deste método em contraste com os procedimentos existentes18,,21.
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Protocol
Todos os tecidos foram adquiridos após liberação ética dos comitês de ética do Instituto Indiano de Tecnologia Jodhpur e do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Aquisição e processamento de tecidos (Dia 0)
- Colete o tecido em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de líquido cerebrospinal artificial gelado (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM de glicose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM de sacarose)20. Certifique-se de que o tubo é mantido no gelo se o tecido precisar ser transferido para um local diferente.
NOTA: Prepare aCSF em água destilada autoclavada. Filtre-o com filtro de seringa de 0,22 μm no capô laminar. Isso pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C. - Limpe o tubo de coleta cuidadosamente com 70% de álcool e transfira para uma câmara de fluxo de ar asséptico laminar.
- Descarte a ACSF cuidadosamente e pese tecido em uma condição asséptica. O peso tecidual é essencial para calcular o volume de trypsin-EDTA necessário para etapas subsequentes.
- Mantenha o tecido em aCSF quente fresco a 37 °C por 5 minutos. Este passo é fundamental para evitar a morte celular.
- Descarte aCSF e lave o tecido uma vez com 1x PBS (salina tamponada de fosfato) a 37 °C. Certifique-se de que todo o sangue seja lavado com lavagens repetidas da PBS (conforme necessário).
- Incubar o tecido em PBS quente, a 37 °C, por 5 min.
- Descarte a PBS cuidadosamente e transfira tecido para uma placa de Petri esterilizada. O PBS pode ser removido com uma pipeta. Isso evitará qualquer perda de tecido.
- Pique o tecido em pedaços pequenos (pelo menos 1 mm3) usando um bisturi estéril. O tecido finamente picado fornece maior área de superfície tecidual para dissociação tecidual, garantindo maior rendimento.
- Transfira o tecido picado para um tubo de 50 mL contendo tecido de 10 mL/g de 0,25% trypsin-EDTA e misture por pipetação através de uma pipeta sorológica de 10 mL. Adicione 2 mL de trippsina/EDTA a uma placa de Petri e lave bem a placa com a ajuda da pipeta. Adicione este trypsin de volta ao tubo falcão. Isso minimiza a perda de tecido e células durante o dicing.
- Incubar o tubo em um agitador por 30 minutos a 37 °C a 250 rpm. Esta etapa aumenta a dissociação das células do tecido.
- Ao final da incubação, adicione 10 mL de meio neutralizante (50% DMEM/50% F12 com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS) para neutralizar a trippsina. Misture com uma pipeta sorológica de 10 mL. A quantidade de mídia neutralizante adicionada deve ser igual à quantidade de trippsina usada.
- Centrifugar o tubo a 2.000 x g a 4 °C por 10 minutos.
- Descarte o supernasciante e suspenda a pelota em 1 mL de cultura média (50% DMEM/50% F12 com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 20% supernanato L929, 10% FBS).
NOTA: As células L929 são cultura no DMEM (DMEM com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS). O método de cultura recomendado pela ATCC deve ser seguido para a cultura celular. O supernascido deve ser coletado do frasco de cultura que é pelo menos 75% confluente. Pode ser coletado a granel e armazenado a -80 °C para evitar a degradação dos fatores de crescimento. Recomenda-se adicionar L929 supernacido separadamente em frascos em vez de adicionar ao meio de cultura de estoque. - Emplaque as células em um frasco T-25, adequado para células aderentes, e adicione 4 mL de meio de cultura adicional. Incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO2. Agite cuidadosamente o frasco para dispersar o tecido de forma homogênea. Evite trazer a mídia para o pescoço do frasco, enquanto treme, pois isso pode aumentar as chances de contaminação.
2.Cultura celular (dia 2)
- Colete a mídia do frasco de cultura T-25 preparado no dia 0 em três tubos de centrífugas de 1,5 mL coletando o mesmo volume de mídia em cada tubo. Lave o frasco uma vez com 1 x PBS. Agite o frasco suavemente para remover quaisquer fragmentos de tecido remanescentes deixados. Evite o tremor severo do frasco, pois qualquer fragmento remanescente não afetará negativamente a cultura. Adicione 5 mL de mídia de cultura fresca ao frasco.
