Summary
DNA損傷の後、ヒト細胞はゲノムの完全性を回復するために不可欠な修復経路を活性化する。ここでは、DNA修復タンパク質を検出し、その空間的および時間的なリクルートメントを分析し、DNA損傷部位におけるタンパク質とタンパク質相互作用を問い合わせた手段として、間接的な免疫蛍光の方法を説明する。
Abstract
哺乳類の細胞は、常に化学物質、放射線、および自然発生する代謝副産物にさらされ、特定のタイプのDNA侮辱を引き起こす。遺伝子毒性物質は、DNA骨格を損傷したり、破壊したり、個々の塩基の化学的性質を改変したりする可能性があります。DNAの侮辱に続いて、DNA損傷応答(DDR)経路が活性化され、修復に関与するタンパク質がリクルートされる。損傷の種類を感知し、適切な修復応答を活性化する要因の多くが関与しています。DDR因子を正しく活性化して採用しないと、ゲノム不安定性を引き起こし、癌を含む多くのヒト病理の根底にあります。DDRタンパク質の研究は、遺伝子毒性薬物応答および薬剤耐性の細胞メカニズムに関する洞察を提供することができる。
インビボでタンパク質を可視化する方法は、直接観察、対象タンパク質を蛍光タンパク質でタグ付けし、それをライブイメージングでフォローすること、または固定サンプル上の間接的な免疫蛍光を得る方法です。蛍光タグ付きタンパク質の可視化により、時間の経過とともに正確なモニタリングが可能になりますが、N-またはC末語で直接タグ付けすると、タンパク質の局在や機能が妨げられる可能性があります。それらの未修飾のタンパク質の観察は、内因性のバージョンが好ましい。DNA修復タンパク質をDNA侮辱にリクルートすると、その濃度は局所的に増加し、特定の抗体を用いた間接的な免疫蛍光によって可視化できるグループ(病巣)を形成します。
タンパク質病巣の検出は直接的な相互作用の決定的な証拠を提供するものではありませんが、細胞内のタンパク質の共局在化は、それらが損傷部位に再グループ化し、複雑な形成に必要なイベントのシーケンスを知らせることができることを示しています。タンパク質の野生型または変異型を発現する細胞における病巣空間的重複の注意深い分析は、DNA修復機能に重要な機能的ドメインに関する貴重な手がかりを提供することができる。最後に、タンパク質の共同局在化は、細胞内の共免疫沈降法によって検証できる可能性のある直接的な相互作用、または精製されたタンパク質を用いた直接プルダウンを示す。
Introduction
ヒト細胞は、様々な起源の様々なDNA損傷剤に常に曝露されています。外因性源は主に放射線、化学物質(化学療法剤および抗生物質を含む)、ウイルスへの暴露で構成され、主な内因性源にはDNA複製および酸化ストレスの誤りが含まれる。遺伝子毒性暴露の直接的な影響は、ストレスおよび暴露用量に応じて、修飾された塩基から潜在的に致死的なDNA二本鎖破断(DSB)まで及ぶ。最終的には、修復されていないか、誤って修復されたDNA損傷は、突然変異の蓄積、ゲノムの再配置、ゲノム不安定性を引き起こし、最終的に発癌につながる1。哺乳類細胞は、特定の種類のDNA損傷を認識する複雑な経路を進化させ、,細胞周期の進行と同期して、それらをタイムリーに修復しました。
電離放射線(IR)はDNA二重らせんを損傷し、DNA損傷の最も有害な形態の1つである二本鎖破断(DSB)を生み出します。MRN(MRE11、RAD50、NBS1)複合体はDNAのセンサーとして機能し、変異したプロテインキナーゼ運動失調症(ATM)4,5,5を活性化する。DNAによってATMの最初の活性化に続いて、ATMは、キーイベント、ヒストンバリアントH2AX6のリン酸化を開始し、休憩の部位でDDRイベントのカスケードをトリガします。残基S139上のH2AXリン酸化は、それをγH2AXに活性化し、DNA病変66、7、8、97,8,の周りのメガベースまでの領域に広がる。このイベントはDNAのアクセシビリティを高め、他のDNA修復タンパク質の募集と蓄積につながる7.γH2AXは、DSBを取り巻く豊富かつ特異的に誘導されるため、特定の抗体を用いて容易に可視化することができ、DNA修復分野におけるDSBの代理マーカーとして一般的に使用されています。破断がシグナル化されると、細胞はDNA修復経路を活性化し、DNA損傷を処理します。タンパク質MDC1(DNA損傷チェックポイントタンパク質1のメディター)はγH2AX1010に直接結合し、ATM11とまたNBS111,13,13と相互作用する。これは、DSB で MRN 複合体の濃度を増加し、正の ATM フィードバック ループを発生させることに貢献します。γH2AXは、ブレークが修復されると迅速に除去され、結果的に、DSBクリアランスのモニタリングが可能となる。顕微鏡検査が続き、時間の経過とともにγH2AXの減少は、残留破断およびDNA修復効率の間接的な測定を提供する。
