Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61447
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

Summary

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Abstract

Zoogdiercellen worden voortdurend blootgesteld aan chemische stoffen, straling, en natuurlijk voorkomende metabolische bijproducten, die specifieke soorten DNA-beledigingen te creëren. Genotoxische middelen kunnen de DNA-ruggengraat beschadigen, breken of de chemische aard van individuele basen wijzigen. Na DNA-belediging worden DNA damage response (DDR) trajecten geactiveerd en eiwitten aangeworven die betrokken zijn bij de reparatie. Een overvloed aan factoren zijn betrokken bij het waarmaken van het type schade en het activeren van de juiste reparatierespons. Het niet correct activeren en rekruteren van DDR-factoren kan leiden tot genomische instabiliteit, wat ten grondslag ligt aan veel menselijke pathologieën, waaronder kanker. Studies van DDR-eiwitten kunnen inzicht geven in de reactie van genotoxische geneesmiddelen en cellulaire mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen.

Er zijn twee belangrijke manieren om eiwitten in vivote visualiseren: directe observatie, door het eiwit van belang te taggen met een fluorescerend eiwit en het te volgen door live beeldvorming, of indirecte immunofluorescentie op vaste monsters. Terwijl visualisatie van fluorescerende gelabelde eiwitten nauwkeurige monitoring na verloop van tijd mogelijk maakt, kan directe tagging in N- of C-terminus interfereren met de eiwitlokalisatie of functie. Observatie van eiwitten in hun ongewijzigde, endogene versie heeft de voorkeur. Wanneer DNA-reparatie-eiwitten worden aangeworven voor de DNA-belediging, hun concentratie stijgt lokaal en ze vormen groepen, of "foci", dat kan worden gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie met behulp van specifieke antilichamen.

Hoewel detectie van eiwitfoci geen definitief bewijs van directe interactie biedt, geeft colokalisatie van eiwitten in cellen aan dat ze zich hergroeperen naar de plaats van schade en kunnen ze informeren over de volgorde van gebeurtenissen die nodig zijn voor complexe vorming. Zorgvuldige analyse van foci ruimtelijke overlap in cellen uitdrukken wilde type of mutant versies van een eiwit kan kostbare aanwijzingen geven over functionele domeinen belangrijk voor DNA reparatie functie. Ten slotte duidt colokalisatie van eiwitten op mogelijke directe interacties die kunnen worden geverifieerd door co-immunoprecipitatie in cellen, of directe pulldown met behulp van gezuiverde eiwitten.

Introduction

Menselijke cellen worden voortdurend blootgesteld aan een verscheidenheid van DNA-schadelijke stoffen van verschillende oorsprong. Exogene bronnen bestaan meestal uit blootstelling aan straling, chemicaliën (waaronder chemotherapeutische agentia en sommige antibiotica), en virussen, terwijl de belangrijkste endogene bronnen fouten in DNA-replicatie en oxidatieve stress omvatten. De directe effecten van genotoxische blootstelling kunnen variëren van een gewijzigde basis tot een potentieel dodelijke DNA double-strand break (DSB), afhankelijk van de stress en de blootstellingsdosis. Uiteindelijk kan niet-gerepareerde of verkeerd gerepareerde DNA-schade leiden tot de accumulatie van mutaties, genomische herschikkingen, instabiliteit van het genoom en uiteindelijk leiden tot carcinogenese1. Zoogdiercellen hebben complexe paden ontwikkeld om specifieke soorten DNA-schade2,,3 te herkennen en ze tijdig te herstellen, gesynchroniseerd met de progressie van de celcyclus.

Ioniserende straling (IR) beschadigt de DNA dubbele helix en creëert dubbelstrengbreuken (DSB's), een van de meest schadelijke vormen van DNA-schade. Het MRN -complex (MRE11, RAD50, NBS1) functioneert als een sensor van DNA-uiteinden en activeert het eiwit kinase ataxie telangiectasia gemuteerd (ATM)4,5. Na de eerste activering van ATM door DNA-einden, ACTIVEert ATM een cascade van DDR-gebeurtenissen op de plaats van de pauze, initiërend met een belangrijke gebeurtenis, de fosforylatie van de histonevariant H2AX6. H2AX fosforylatie op residu S139 activeert het in γH2AX, verspreid over regio's tot megabases rond de DNA-laesie6,7,8,9. Deze gebeurtenis verhoogt de toegankelijkheid van DNA, wat leidt tot de werving en accumulatie van andere DNA-reparatieeiwitten7. Omdat γH2AX overvloedig en specifiek wordt geïnduceerd omliggende DSB's, kan het gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van specifieke antilichamen, en wordt vaak gebruikt als surrogaat marker voor DSB's in het DNA-reparatieveld. Zodra de breuk is gesignaleerd, activeren cellen hun DNA-hersteltrajecten en verwerken ze de DNA-schade. Het eiwit MDC1 (bemiddelaar van DNA-schadepostwit 1) bindt direct γH2AX10, interageert met ATM11 en ook met NBS112,13. Het draagt bij aan het verhogen van de concentratie van MRN-complex bij de DSB en het initiëren van een positieve ATM-feedbacklus. γH2AX wordt snel verwijderd zodra de breuk is gerepareerd, waardoor de DSB-klaring kan worden gecontroleerd. Gevolgd door microscopie, de daling van γH2AX na verloop van tijd zorgt voor een indirecte meting van resterende breuken en DNA-reparatie efficiëntie.