- Centrifugar a mídia coletada a 1.466 x g (4000 rpm) a 4 °C por 4 minutos.
- Descarte o supernasal de cada tubo e adicione 1 mL de meio de cultura a um dos tubos. Misture bem com a pipeta. Adicione em série a mídia mista com células a outros tubos. Misture bem com a pipeta e misture as células em um tubo.
- Coloque as células em um frasco T-25 separado, adequado para células aderentes. Adicione 4 mL de cultura média e incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO2.
3.Cultura celular (dia 4)
- Descarte a mídia de ambos os frascos e adicione 5 mL frescos de mídia cultural ao frasco.
- Incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO2 durante 2 dias.
4. Cultura Celular (Dia 6)
- As células estarão prontas para mais experimentos.
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Representative Results
Usando o protocolo acima mencionado (Figura 1), conseguimos isolar microglia humana primária de tecidos cerebrais ressecados cirurgicamente vivos. As células cultivadas foram manchadas com Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectina para microglia (verde) e com proteína ácida fibrilar glia (GFAP) para astrócitos (vermelho) (Figura 2) como descrito anteriormente22,23,24,,25,26. 4′,6-diamidino-2-fenilômado (DAPI) foi usado para manchar núcleos (azul). No sexto dia do início do experimento, as células estavam prontas para mais experimentos. As células manchadas foram contadas cegas para microglia e astrócitos presentes na cultura. Cerca de 80% da cultura primária eram microglia (Figura 2).
Figura 1: Esquema do isolamento primário de microglia do cérebro adulto. O tecido removido cirurgicamente foi coletado em gelo frio de 10 mL de aCSF em um tubo de 50 mL e transferido para o laboratório. O tecido foi lavado com aCSF e PBS, respectivamente e finamente cortado, dissociado com a ajuda de trypsin-EDTA e banhado em um frasco T-25. No segundo dia, a mídia foi coletada e centrifuada. Pellet foi misturado em mídia fresca e banhado em um frasco T-25. A nova mídia foi adicionada ao primeiro frasco. A mídia foi alterada em ambos os frascos em dias alternados. As células estavam prontas para mais experimentos no dia 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imunocitoquímica de microglia humana primária isolada. (A) Células isoladas foram banhadas em um escorregador de duas câmaras de poço e foram manchadas com GFAP para astrócitos (painel verde-primeiro) ou RCA para microglia (painel green-second). Os núcleos estavam manchados de azul com DAPI. O controle de RCA e controle secundário de anticorpos para GFAP é mostrado no inset. (B) As células isoladas foram banhadas em um escorregador de câmara de dois poços e foram manchadas com RCA para microglia (verde) e GFAP para astrócitos (vermelho). A segunda linha mostra o controle para RCA e controle secundário de anticorpos para GFAP. Os núcleos estavam manchados de azul com DAPI. (C) As células foram contadas pelo controle cego. Quantificação é representativa da contagem por um controle cego. Cerca de 80% das células eram microglia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Microglia garante homeostase no cérebro normal e desempenha papéis centrais na fisiopatologia de várias doenças neurológicas4. Microglia são centrais para o neurodesenvolvimento e formação de sinapses2. Estudos microgliais têm se mostrado fundamentais na compreensão do desenvolvimento e progressão de diversas doenças neurológicas4. A microglia de roedores é o modelo predominante de escolha para estudos microgliais primários, embora, a microglia de roedores seja diferente da microglia humana primária nos aspectos-chave13. O desenvolvimento de protocolos econômicos, de alto rendimento, para isolamento da microglia humana primária pode ajudar a preencher essa lacuna. Desenvolvemos um protocolo para isolamento da microglia humana primária a partir de tecido cerebral vivo, cirurgicamente ressecado, adulto e humano. Conseguimos alcançar a pureza microglial de cerca de 80% conforme verificado no7º dia.