真核細胞は、いくつかの経路によってDSBを修復することができ、2つの主なものは非相同のエンドコング(NHEJ)と相同組換え(HR)である(図1)。NHEJは本質的に拡張相同性を使用せずにDNA二本鎖末端をリリューションし、細胞周期14、15,15を通して動作する。HRはSおよびG2段階において優勢となり、それ以外は、修復14、16のための相同のテンプレートとして姉妹クロマチを必要とするため、16抑圧される。NHEJとHRの間の経路選択は、姉妹クロマチドの物理的近接性に依存するだけでなく、NHEJを阻害するDNA末端切除17の延長にも依存する。
相同性依存性DSB修復は、ブレークエンドからの5'鎖のヌクレオ分解によって開始され、3'一本鎖DNA(ssDNA)尾部を生成し、5'-3'切除と呼ばれるプロセスである。MRN複合体は、DNA末端切除を開始し、さらに切除はBLM/EXO1(ブルームシンドロームタンパク質/エキソヌクレアーゼ1)またはBLM/DNA2(DNA複製ATP依存性ヘリカーゼ/ヌクレアーゼ)18、19、20、21、22と組み合わせて処理される。18,19,20,21,22DNA末端切除は、MRN複合体23との直接的相互作用およびBRCA1(乳癌タイプ1感受性タンパク質)24,25,25の採用を通じてCtIP(CtBP相互作用タンパク質)によって増強される。23複製タンパク質A(RPA)は、露出したssDNAに速やかに結合し、次いでリコンビナーゼタンパク質RAD51によって変位して、相同の探索と鎖浸潤を触媒する核タンパク質フィラメントを形成する26、27、28。27,2826
切除の開始は、修復経路選択のための重要なステップです。切除が開始されると、DNA末端はKu70/Ku80ヘテロ二量体(NHEJ経路の成分)による結合のための貧弱な基質となり、細胞はHR17、29、3029,30にコミットされる。17Ku70/Ku80ヘテロダイマーはDSB末端に結合し、DNA-PKcsおよびp53結合タンパク質1(53BP1)29,30をリクルートする。29,3053BP1はG1における切除障壁として機能し、NHEJ31,32を促進しながらHRを遮断するが、S32相でBRCA1依存的に除去され、結果的に切除が33、34,34に起こることを可能にする。したがって、53BP1とBRCA1はDSB修理において反対の役割を果たし、53BP1はNHEJファシリテーターであり、BRCA1はHRを通じて修理するための休憩を可能にします。
研究室では、DSBの形成は、電離放射線(IR)によって誘導することができる。この例では、4 Gy、1 Gy、2 Gyの高用量を利用して、大量のDSBを作成し、豊富なタンパク質による病巣形成の分析に適しています。使用される放射線の種類と線量は、DNAおよび細胞内の異なる病変につながる可能性があることに注意することが重要です:IRはDSBを誘導する一方で、一本鎖の破断または塩基修飾を引き起こす可能性があります(照射線形エネルギー伝達(LET)およびDNA損傷の種類に関する参照については、35,36を参照してください)。35,イオン化放射線誘発病巣(IRIF)形成の運動学及びそれらのクリアランスを決定するために、活性化されたDDR8、9、37、38の損傷および8,9,37逆転の修復を38示す、病巣形成は、電離放射線後の異なる時点で監視することができる。全ての主要DNA損傷タンパク質の活性化とクリアランスのタイミングは39と知られており、多くは主要事象の代理マーカーとして調査されている。例えば、切れ切除の代理としてssDNAに対して高い親和性を有するpRPA、MRNタンパク質(MRE11、RAD50、NBS1)およびエキソヌクレアーゼも切除効率を評価するために使用することができる。RAD51、BRCA1、BRCA2(乳癌タイプ2感受性タンパク質)、およびPALB2(BRCA2のパートナーおよびローカライザー)をモニタリングしてHR効率を評価できるが、Kuタンパク質または53BP1の存在は、NHEJのマーカーとして使用されている(図1)。
DNA修復機械のタンパク質が互いに破断をリクルートし、超複合体で組み立てると、DNAタンパク質とタンパク質タンパク質相互作用は、時間の経過とともに個々の局在化に従い、タンパク質の共局在化を分析することによって推測され、細胞4040、41、4241,42の重複するシグナルによって視覚化される。細胞株では、ゲノム編集またはプラスミドベースの変異体の過剰発現による特定のDNA修復遺伝子における点突然変異または欠失の導入により、特定の残基の調査が可能であり、DNA損傷の認識におけるその可能な役割(例えば、γH2AXとの共局在化)または複雑なアセンブリ(別のタンパク質または複数のタンパク質との共局在化)、ならびにDNA修復への影響を可能にする。ここでは、時間の経過に伴うγH2AX病巣に従ってDSBの形成と分解能を調べるため、間接免疫蛍光を用いる。また、DSB修復における主要なプレーヤーによる病巣形成および共局在化分析の一例を提示する:p53結合タンパク質1(53BP1)32。32前述のように、53BP1は、DNA修復経路選択の中心と考えられている。53BP1蓄積およびγH2AXとの共局在化に続いて、細胞周期相、DNA損傷蓄積、およびDSBsの修復に使用される経路に関する貴重な情報を提供する。間接免疫局在化の目的は、細胞株中のDNA損傷修復の効率を評価することであり、この研究ではIRに続く、または細胞内の様々なストレスにさらされた後、DNA架橋から複製フォークの閉塞まで(DNA損傷剤のリストを表1に提供する)