Eukaryotische cellen kunnen DSB's via verschillende trajecten herstellen, waarbij de twee belangrijkste niet-homologe end-joining (NHEJ) en homologe recombinatie (HR)(figuur 1)zijn. NHEJ ligat in wezen DNA dubbelstrengeinden zonder het gebruik van uitgebreide homologie en werkt gedurende de celcyclus14,15. HR wordt overheersend tijdens S- en G2-fasen, en wordt anders onderdrukt, omdat het een zuster chromatid vereist als een homologe sjabloon voor reparatie14,16. De keuze van het traject tussen NHEJ en HR hangt niet alleen af van de fysieke nabijheid van de zusterchromatoïde, maar ook van de uitbreiding van DNA-eindresectie17, wat NHEJ remt.

Homologie-afhankelijke DSB reparatie initieert door nucleolytische afbraak van de 5 'streng van de pauze eindigt op het genereren van 3 'single-streng DNA (ssDNA) staarten, een proces aangeduid als 5 '-3' resectie. Het MRN-complex initieert DNA-eindresectie en verdere resectie wordt verwerkt in combinatie met BLM/EXO1 (Bloom syndrome protein/exonuclease 1) of BLM/DNA2 (DNA-replicatie ATP-afhankelijke helicase/nuclease)18,19,20,21,22. DNA-eindresectie wordt versterkt door CtIP (CtBP-interactief eiwit) door de directe interactie met MRN complex23 en rekrutering van BRCA1 (borstkanker type 1 gevoeligheideiwit)24,25. Replicatie-eiwit A (RPA) bindt zich onmiddellijk aan de blootgestelde ssDNA en wordt vervolgens verplaatst door het recombinase-eiwit RAD51 om een nucleoproteïne filament te vormen dat homologe zoek- en strenginvasie katalyseert26,27,28.

De initiatie van resectie is een kritieke stap voor reparatie traject keuze. Zodra de resectie is gestart, worden de DNA-uiteinden slechte substraten voor binding door Ku70/Ku80 heterodimer (component van NHEJ-pad) en zijn cellen toegewijd aan HR17,29,30. De Ku70/Ku80 heterodimeer bindt zich aan DSB-uiteinden en werft DNA-PKcs en p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 fungeert als een barrière voor resectie in G1, waardoor HR wordt geblokkeerd terwijl het NHEJ31,32bevordert , maar het wordt in de S-fase op een BRCA1-afhankelijke manier verwijderd, waardoor resectie33,34kan plaatsvinden . Daarom spelen 53BP1 en BRCA1 tegengestelde rollen in DSB-reparatie, waarbij 53BP1 een NHEJ-facilitator is, terwijl BRCA1 werkt om breuken te repareren via HR.

In het laboratorium kan DSB-vorming worden veroorzaakt door ioniserende straling (IR). Terwijl dit voorbeeld maakt gebruik van een hoge dosis van 4 Gy, 1 Gy en 2 Gy ook een aanzienlijke hoeveelheid DSB's, geschikt voor de analyse van foci vorming door overvloedige eiwitten. Het is belangrijk op te merken dat het type en de dosis van de gebruikte straling kan leiden tot verschillende laesies in het DNA en in de cel: terwijl IR induceert DSB's, het kan ook leiden tot single streng breuken of basis modificatie (zie35,36 voor een verwijzing naar straling lineaire energieoverdracht (LET) en type dna-schade). Om de kinetiek van ioniserende straling-geïnduceerde foci (IRIF) vorming en hun klaring te bepalen, die wijzen op herstel van de schade en omkering van de geactiveerde DDR8,9,37,38, foci vorming kan worden gecontroleerd op verschillende tijdstippen na ioniserende straling. Timing van activering en klaring van alle belangrijke DNA-schade eiwitten is bekend39, en velen worden onderzocht als surrogaat markers van belangrijke gebeurtenissen. PRPA, dat een hoge affiniteit heeft met ssDNA, wordt bijvoorbeeld gebruikt als surrogaat van de pauzeresectie, MRN-eiwitten (MRE11, RAD50, NBS1) en exonleases kunnen ook worden gebruikt om de resectie-efficiëntie te beoordelen. Terwijl RAD51, BRCA1, BRCA2 (borstkanker type 2 gevoeligheideiwit) en PALB2 (partner en localizer van BRCA2) kunnen worden gecontroleerd om hr-efficiëntie te evalueren, worden de aanwezigheid van de Ku-eiwitten of 53BP1 gebruikt als markers van NHEJ(figuur 1).