Uma das etapas mais críticas do protocolo foi o transporte de tecido adquirido para o laboratório para processamento. Como o tempo de trânsito era de cerca de 75 minutos, era provável que não fossemos capazes de isolar nenhuma célula. Conseguimos isso usando um tubo de 50 mL com apenas 10 mL de aCSF. aCSF forneceu os nutrientes necessários e o espaço restante no tubo ajudou a aerar o aCSF e o tecido. Existe a possibilidade de que tenha havido morte considerável de neurônios e outras células durante o período de trânsito. Embora isso ajude no isolamento da microglia, este protocolo pode não ser eficiente para o isolamento de outras células neurológicas. Conseguimos isolar células microgliais de 268 mg de tecido dissecado. Também conseguimos alcançar uma pureza significativa da microglia, evitando também o revestimento de frascos por poli-D-lysine. Embora isso possa ter resultado em alguma perda de microglia, isso também evitou que outras populações gliais aderissem ao frasco. Além disso, isso evitou um passo extra de sacudir o frasco e coletar microglia. Era possível que algumas das células não tivessem aderido no frasco preparado no dia 0. Coletamos células não aderentes da cultura inicial e a banhamos novamente em outro frasco no dia 2, que também produziu células de microglia. Deve-se notar que a fina dicing do tecido é importante, pois aumentará a superfície da área do tecido. Isso permitirá que a trippsina acesse a maior parte do tecido e dissocia mais células.
Para promover o crescimento da microglia na cultura, condicionamos o meio cultural com o supernascido das células L92927,28. Isso fornece uma rica fonte de fator estimulante da colônia granulocito-macrófago (GM-CSF) como suplemento, o que aumenta a proliferação de macrófagos27,29. Isso ajudou a reduzir o custo de suplementos de crescimento caros adicionais que são um pilar de vários protocolos de isolamento primário microglial. Adicionar supernascer L929 é crucial para o isolamento eficiente e crescimento da microglia no protocolo. No entanto, para os laboratórios sem cultura celular L929, isso se torna um passo limitante considerando o custo global do protocolo, pois serão necessários suplementos adicionais de crescimento. Conseguimos uma população microglial de cerca de 80% nas condições culturais. Isso é menos do que alguns protocolos publicados, mas isso pode ser superado por ter uma rodada adicional de isolamento através de protocolos específicos, como o uso de contas magnéticas para marcadores microgliais específicos. Com cerca de 80% de pureza cultural, o protocolo é eficiente para muitos experimentos como a imunocitoquímica. No entanto, para experimentos como purificação de proteínas, identificação de proteínas e manchas ocidentais, pode ser necessária uma purificação adicional da cultura. Mesmo com alta pureza das culturas primárias, há sempre a possibilidade de que outras células presentes na cultura possam aumentar com maior duração cultural. Nós culturamos com sucesso microglia isolada por 9 dias, passando-as uma vez. Embora as condições culturais no protocolo favoreçam o isolamento e o crescimento da microglia, a presença de outras células deve ser considerada ao manter a cultura por mais tempo.
Este protocolo para isolar a microglia primária é eficaz, robusto e econômico. Tais protocolos para o isolamento da microglia humana primária do tecido cerebral adulto permitirão pesquisas oportunas sobre funções imunológicas, fisiologia celular e respostas de doenças no cérebro adulto. Além disso, a microglia primária derivada do paciente pode ajudar no desenvolvimento de terapêuticas personalizadas e futuras.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O laboratório da SJ foi criado com subvenções institucionais da IITJ e é financiado por subvenções do Departamento de Biotecnologia (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) e do Ministério de Eletrônica e Tecnologia da Informação do Governo da Índia (nº 4(16)/2019-ITEA). As seções de tecido cerebral humano foram obtidas do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur após a liberação do Comitê de Ética Institucional. Agradecemos a Mayank Rathor, membro do B.Tech Student da Design and Arts Society IIT Jodhpur, pelo apoio à videografia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