図1:DNA二本鎖切断(DSB)修復経路。
DSB修復には、相同組換え(HR、左)と非相同端結合(NHEJ、右)の2つの主要経路が含まれます。破断後、タンパク質は、ブレーク(γH2AX)をマークするために活性化され、末端切除(MRN)に参加し、切除されたssDNA(pRPA)をコーティングし、組み換えを促進する(BRCA1、PALB2、BRCA2、RAD51)、または切除を制限し、NHEJ(53BP1)を促進する。他のタンパク質は損傷修復に関与するが、リストされているタンパク質は日常的に間接的な免疫蛍光が続いている。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| DNA損傷剤 | 作用機序 | 推奨用量 |
| γ線/X線 | 放射線 制御されていない細胞効果を持つ二本鎖破断の形成 |
1-4 Gy |
| 36アルイオン | 放射線 二本鎖破断の形成 |
270 keV/μm |
| α粒子 | 放射線 二本鎖破断の形成 |
116 keV/μm |
| ブレオマイシン | DNA合成阻害剤 | 0.4-2 μg/mL |
| カントーテシン | トポイソメラーゼIの阻害剤 | 10-200 nM |
| シスプラチン | アルキル化剤 (イントラストランドクロスリンクを誘導する) |
0.25-2 μM |
| ドキソルビシン | インターカラット トポイソメラーゼIIの阻害剤 |
10-200 nM |
| エトポサイド | トポイソメラーゼIIの阻害剤 | 10 μM |
| ヒドロキシウレア | DNA合成阻害剤 (リボヌクレオチド還元性による) |
10-200 μM |
| メチルメタンスルホン酸 | アルキル化剤 | 0.25-2 mM |
| マイトマイシン C | アルキル化剤 | 0.25-2 μM |
| 紫外線(UV)ライト | チミジン二量体の形成 (DNA鎖の歪みを発生させる) |
50-100 mJ/cm2 |
表1: 遺伝子毒性剤.DNA損傷剤の例は、それらの作用機序および示唆された作業集中に基づいて誘発される損傷である。
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Protocol
1. HeLa細胞培養
- 16-18時間50°Cで1 M HClで丸いガラスカバーリップを事前に扱います。ddH2Oでリンスし、100%EtOHで保管してください。
- 細胞培養培地を調製する:DMEM培地に10%(v/v)FBSを加える。
- 37 °Cで18 mmの丸いガラスカバースリップを持つ無菌12ウェルプレートで4.0 x 10 4細胞/ウェルを成長させ、加湿インキュベーターで5%CO2を栽培します。280%の合流率(約24時間)に細胞を成長させます。
2. 放射線による細胞処理(IR)
- 二本鎖破断の形成を誘導するには、細胞を4Gyγ照射(対照:照射なし、t=0)に曝露する。ガンマセル-40では、これは毎分0.815 Gyで4.54分に相当します。
- 適切な時間長さ(ここで選択した時間ポイントt=1、2、4、16時間)の加湿インキュベーターで37°Cおよび5%CO2 の細胞をインキュベートする。
3. 核抽出と細胞固定
- ストックソリューションを準備する:0.2 Mパイプ(pH 6.8)、5 M NaCl、2 M2スクロース、1 M MgCl 2、0.1 M EGTA(pH 8.0)。
- 核抽出バッファー(NEB)を準備する:10 mM PIPES(pH 6.8)、100 mM NaCl、300 mMスクロース、3 mM MgCl2、1mM EGTA(pH 8.0)、0.5%(v/v)トリトンX-100をddH2に溶解するまで溶解します。2
- 4%(v/v)パラホルムアルデヒド(PFA)を調製する:16%PFA水溶液の10 mLを30 mL PBSに溶解する。完全に溶解するまで混ぜます。
- 適切な時点(t=0,1,2,4,16h)で、細胞を1mLのPBSで2回洗浄する。PBS を完全に削除します。
- 細胞核抽出のために各ウェルに200μLのNEBを加える(細胞質は分解され、核だけが残る)(図2)。室温で2分間インキュベートし、完全に取り除きます。
注:2分を超えないようにしてください。