Aangezien de proteïnen van de reparatiemachines van DNA elkaar aan de onderbreking aan de onderbreking aanwerven en in super-complexen assembleren, kunnen de interacties van DNA-eiwit en eiwit-eiwit door hun individuele lokalisatie in tijd volgen en colokalisatie van proteïnen analyseren, zoals gevisualiseerd door overlappende signalen in cel40,41,42. In cellijnen maakt de introductie van puntmutaties of verwijdering in specifieke DNA-herstelgenen, hetzij door genoombewerking, hetzij door overexpressie van op plasmid gebaseerde mutanten, onderzoek mogelijk naar specifieke residuen en hun mogelijke rol bij de herkenning van DNA-schade (bijvoorbeeld colokalisatie met γH2AX) of complexe assemblage (colokalisatie met een andere, of meerdere, eiwitten), evenals hun impact op DNA-reparatie. Hier gebruiken we indirecte immunofluorescentie als een middel om de vorming en resolutie van DSB's te onderzoeken door γH2AX foci in de loop van de tijd te volgen. We presenteren ook een voorbeeld van foci vorming en co-lokalisatie analyse door een belangrijke speler in DSB reparatie: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Zoals eerder vermeld, 53BP1 wordt beschouwd als centraal in DNA reparatie traject keuze. Na 53BP1 accumulatie en de co-lokalisatie met γH2AX biedt kostbare informatie over celcyclus fase, DNA schade accumulatie, en route gebruikt om DSB's te repareren. Het doel van indirecte immunolokalisatie is het beoordelen van de efficiëntie van DNA-schadeherstel in cellijnen, naar aanleiding van IR zoals in deze studie, of na blootstelling aan verschillende spanningen in de cel, van DNA-kruislinking tot verstopping van de replicatievork (een lijst van DNA-schadelijke stoffen is opgenomen in tabel 1).

Figure 1
Figuur 1: DNA double strand breaks (DSB) reparatie trajecten.
DSB reparatie omvat twee belangrijke trajecten: Homologous Recombinatie (HR, links) en Non-Homologous End-Joining (NHEJ, rechts). Na de pauze worden eiwitten geactiveerd om de pauze te markeren (γH2AX), deel te nemen aan eindresectie (MRN), de resected ssDNA (pRPA) te coaten, recombinatie te bevorderen (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) of hersectie te beperken en NHEJ (53BP1) te bevorderen. Andere eiwitten nemen deel aan schadeherstel, maar de genoemde eiwitten worden routinematig gevolgd door indirecte immunofluorescentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

DNA-beschadigend middel Werkingsmechanisme Aanbevolen dosis
γ-stralen/röntgenstralen Straling
Vorming van dubbelstranden breekt met een aantal ongecontroleerde cellulaire effecten		 1-4 Gy
36. Ar ionen Straling
Vorming van dubbelstranden		 270 keV/μm
α-deeltjes Straling
Vorming van dubbelstranden		 116 keV/μm
Bleomycine Remmer van DE synthese van DNA 0,4-2 μg/mL
Camptothecin Remmer van topoisomerase I 10-200 nM
Cisplatine Alkylating agent
(inducerende intrastrand crosslinks)		 0,25-2 μM
Doxorubicine Intercalating agent
Remmer van topoisomerase II		 10-200 nM
Etopozijde Remmer van topoisomerase II 10 μM
Hydroxyurea Hydroxyurea Remmer van DE synthese van DNA
(door ribonucleotide reductase)		 10-200 μM
Methymethfonaat Alkylating agent 0,25-2 mM
Mitomycine C Alkylating agent 0,25-2 μM
Ultraviolet (UV) licht Vorming van thymidine dimers
(het genereren van vervorming van de DNA-keten)		 50-100 mJ/cm2

Tabel 1: Genotoxische middelen. Voorbeelden van DNA-schadelijke stoffen, hun werkingsmechanisme en de schade veroorzaakt op basis van de voorgestelde werkconcentratie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HeLa celcultuur

  1. Voorbehandel ronde glazen coverslips met 1 M HCl bij 50 °C gedurende 16-18 uur. Spoel af met ddH2O en bewaar in 100% EtOH.
  2. Bereid celkweekmedium voor: voeg 10% (v/v) FBS toe aan DMEM medium.
  3. Kweek 4,0 x 104 cellen/put in steriele 12-put plaat met een 18 mm ronde glazen coverslip bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde couveuse. Groei cellen tot 80% samenvloeiing (ongeveer 24 uur).

2. Celbehandeling met straling (IR)

  1. Om de vorming van dubbelstrengbreuken te veroorzaken, stelt u cellen bloot aan 4 Gy γ-bestraling (controle: Geen bestraling, t=0). In de Gamma Cell -40 komt dit overeen met 4,54 min, op 0,815 Gy per min.
  2. Incubeercellen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde couveuse voor de juiste tijdsduur (hier gekozen tijdstippen t=1, 2, 4, 16 h).

3. Nucleaire extractie en celfixatie

  1. Bereid voorraadoplossingen voor: 0,2 M PIPES (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M sacharose, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8.0).
  2. Bereid nucleaire extractiebuffer (NEB) voor: los 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) en 0,5% (v/v) Triton X-100 in ddH2O. Mix volledig opgelost.
  3. Bereid 4% (v/v) paraformaldehyde (PFA) voor: los 10 mL van 16% PFA waterige oplossing op in 30 mL PBS. Meng tot volledig opgelost.
  4. Op het juiste tijdstip (t=0, 1, 2, 4, 16 h), was cellen twee maal met 1 mL PBS. Verwijder PBS volledig.
  5. Voeg 200 μL NEB toe aan elke put voor celkernenextractie (cytoplasma wordt afgebroken, alleen kern blijft over) (figuur 2). Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder volledig.
    LET OP: Niet langer dan 2 minuten.

Figure 2
Figuur 2: Nucleaire winning.
Representatieve afbeeldingen van cellen voorafgaand aan (links) en post (rechts) nucleaire extractie. Cytoplasma moet worden verteerd, maar de nucleaire structuur moet intact blijven na de extractie (rechts). A) 20x vergroting; schaalbalk = 20 μm en (B) 40x vergroting; schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Was cellen met 1 mL PBS. Verwijder PBS volledig. Voeg PBS zorgvuldig, cellen zijn zeer kwetsbaar bij deze stap.
  2. Voeg 200 μL van 4% (v/v) PFA toe aan elke put voor celfixatie. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder PFA volledig.
  3. Voeg 1 mL PBS toe.
    LET OP: Cellen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 °C.

4. Kleuring van immunofluorescentie

  1. Voormaken van blokkeringsoplossing: los 5% BSA (w/v) op in PBS en voeg 0,3% (v/v) Triton X-100 toe. Meng tot volledig opgelost.
  2. Bereid verdunningsbuffer voor: los 1% BSA (w/v) op in PBS en voeg 0,3% (v/v) Triton X-100 toe. Meng tot volledig opgelost.
  3. Voeg voor het blokkeren 200 μL blokkeringsoplossing toe aan elke put. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 16-18 uur bij 4 °C.
    OPMERKING: Als geitenantilichaam wordt gebruikt, voegt u 5% geitenserum toe aan de blokkeringsoplossing.
  4. Verdun het primaire antilichaam in verdunningsbuffer (1:500; zie tabel 2 voor de lijst met antilichamen) en vortex tot ze goed gemengd zijn.
    OPMERKING: Als geitantilichaam wordt gebruikt, voeg dan 1% geitenserum toe aan de verdunningsbuffer.
  5. In een vochtigheids-/incubatiedoos, hechten een stuk parafilm. Voeg 10 μL primair antilichaam toe (in één druppel). Lijn een rand van de coverslip met de druppel en langzaam lager op de parafilm, voor de vloeistof te verspreiden over (vermijd bubbels indien mogelijk). Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  6. Was covers drie keer in PBS gedurende 1 minuut.
  7. Verdun secundair antilichaam in verdunningsbuffer (uiteindelijke concentratie: 2 μg/mL) en vortex tot het goed gemengd is.
  8. Breng 10 μL secundair antilichaam aan zoals beschreven voor de primaire antilichamen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    LET OP: Bescherm tegen licht.
Antilichaam Bedrijf Verwijzing Bron
53BP1 Celsignalering 4937 Konijn
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam Abcam ab150103 Ezel
Anti-fosfo-Histone H2A. X (Ser139), kloon JBW301 Millipore Millipore 05-636 Muis
Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam Abcam ab150081 Geit

Tabel 2: Gebruikte antilichamen. Lijst van antilichamen die in deze studie worden gebruikt.

  1. Was covers drie keer in PBS gedurende 1 minuut.
  2. Was coverslips met H2O gedurende 1 minuut.
  3. Counterstain DNA met DAPI: breng 10 μL van 300 nM DAPI (zoals beschreven voor antilichamen), incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en monteer vervolgens op glazen schuif met een op glycerol gebaseerde montagemedia. U ook één druppel (10 μL) van commerciële antifademontagemedia met DAPI op een dia toevoegen en een coverslip aanbrengen. Druk voorzichtig op de coverslip en verwijder overtollig vocht eromheen met een papieren handdoek.
  4. Verzegel coverslips met transparante nagellak en laat ze 20 minuten drogen.
  5. Bewaar dia's bij 4 °C.

5. Beeldacquisitie

  1. Plaats een druppel onderdompelingsolie op de 60x objectieve lens. Gebruik DAPI om de kernen te lokaliseren door middel van oogstuk.
    1. Voor XYZ-beeldacquisitie, open acquisitiesoftware en geselecteerde parameters: Scannertype: Galvano; Scannermodus: rondreis; Afbeeldingsgrootte: 512×512; PMT-modus: VBF; PMT gemiddeld: frame (4 keer); PMT sequentiële scan: lijn.
    2. Selecteer de kleurstof en de detectoren:
      Kanaal (CH1), Kleurstof (DAPI), Detector (SD1)
      Kanaal (CH2), Kleurstof (Alexa Fluor 488), Detector (HSD3)
      Kanaal (CH3), Kleurstof (Alexa Fluor 647), Detector (HSD4)
    3. Selecteer AAN in 'Z'.
  2. Pas de live-afbeelding aan. Druk op de knop Live in het live-venster.
    1. Pas de focus aan en stel laserintensiteit in (%), gevoeligheid (HV), gain en offset op het gereedschapsvenster "PMT".
      1. Pas de laserintensiteit aan (%): voor helderheid en bleken. Hoe hoger de laserintensiteit, hoe sterker het signaal, maar het monster zal fotobleach.
      2. Pas de gevoeligheid (HV): geluidsniveau aan. Hoe hoger de HV, hoe sterker het signaal, maar het beeld zal luidruchtig zijn als te hoog.
        LET OP: Houd de spanning altijd constant.
      3. Pas de verschuiving aan: achtergrondniveau.
    2. Selecteer Start/einde (15 segmenten) voor Z-stapels.
  3. Start de overname.
    1. Selecteer de map om afbeeldingen op te slaan. Druk op de LSM-startknop om de afbeelding te verkrijgen. Druk op de knop Series Done om de afbeeldingsverwerving te voltooien.