図2:核抽出
核抽出前(左)とポスト(右)の細胞の代表的な画像。細胞質は消化されるべきであるが、核構造は抽出後もそのまま残すべきである(右)。(A) 20倍の倍率。スケールバー= 20 μmと(B)40倍の倍率;スケールバー= 10 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- PBSの1 mLで細胞を洗浄します。PBS を完全に削除します。PBSを慎重に追加し、細胞はこのステップで非常に壊れやすいです。
- 細胞固定のために各ウェルに4%(v/v)PFAの200 μLを加える。4°Cで10分間インキュベートする。 PFA を完全に削除します。
- PBSを1 mL追加します。
メモ:細胞は4°CでPBSに保存することができます。
4. 免疫蛍光染色
- ブロッキング溶液を準備する:PBSで5%BSA(w/v)を溶解し、0.3%(v/v)Triton X-100を追加します。完全に溶解するまで混ぜます。
- 希釈バッファーを準備する:PBSで1%BSA(w/v)を溶解し、0.3%(v/v)トリトンX-100を追加します。完全に溶解するまで混ぜます。
- ブロックの場合は、各ウェルに200 μLのブロッキングソリューションを追加します。室温で2時間、または4°Cで16〜18時間インキュベートする。
注:ヤギ抗体を使用する場合は、ブロッキング溶液に5%のヤギ血清を加えます。 - 希釈緩衝液中の希薄な一次抗体(1:500;抗体リストについては 表2 参照)及びボルテックスが十分に混合されるまで。
注:ヤギ抗体を使用する場合は、希釈バッファーに1%ヤギ血清を加えます。 - 湿度/インキュベーションボックスに、パラフィルムを付着します。10 μLの一次抗体を追加します(1つのドロップで)。カバースリップの 1 つのエッジをドロップに合わせ、ゆっくりとパラフィルムの上に下げて、液体が全体に広がるようにします(可能であれば泡を避けてください)。室温で2時間インキュベートする。
- PBSで1分間カバースリップを3回洗います。
- 希釈緩衝液中の二次抗体(最終濃度:2 μg/mL)とボルテックスを十分に混合するまで希釈した。
- 一次抗体について説明したとおりに10μLの二次抗体を適用する。室温で2時間インキュベートする。
メモ:光から保護します。
| 抗体 | 会社 | 参照 | ソース |
| 53BP1 | セルシグナリング | 4937 | ウサギ |
| アンチマウスIgG H&L (アレクサ・フルーター 647) | アブカム | ab150103 | ロバ |
| アンチホスホヒストンH2A.X(Ser139)、クローンJBW301 | ミリポア | 05-636 | マウス |
| アンチラビットIgG H&L (アレクサフルーオール488) | アブカム | ab150081 | ヤギ |
表2: 使用する抗体.本研究で用いた抗体のリスト
- PBSで1分間カバースリップを3回洗います。
- H2 Oで2カバーリップを1分間洗います。
- DAPIを用いたカウンターステインDNA:300 nM DAPIの10μL(抗体について説明する)を適用し、室温で30分間インキュベートし、グリセロールベースの取り付け媒体でガラススライドに取り付けます。あるいは、DAPIを含む市販のアンチフェードマウントメディアを1滴(10μL)スライドに追加し、カバースリップを適用します。カバースリップを軽く押し、ペーパータオルで周囲の余分な液体を取り除きます。
- 透明なマニキュアでカバーリップをシールし、20分間乾燥させます。
- スライドは4°Cで保存します。
5. 画像の取得
- 60x対物レンズに浸漬油を一滴入れます。DAPI を使用して、アイピースを介して核を見つけます。
- XYZ画像取得の場合、取得ソフトウェアを開き、パラメータを選択: スキャナタイプ: ガルヴァーノ;スキャナモード:往復;画像サイズ:512×512;PMT モード: VBF;PMT平均:フレーム(4回);PMT シーケンシャル スキャン: 行。
- 染料と検出器を選択します。
チャネル (CH1),染料(DAPI),検出器 (SD1)
チャネル (CH2), 染料 (アレクサフルーター 488), 検出器 (HSD3)
チャンネル(CH3)、染料(アレクサフルーター647)、検出器(HSD4) - 「Z」で [オン ]を選択します。
- ライブ画像を調整します。ライブウィンドウのライブボタンを押します。
- フォーカスを調整し、レーザー強度(%)、感度(HV)、ゲイン、オフセットを「PMT」ツールウィンドウで調整します。
- レーザー強度(%)を調整:明るさと漂白のために。レーザー強度が高いほど信号は強くなりますが、検体は光漂白剤になります。
- 感度(HV):ノイズレベルを調整します。HVが高いほど信号は強くなりますが、高すぎると画像が騒がれになります。
注:常に電圧を一定に保ちます。 - オフセットを調整します: 背景レベル。
- Z スタックの 開始/終了 (15 スライス) を選択します。
- フォーカスを調整し、レーザー強度(%)、感度(HV)、ゲイン、オフセットを「PMT」ツールウィンドウで調整します。
- 取得を開始します。
- 画像を保存するフォルダを選択します。 LSMのスタート ボタンを押して、画像の取得を開始します。 [シリーズ完了 ]ボタンを押して、画像の取得を完了します。
6. データ分析
- 画像解析の場合は、解析ソフトウェアを開きます。
- [バッチ]ツール ウィンドウを押し、分析する画像を選択して、出力フォルダを選択します。
- [解析] ツール ウィンドウを押して[投影]を選択します(15 スライスからの最大強度投影が表示されます)。
- [ 入出力の設定] で、作成するバッチを選択します。
- 処理する画像を処理するには、[ 処理] を押します。
- イメージを .tiff ファイルとしてエクスポートします。
- 核病巣定量の場合は、CellProfiler を開きます。
- γH2AX および 53BP1 病巣定量パイプラインを開きます ( 補足情報を参照)。
- テーブルソフトウェアを使用したグラフデータ。
- 共同ローカリゼーション分析の場合は、CellProfiler を開きます。
- 共局在パイプラインを開きます ( 補足情報を参照)。スプレッドシート ファイルが作成され、希望の場所に保存されます。ただし、グラフ自体は自動的に保存されません。結果を記録するために、ウィンドウのスナップショットを作成することをお勧めします。
- テーブルソフトウェアを使用したグラフデータ。
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Representative Results
2日目、または24時間ポストシード細胞をカバースリップに当てはめ、細胞は1つの分裂を受け、80%コンフルエントである。DNA修復タンパク質の特定のノックダウンまたは突然変異は、倍増時間を増加させるか、または細胞を遺伝子毒性治療に感作することができ、それに応じて播種密度と治療用量を調整する必要があります。最良の働き条件を決定するために、時間の経過とともにγH2AXのウェスタンブロッティングによってDNA損傷応答のタイミングを確立することができ、そして、照射に対する感受性は、コロニー形成アッセイによって同定することができる。
照射で処理されない細胞は、ほとんど、もし存在するならば、γH2AX病巣を示さない(図3A)。しかし、γH2AX病巣形成は、増殖条件に固有の様々なストレスによって培養細胞において引き起こされ得る:酸性化培地にコンフルエントに残された細胞、FBS中の遺伝子毒性内毒素の存在、培養に用いられる酸素濃度、をいくつか挙げる。
図3:ストレスのない核病巣
外部ストレッサーがない場合、γH2AX病巣が観察される場合は非常に少ない(A)。必須のDNA修復タンパク質がない場合、内因性源(B)による破断が起こるようにγH2AX蓄積が観察される。未修復の破断の蓄積は、細胞が「固体」γH2AX核染色(C)によってマークされる前アポトーシスになる可能性があります。スケールバー= 5 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
また、BRCA1やBRCA2変異型細胞などの主要なDNA損傷タンパク質BRCA2に対して枯渇した細胞では、内因性ストレスの結果として生じるDNA切断は、野生型細胞のように修復されず、蓄積されます。その結果、γH2AXの上昇は、正常な増殖条件においてもHR欠損細胞で観察され得る(図3B)。細胞のサブ集団はγH2AXで「固体」核染色を示すことができる(図3C)。汎核染色は、細胞が修復を超えた損傷で圧倒され、および/またはアポトーシス前であることを示すことができます。このような細胞は、典型的には、拡大した核、および細胞質の空胞体の存在によって特徴付けられる。さらに、γH2AXは、S相および停滞した複製フォークの複製ストレス、またはG2/Mの逮捕によって引き起こされる可能性があります。必要に応じて、細胞周期相は、DNA含有量を染色するか、特定のマーカーで共染色することによって同定することができる。DNA損傷修復解析を行う場合、汎核は個別化された病巣とは独立して定量化することができる。