6. Gegevensanalyse

  1. Open de analysesoftware voor beeldanalyse.
    1. Druk op het gereedschapsvenster Batch, selecteer de afbeeldingen die u wilt analyseren en selecteer uitvoermap.
    2. Druk op het venster Van het gereedschap Analyse en selecteer Projectie (geeft de maximale intensiteitsprojectie van 15 segmenten weer).
    3. Selecteer onder Instelling invoer/uitvoerde gemaakte batch.
    4. Druk op Proces om afbeeldingen te verwerken.
    5. Afbeeldingen exporteren als .tiff-bestanden.
  2. Voor nucleaire foci kwantificering, open CellProfiler.
    1. Open de γH2AX en 53BP1 foci quantification pipeline (zie Aanvullende informatie).
    2. Grafiekgegevens met behulp van een tabelsoftware.
  3. Open CellProfiler voor colokalisatieanalyse.
    1. Open de Colocalisatiepijplijn (zie Aanvullende informatie). Er wordt een spreadsheetbestand gemaakt en opgeslagen op de gewenste locatie. Grafieken zelf worden echter niet automatisch opgeslagen. Er wordt voorgesteld om een momentopname van de vensters te nemen om bij te houden voor het registreren van de resultaten.
    2. Grafiekgegevens met behulp van een tabelsoftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Op dag 2, of 24 uur na het zaaien van cellen op coverslips, cellen hebben ondergaan een verdeling en zijn 80% confluent. Specifieke knock downs of mutaties in DNA-hersteleiwitten kunnen de verdubbelingstijd verhogen of cellen sensibiliseren voor genotoxische behandeling, en de zaaidichtheid en behandelingsdoses moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Om de beste werkomstandigheden te bepalen, kan de timing van de DNA-schaderespons worden vastgesteld door westerse blotting van γH2AX in de tijd, en de gevoeligheid voor bestraling kan worden geïdentificeerd door kolonievormende test.

Cellen die niet met bestraling worden behandeld, vertonen weinig of geen γH2AX foci (figuur 3A). γH2AX foci vorming kan echter worden geactiveerd in gekweekte cellen door verschillende spanningen die inherent zijn aan de groeiomstandigheden: cellen links confluent in verzuurde media, aanwezigheid van genotoxische endotoxine in de FBS, zuurstofconcentratie gebruikt voor cultuur, om er een paar aan te halen.

Figure 3
Figuur 3: Nucleaire foci zonder stress.
Bij afwezigheid van externe stressor worden zeer weinig of geen γH2AX foci waargenomen (A). Bij afwezigheid van essentiële DNA-hersteleiwitten kan γH2AX-accumulatie worden waargenomen als breuken die optreden als gevolg van endogene bronnen niet worden hersteld (B). Accumulatie van niet-gerepareerde pauzes kan ertoe leiden dat cellen pre-apoptotisch worden, wat wordt gekenmerkt door een "solide" γH2AX nuclei-kleuring (C). Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Bovendien worden IN cellen die zijn uitgeput voor belangrijke DNA-schade-eiwitten, zoals BRCA1- of BRCA2-mutantcellen, DNA-breuken die optreden als gevolg van endogene spanningen niet hersteld zoals in wildcellen en zich ophopen. Als gevolg hiervan kan verhoogde γH2AX worden waargenomen in HR-cellen, zelfs in normale groeiomstandigheden (figuur 3B). Een subpopulatie cellen kan "vaste" nucleaire kleuring vertonen met γH2AX (figuur 3C). Pan-nucleaire vlek kan erop wijzen dat een cel wordt overweldigd door schade onherstelbaar, en / of is pre-apoptotisch. Dergelijke cellen worden meestal gekenmerkt door vergrote kernen, en de aanwezigheid van cytoplasmaleven. Bovendien kan γH2AX worden geactiveerd door replicante stress in S-fase en vastgelopen replicatievorken, of door G2/M-arrestatie. Indien nodig kunnen celcyclusfasen worden geïdentificeerd door het DNA-gehalte te bevlekken of samen te vlekken met specifieke markers. Bij het uitvoeren van DNA-schade reparatie analyse, pan-nucleaire kan onafhankelijk worden gekwantificeerd van geïndividualiseerde foci.

Na bestraling vertonen kernen een groot aantal dubbele strengenbreuken waar γH2AX zeer snel bij lokaliseert (figuur 4). In optimale omstandigheden worden weinig of geen γH2AX foci waargenomen bij afwezigheid van bestraling. Na bestraling neemt de vorming van γH2AX foci sterk toe. Als de pauzes worden verwerkt en gerepareerd, wordt het foci-aantal per kern verminderd, evenals het aantal cellen positief voor foci. De intensiteit en het aantal foci variëren afhankelijk van de gebruikte cellijn en de geleverde dosis bestraling. In lage passage HeLa cellen, gekweekt in endotoxine-vrij serum, we routinematig waargenomen een sterke toename van foci op 30 minuten en 1 h na bestraling, die pieken tussen 1 en 2 uur, dan geleidelijk afneemt tot 16 uur. Om deze reden worden hier representatieve tijdstippen op 0, 1, 2, 4 en 16 uur na bestraling gepresenteerd. Gedrag van de pauze signalering, reparatie, en overleving van bestraling kan sterk variëren tussen cellijnen evenals bij uitputting of mutatie van genen. Om deze reden zijn de meest geschikte tijdstippen experiment- en celafhankelijk. In het experiment, op 16 uur γH2AX restfoci hebben bereikt hetzelfde basale niveau dan niet-bestraalde cellen. Het controleren van de resterende foci om latere tijdpunten op te nemen wordt voorgesteld als het werken met langzaam delende cellijnen.