照射後、核はγH2AXが非常に急速に局地化する多くの二本鎖破断を示す(図4)。最適な条件では、照射の不在時にγH2AX病巣が認められる場合はほとんどない。照射後、γH2AX病巣の形成が急激に増加する。破断が処理され修復された場合、核あたりの病巣数が減少し、病巣に陽性の細胞数が減少する。病巣の強度と数は、使用される細胞株および照射量によって異なる。低い通路HeLa細胞では、内毒素を含まない血清で増殖し、1〜2時間の間にピークを迎える30分および1時間の照射で病巣の急激な増加を日常的に観察し、その後16時間まで徐々に減少する。このため、0、1、2、4、16時間の照射後の代表的な時点がここでは提示される。破断シグナル伝達、修復、および照射に対する生存の挙動は、細胞株間、ならびに遺伝子の枯渇または突然変異時に大きく異なる可能性がある。このため、最も適切な時間ポイントは実験と細胞依存です。実験では、16時間でγH2AX残留病巣は非照射細胞と同じ基底レベルに達している。ゆっくりと細胞の線を分割する場合は、後の時点を含むように残留病巣を監視することが推奨されます。
図4:ストレス後の核病巣と定量化(時間経過)。
γH2AX病巣形成はt=0(照射なし)で、照射後の時点(4Gy,t=1,2,4,16h)で示された時点での形成である。(A)代表的な画像が表示されます。DAPI は核を示します。スケールバー= 5 μm(B)γ照射への曝露後のγH2AXの核病巣を、各時点の≥100核中の自動定量(CellProfiler)により採点した。生物学的な問題と取得したデータの種類に応じて、比較と批判的な理解を容易にするために、生データを提示するためのさまざまなオプションが利用可能です。(i)雲プロットは、平均±SDを示す。シンボル(*)は、学生の2つの尾のt検定を使用して、制御に対する統計的有意性を示す:***p ≤ 0.0001、(ii)誘導曲線は、平均±SEM、(iii)核当たり10個以上の病巣を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
逆に、DNA損傷修復機能に欠損した細胞では、γH2AX病巣は照射がない場合に蓄積し(t=0h)、修復が遅れたり、長時間の時点(t=16h、t=24h)の後照射でも存在しなかったりする。野生型と変異型細胞の直接的な比較は、変異した遺伝子のDNA修復機能に関する貴重な情報を与え、修復の種類を示唆することができる。NHEJの欠乏は、S相でHRによって修復される休憩を強制することができますが、切除され、HRによって修復されなければならないDSBは、NHEJによって修復されません。このため、S相後の損傷の蓄積はHR欠乏症を示し、NHEJ欠陥に対する高いγH2AXレベルポスト分割のヒントを示す可能性がある。
同じ細胞内で複数のタンパク質を調べると、異なる動物種で一次抗体を多重化し、それぞれ異なるフルオロフォアで標識された二次抗体を用いてこれらを明らかにすることによって、共局在化を検討することができる(図5)。共局在化は、タンパク質(i)がブレーク(ii)にリクルートされたかどうかをタイムリーに募集し、(iii)DNA修復複合体で組み立てるかどうかを示す。共局在化を探す場合、一般的に受け入れられている定性的な方法は、異なるチャンネル(すなわち、緑と赤)の単純なオーバーレイとして結果を提示することです。緑と赤の重ね合わせは、対象となる2つのタンパク質が同じピクセルに存在する黄色のホットスポットを生じさせます(図5A)。しかし、この方法には限界があり、両チャネルで収集される相対信号強度に依存するため、2つのフルオロクロムは信号強度に差がある可能性がある。したがって、オーバーレイメソッドは、共局在化イベントの視覚的な推定を生成するのに役立ちますが、定量的な目的には適していません。共局在化の定量分析は、オブジェクトベースのアプローチ(図5B(i-iii) または強度相関係数ベース(ICCB)分析を行う統計アプローチ(図5B(iv))) によって達成することができる。JACoP(ジャスト・アナザー・コローカリゼーション・プラグイン;https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html)や、ここで利用される「共局化」パイプライン(CellProfiler)など、蛍光強度の関係を評価するためにICCBツールとして使用できる、共局化分析用のツールがいくつか用意されています。これは、主に2つの変数間の線形関係の強さを測定する相関係数(ピアソンの係数)を計算することによって行われます。蛍光共局在化は、1つのフルオロクロム(緑色)の強度が各ピクセルの第2の蛍光色(赤)の強度に対してプロットされる散布図でグラフィカルに表現することができる。完全な共局在化により、直線の周りに集まる点が得られ、その傾きは2色の蛍光の比を反映します。反対に、共局在性の欠如は、ポイントを2つの別々のグループ(軸に沿って分布)に分配し、それぞれが他の色からの信号をほとんどまたはまったく示さない1つの色の変化する信号レベルを示す。ピアソンの係数値の範囲は1~-1で、1は完全な正相関を表し、負の相関は-1、ゼロは相関がないことを示します。あるいは、Pclc法を使用することもできます。この方法は、さまざまな放射線に適用されています(詳細および自由に利用できる方法については36 を参照)。
図 5: 共局化分析