Figure 4
Figuur 4: Nucleaire foci en kwantificering na stress (tijdsloop).
γH2AX foci formatie bij t=0 (geen bestraling) en op de aangegeven tijdstippen na bestraling (4 Gy, t=1, 2, 4, 16 h). (A) Representatieve beelden worden getoond. DAPI geeft de kernen aan. Schaalbalk = 5 μm. (B) Nucleaire foci van γH2AX na blootstelling aan γ-bestraling werd gescoord door middel van geautomatiseerde kwantificering (CellProfiler) in ≥ 100 kernen voor elk tijdspunt. Afhankelijk van de gestelde biologische vraag en het soort verkregen gegevens, zijn er verschillende opties beschikbaar om de ruwe gegevens te presenteren, om vergelijking en kritisch begrip te vergemakkelijken. (i) Cloudplot toont gemiddelde ± SD. Symbool (*) geeft statistische significantie ten opzichte van controle aan, met behulp van student twee staart t-test: *** p ≤ 0,0001, ii) inductiecurve toont gemiddelde ± SEM, iii) meer dan 10 foci per kern. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Omgekeerd, in cellen die tekortschieten voor DNA-schadeherstelfuncties, hoopt γH2AX foci zich op bij afwezigheid van bestraling (t=0 h) en kan de reparatie worden vertraagd, of zelfs afwezig op lange tijdstippen (t=16 h, t=24 h) na bestraling. Directe vergelijking tussen wilde type en mutant cellen kan geven kostbare informatie over de DNA-reparatie functie van het gen gemuteerd, en hint op het type reparatie. Hoewel een tekort aan NHEJ kan dwingen de pauze te worden gerepareerd door HR in S-fase, DSB's die zijn resected en moet worden gerepareerd door HR zal niet worden gerepareerd door NHEJ. Om deze reden, accumulatie van schade na S-fase kan wijzen op een HR-tekort, en hoge γH2AX niveaus post divisie hint op NHEJ defecten.

Wanneer verschillende eiwitten in dezelfde cellen worden onderzocht, kan colokalisatie worden bestudeerd door primaire antilichamen die bij verschillende diersoorten worden gekweekt, te veelvoudigen en deze te onthullen met secundaire antilichamen met een duidelijke fluoroforen (figuur 5). Co-lokalisatie geeft aan of eiwitten (i) worden aangeworven voor de pauze (ii) tijdig worden aangeworven, (iii) verzamelen in DNA-reparatiecomplexen. Bij het zoeken naar co-lokalisatie, een algemeen aanvaarde kwalitatieve methode is om resultaten te presenteren als een eenvoudige overlay van de verschillende kanalen (dat wil zeggen, groen en rood). Superpositie van groen en rood zal leiden tot gele hotspots, waar de twee eiwitten van belang zijn aanwezig in dezelfde pixels (Figuur 5A). Deze methode heeft echter beperkingen, omdat deze afhankelijk is van de relatieve signaalintensiteit die in beide kanalen wordt verzameld, en de twee fluorchromen kunnen verschillen in signaalsterkte hebben. Daarom helpen overlaymethoden om een visuele schatting van colokalisatiegebeurtenissen te genereren, maar zijn ze niet geschikt voor kwantitatieve doeleinden. Kwantitatieve analyse van colokalisatie kan worden bereikt door een objectgebaseerde benadering(figuur 5B (i-iii) of door een statistische benadering die een op intensiteitscorrelatie gebaseerde (ICCB)-analyses uitvoert (figuur 5B (iv)). Verschillende tools voor co-lokalisatie analyse zijn beschikbaar, met inbegrip van JACoP (Just Another Co-localization Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) en de "Colocalization" pijplijn (CellProfiler) hier gebruikt, die kan worden gebruikt als een ICCB tool, om de relatie tussen fluorescentie intensiteiten te beoordelen. Dit gebeurt meestal door de correlatiecoëfficiënt (Pearson's coëfficiënt) te berekenen die de sterkte van de lineaire relatie tussen twee variabelen meet. Fluorescentie co-lokalisatie kan grafisch worden weergegeven in strooipercelen, waar de intensiteit van een fluorchroom (groen) is uitgezet tegen de intensiteit van het tweede fluorchrome (rood) voor elke pixel. Volledige co-lokalisatie resulteert in punten geclusterd rond een rechte lijn, waarvan de helling weerspiegelt de verhouding van de fluorescentie van de twee kleuren. Integendeel, gebrek aan co-lokalisatie resulteert in de verdeling van punten in twee afzonderlijke groepen (verdeeld langs de assen), elk met verschillende signaalniveaus van de ene kleur met weinig of geen signaal van de andere kleur. Pearson's coëfficiënt waarde varieert van 1 tot -1, met 1 staan voor volledige positieve correlatie, -1 voor een negatieve correlatie en nul die geen correlatie aangeeft. Als alternatief kan de Pclc-methode worden gebruikt. Deze methode is toegepast in een verscheidenheid van straling (zie36 voor details en vrij beschikbare methode).

Figure 5
Figuur 5: Colokalisatieanalyse.
Door verschillende antilichamen tegen verschillende soorten te gebruiken (hier kunnen anti-muis γH2AX (rood) en anti-konijn 53BP1 (groen)) verschillende eiwitten worden onderzocht. (A) Representatieve beelden worden getoond. DAPI geeft de kernen aan. Co-lokalisatie wordt gevisualiseerd door kleur en gebied overlap (hier rood + groen = geel). Schaalbalk = 5 μm. (B) Individuele en co-localiserende foci kunnen individueel worden gekwantificeerd met behulp van een van de verschillende software (hier, CellProfiler, zie andere opties in de hoofdtekst) en uitgezet. i-iii) Objectgebaseerde benaderde wordt gebruikt om colokalisatie (iv) Correlatieresultaten te bepalen die zijn verkregen voor colokalisatie, met behulp van een pixelgebaseerde benadering (ICCB-analyse). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende informatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analyse van de timing en efficiëntie van DNA schade reparatie door microscopie is essentieel gebleken om te begrijpen hoe de DNA-reparatie machines functioneren, in normale cellen en in menselijke pathologieën zoals kanker.

De ontwikkeling van specifieke antilichamen die detectie van actieve eiwitten in hun fosforyleerde versie mogelijk maken (zoals γH2AX, pRPA, pRAD50 en anderen10,23,39,43) heeft een centrale rol gespeeld bij het verkrijgen van een beter begrip van dna-reparatietiming van gebeurtenissen en de synchronisatie ervan met de celcyclus. Dit succes wordt geïllustreerd door de analyse van 53BP1 fosforyleerde residuen, door massaspectrometrie en immunolokalisatie (zie32 ter beoordeling), wat heeft bijgedragen tot het begrijpen van de functie van dit sterk gemodificeerde eiwit. Met de stijging van hoge resolutie microscopische techniek zoals STORM en toegenomen gebruik van kleine antilichamen (nanobodies) directe eiwit interactie in cellen wordt steeds toegankelijker en nauwkeuriger. Indirecte immunofluorescentie zoals hier beschreven blijft echter een essentieel experiment om uit te voeren bij het onderzoeken van een nieuw potentieel DNA-hersteleiwit en op zoek naar timing van actie- en eiwitpartners.

Het succes van indirecte immunofluorescentie berust volledig op twee criteria: i) de kwaliteit van reagentia – vooral antilichamen die worden gebruikt om fosforresiduen op geactiveerde DNA-hersteleiwitten op te sporen, en (ii) de timing van het experiment. Het gebruik van gepubliceerde protocollen en antilichamen moet worden aangemoedigd indien beschikbaar. Bij het gebruik van een nieuw antilichaam of het onderzoeken van een nieuw eiwit moet het antilichaam worden gevalideerd en moet specificiteit worden vastgesteld door ofwel het doeleiwit in cellen omver te werpen (het signaal moet verloren gaan) of eiwituitputting (gebruik van gezuiverd eiwit om specifieke antilichamen uit te putten vóór incubatie, zoals uitgevoerd in44 voor RAD51AP1).

Optimale blokkeringsomstandigheden en verdunning van antilichamen moeten worden vastgesteld om artefacten en niet-specifieke kleuring te minimaliseren. Buffers zullen vers worden bereid en als nucleaire extractie wordt uitgevoerd, moet worden getimed om schadelijke kernen te voorkomen. Bij het onderzoeken van de reparatie-efficiëntie in menselijke cellen, kwantificering van nucleaire foci moet worden uitgevoerd, en de nucleaire extractie kan helpen bij het uitsluiten van cytoplasmatische eiwitten. Het kan echter nuttig zijn om de nucleaire extractiestap niet uit te voeren, bijvoorbeeld om te onderzoeken of een gemuteerd eiwit waarvan wordt vermoed dat het niet interageert met zijn cellulaire partner, niet overgaat naar de kern op DNA-schade.

Daarnaast is de kwaliteit van de beeldvorming van het grootste belang om ervoor te zorgen dat gegevens correct kunnen worden verkregen, geanalyseerd en nauwkeurige gegevens kunnen worden uitgezet. Parameters om te controleren voor zijn talrijk en omvatten: specificiteit van de primaire antilichamen, spectrum van excitatie van de gekozen fluoroforen (secundaire antilichamen), het beschermen van monsters tegen fotobleaching, de keuze van de steun voor het zaaien van cellen, goede bemonstering (minimaal 30 tot 300 kernen, afhankelijk van de vraag), en in sommige gevallen na de behandeling, zoals deconvolution of spectrale un-mixing. Indien mogelijk wordt geautomatiseerde beeldvorming van een volledige coverslip voorgesteld, waarmee duizenden cellen kunnen worden afgebeeld. Het betrekken van imaging specialisten, zoals een kernfaciliteit voorafgaand aan het opzetten van het experiment moet worden beschouwd als het zal sterk verbeteren van de kwaliteit van de resultaten.