異種(ここでは、抗マウスγH2AX(赤色)および抗ウサギ53BP1(緑色))に対して上げられたいくつかの抗体を用いることによって、いくつかのタンパク質を調べることができます。(A)代表的な画像が表示されます。DAPI は核を示します。共局在化は、色と領域のオーバーラップ(ここでは赤+緑=黄色)で視覚化されます。スケールバー= 5 μm(B) 個別および共局所化病巣は、いくつかのソフトウェア(ここではCellProfiler、メインテキストの他のオプションを参照)のいずれかを使用して個別に定量化し、プロットすることができます。(i-iii)ピクセルベースのアプローチ(ICCB分析)を使用して、共局在(iv)の相関結果を共局化して求めた結果を求めるために用いられるオブジェクトベースのアプローチ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
顕微鏡によるDNA損傷修復のタイミングと効率の分析は、正常細胞および癌などのヒト病理において、DNA修復機械がどのように機能するかを理解するために不可欠であることが証明されている。
リン酸化されたバージョン(γH2AX、pRPA、pRAD50など)で活性化タンパク質の検出を可能にする特異的抗体の開発(例えば、γH2AX、pRPA、pRAD50など10、23、39、43)23,39,43は、細胞周期とのDNA修復のタイミングと同期の理解を深める上で中心的な役割を果たしてきました。10この成功は、質量分析と免疫局在(レビューについては32を参照)による53BP1リン酸化残基の分析によって例示され、この重い修飾タンパク質の機能を理解するのに役立っています。STORMなどの高解像度顕微鏡技術の上昇と細胞内の小さな抗体(ナノボディ)直接タンパク質相互作用の使用の増加により、よりアクセスしやすく、正確になってきています。しかしながら、ここで説明する間接免疫蛍光は、新規の潜在的なDNA修復タンパク質を調査し、作用のタイミングとタンパク質パートナーを探す際に行う必要不可欠な実験である。
間接的な免疫蛍光の成功は、(i)試薬の品質、特に活性化されたDNA修復タンパク質のリンフォ残基を検出するために使用される抗体と(ii)実験のタイミングという2つの基準に完全に基づいています。公開されたプロトコルと抗体を使用することは、可能な場合に奨励されるべきです。新規抗体を使用する場合、または新規タンパク質を調査する場合、抗体を検証し、細胞内の標的タンパク質のノックダウン(シグナルを失うべき)またはタンパク質枯渇(RAD51AP1の44 で行われたように、インキュベーション前に特定の抗体を枯渇させる精製タンパク質の使用)のいずれかによって特異性を確立する必要があります。
最適なブロッキング条件と抗体希釈は、アーチファクトおよび非特異的染色を最小限に抑えるために確立されるべきである。バッファーは新鮮に調製され、核抽出が行われる場合は、核に損傷を与えないように時間を設定する必要があります。ヒト細胞の修復効率を調べ、核病巣の定量化を行う必要があり、核抽出は細胞質タンパク質の除外に役立ちます。しかし、核抽出工程を行わない方が有益であり、例えば、その細胞パートナーと相互作用しないと疑われる変異型タンパク質がDNA損傷時に核に転写されないかどうかを調べるのが有益である。
さらに、データを適切に取得、解析、正確なデータをプロットできるようにするためには、イメージングの品質が最も重要です。対照するパラメータには、一次抗体の特異性、選択された蛍光HORの励起スペクトル(二次抗体)、サンプルをフォトブリーチングに対する保護、細胞の播種支援の選択肢、良好なサンプリング(質問に応じて30〜300核の最小値)、場合によってはデコンボリューションやスペクトルアンミックスなどの後処理が含まれます。可能であれば、何千もの細胞をイメージングできるフルカバースリップの自動イメージングが推奨されます。実験を立ち上げる前にコア施設などのイメージングスペシャリストを巻き込むことで、結果の質を大幅に向上させると考えるべきです。
最後に、使用した細胞株、治療、および調査したタンパク質に基づいて、病巣の基底レベルが大きく変化し、結果を解釈することが困難になる可能性があります。このため、生データを、読者が理解できる光の中で、効果的な形式で要約、処理、分析、提示することが重要です。データ内の傾向と関係を比較し、明らかにすること。 図4Bでは、同じ病巣の定量が3つの別々のバージョンでプロットされています:(i)経時に病巣を誘導した後のDSB(ii)陽性細胞の病巣誘導(>10病巣/核)の合計数。
雲のプロットは、可能な限り好ましいと思われます (図 4B (i)) 彼らは、すべてのデータポイントを示すため、この実験の最も包括的な概要を提供します。しかし、任意の背景を超える陽性細胞の数(ほとんどの細胞株では5病巣)、病巣共局所化の数、経時の病巣誘導、またはピクセルサイズや強度などの病巣の品質測定など、より選択的で関連性の高い情報をプロットすることは、場合によってはより適切であり、著者の責任である。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作品は、サンアントニオ地域財団からの助成金によって支えられました。メイズがんセンターは、NCIがんセンターサポートコアグラントP30 CA054174によってサポートされています。スティーブン・ホロウェイが試薬を調達してくれたことに感謝し、宇宙と顕微鏡の能力を提供してくれたSung研究所に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059 | Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background. |
| Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) | Neuvitro | NC0308920 | Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol. |
| DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] | Gibco | 11965118 | Adjust the growing media to the needs of cell line used. |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | PBS for tissue culture. |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Research Products International | E57060 | Nuclear extraction buffer. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 104370028 | The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress. |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Research Products International | M24000 | Nuclear extraction buffer. |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Products International | P40150 | Nuclear extraction buffer. |
| SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | S36973 | 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead. |
| Sodium chloride (NaCl) | Research Products International | S23020 | Nuclear extraction buffer. |
| Sucrose | Research Products International | S24060 | Nuclear extraction buffer. |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | Polysine Slides can be used instead. |
| TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells | Costar | 3513 | Seeding on coverslips is done in 12-wells plate. |
| Triton X-100 | AmericanBio | AB02025 | Nuclear extraction buffer. |
| TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red | Gibco | 12604021 | Trypsin-EDTA can be used instead. |
| Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red | Gibco | 15400054 | TrypLE can be used instead. |
References
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