Ten slotte, op basis van de gebruikte cellijnen, de uitgevoerde behandeling en de onderzochte eiwitten, kunnen basale niveaus van foci sterk variëren en resultaten moeilijk te interpreteren maken. Om deze reden is het belangrijk dat ruwe gegevens worden samengevat, verwerkt, geanalyseerd en gepresenteerd in een effectief formaat in een licht dat lezers kunnen begrijpen; het faciliteren van vergelijking en het onthullen van trends en relaties binnen de data. In figuur 4Bwordt dezelfde kwantificering van foci in drie afzonderlijke versies uitgezet: i) het totale aantal foci (wolkenplot) na DSB's veroorzaakt door bestraling (ii) inductie van foci in de tijd -kinetiek- iii) % van de positieve cellen (>10 foci/nucleus).

Cloudplots hebben waar mogelijk de voorkeur(figuur 4B (i)) omdat ze alle gegevenspunten zonder discriminatie weergeven en zo het meest uitgebreide overzicht van het experiment bieden. Het plotten van meer selectieve en relevante informatie, zoals het aantal positieve cellen boven een willekeurige afgesneden achtergrond (5 foci in de meeste cellijnen), het aantal foci co-localizing, foci inductie na verloop van tijd, of kwaliteitsmeting van de foci, zoals pixelgrootte of intensiteit, kan in sommige gevallen meer geschikt zijn, en is de verantwoordelijkheid van de auteurs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de San Antonio Area Foundation. Het Mays Cancer Center wordt ondersteund door NCI kankercentrum ondersteuning kern subsidie P30 CA054174. We willen Stephen Holloway bedanken voor zijn hulp bij het inkopen van de reagentia, en het Sung laboratorium voor het verstrekken van ruimte en microscopie capaciteit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600 (2015).
  2. Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance. Cancers (Basel). 11 (7), (2019).
  3. Oh, J., Symington, L. S. Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity. Genes (Basel). 9 (12), (2018).
  4. Uziel, T., et al. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage. The EMBO Journal. 22 (20), 5612-5621 (2003).
  5. Lee, J. H., Paull, T. T. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Science. 308 (5721), 551-554 (2005).
  6. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).
  7. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Research. 36 (17), 5678-5694 (2008).
  8. Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. Histone H2AX in DNA damage repair. Cancer Biology & Therapy. 2 (3), 233-235 (2003).
  9. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-916 (1999).
  10. Stucki, M., et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell. 123 (7), 1213-1226 (2005).
  11. Lou, Z., et al. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals. Molecular Cell. 21 (2), 187-200 (2006).
  12. Chapman, J. R., Jackson, S. P. Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Reports. 9 (8), 795-801 (2008).
  13. Melander, F., et al. Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. Journal of Cell Biology. 181 (2), 213-226 (2008).
  14. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nature Review. Molecular Cell Biology. 9 (4), 297-308 (2008).
  15. Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
  16. Mehta, A., Haber, J. E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (9), 016428 (2014).
  17. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  18. Huertas, P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).
  19. Nimonkar, A. V., et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & Development. 25 (4), 350-362 (2011).
  20. Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature. 479 (7372), 241-244 (2011).
  21. Sturzenegger, A., et al. DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).
  22. Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation. DNA Repair. 32, 66-74 (2015).
  23. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  24. Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair. Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).
  25. Yun, M. H., Hiom, K. CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle. Nature. 459 (7245), 460-463 (2009).
  26. Sung, P., Klein, H. Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).
  27. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanisms of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).
  28. Jasin, M., Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (11), 012740 (2013).
  29. Dynan, W. S., Yoo, S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucleic Acids Research. 26 (7), 1551-1559 (1998).
  30. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  31. Cejka, P. DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination. Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 22931-22938 (2015).
  32. Mirman, Z., de Lange, T. 53BP1: a DSB escort. Genes & Development. 34, 7-23 (2020).
  33. Cao, L., et al. A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency. Molecular Cell. 35 (4), 534-541 (2009).
  34. Zimmermann, M., de Lange, T. 53BP1: Pro choice in DNA repair. Trends in Cell Biology. 24 (2), 108-117 (2014).
  35. Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance. Cancers (Basel). 11 (11), (2019).
  36. Nikitaki, Z., et al. Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET). Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).
  37. Redon, C., et al. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Current Opinion in Genetics & Development. 12 (2), 162-169 (2002).
  38. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3 (8-9), 959-967 (2004).
  39. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
  40. Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7155-7160 (2009).
  41. Buisson, R., Masson, J. Y. PALB2 self-interaction controls homologous recombination. Nucleic Acids Research. 40 (20), 10312-10323 (2012).
  42. Belotserkovskaya, R., et al. PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1. Nature Communications. 11 (1), 819 (2020).
  43. Betts, J. A., et al. Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage. American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).
  44. Dray, E., et al. Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).

Tags

Biologie Kwestie 160 Immunofluorescentie co-lokalisatie nucleaire foci bestraling-geïnduceerde foci DNA schade reparatie
Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de la Peña Avalos, B., Dray, E. … More

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter