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Biology

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

doi: 10.3791/61447 Published: June 26, 2020

Summary

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Abstract

Säugetierzellen sind ständig Chemikalien, Strahlungen und natürlich vorkommenden metabolischen Nebenprodukten ausgesetzt, die bestimmte Arten von DNA-Beleidigungen erzeugen. Genotoxische Wirkstoffe können das DNA-Rückgrat beschädigen, es brechen oder die chemische Natur einzelner Basen verändern. Nach DNA-Beleidigung werden DNA-Schadensreaktionen (DDR) aktiviert und an der Reparatur beteiligte Proteine rekrutiert. Eine Vielzahl von Faktoren sind beteiligt, um die Art des Schadens zu erfassen und die entsprechende Reparaturreaktion zu aktivieren. Wenn DDR-Faktoren nicht richtig aktiviert und rekrutiert werden, kann dies zu genomischer Instabilität führen, die vielen menschlichen Pathologien einschließlich Krebs zugrunde liegt. Studien mit DDR-Proteinen können Einblicke in die genotoxische Arzneimittelreaktion und zelluläre Mechanismen der Arzneimittelresistenz liefern.

Es gibt zwei Hauptmethoden zur Visualisierung von Proteinen in vivo:direkte Beobachtung, indem das Protein von Interesse mit einem fluoreszierenden Protein getagt und ihm durch Live-Bildgebung oder indirekte Immunfluoreszenz auf festen Proben folgt. Während die Visualisierung fluoreszierender Proteine eine präzise Überwachung im Laufe der Zeit ermöglicht, kann die direkte Kennzeichnung in N- oder C-Terminus die Proteinlokalisierung oder -funktion beeinträchtigen. Die Beobachtung von Proteinen in ihrer unveränderten, endogenen Version wird bevorzugt. Wenn DNA-Reparaturproteine zur DNA-Beleidigung rekrutiert werden, erhöht sich ihre Konzentration lokal und sie bilden Gruppen oder "Foci", die durch indirekte Immunfluoreszenz mit spezifischen Antikörpern visualisiert werden können.

Obwohl der Nachweis von Proteinschwerpunkten keinen endgültigen Beweis für eine direkte Wechselwirkung liefert, weist die Kolokalisierung von Proteinen in Zellen darauf hin, dass sie sich an die Schadensstelle gruppieren und über die Abfolge der Ereignisse informieren können, die für eine komplexe Bildung erforderlich sind. Eine sorgfältige Analyse der räumlichen Überlappung von Brennpunkten in Zellen, die Wildtyp- oder mutierte Versionen eines Proteins exdrücken, kann wertvolle Hinweise auf funktionelle Domänen liefern, die für die DNA-Reparaturfunktion wichtig sind. Schließlich weist die Kolokalisierung von Proteinen auf mögliche direkte Wechselwirkungen hin, die durch Ko-Immunpräzipation in Zellen oder direkten Pulldown mit gereinigten Proteinen verifiziert werden können.

Introduction

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Menschliche Zellen sind ständig einer Vielzahl von DNA-schädigenden Wirkstoffen unterschiedlicher Herkunft ausgesetzt. Exogene Quellen bestehen hauptsächlich aus der Exposition gegenüber Strahlungen, Chemikalien (einschließlich Chemotherapeutika und einigen Antibiotika) und Viren, während die wichtigsten endogene Quellen Fehler bei der DNA-Replikation und oxidativem Stress umfassen. Die direkten Auswirkungen einer genotoxischen Exposition können je nach Stress und Expositionsdosis von einer modifizierten Basis bis hin zu einem potenziell tödlichen DNA-Doppelstrangbruch (DSB) reichen. Letztlich können nicht reparierte oder falsch reparierte DNA-Schäden zur Anhäufung von Mutationen, genomischen Umlagerungen, Genominstabilität und schließlich zu Karzinogenese1führen. Säugetierzellen haben komplexe Wege entwickelt, um bestimmte Arten von DNA-Schäden zu erkennen2,3 und reparieren sie rechtzeitig, synchronisiert mit dem Zellzyklusprogression.

Ionisierende Strahlung (IR) schädigt die DNA-Doppelhelix und erzeugt Doppelstrangbrüche (DSBs), eine der schädlichsten Formen von DNA-Schäden. Der MRN-Komplex (MRE11, RAD50, NBS1) fungiert als Sensor der DNA endet und aktiviert die Proteinkinase ataxia telangiectasia mutiert (ATM)4,5. Nach der ersten Aktivierung von ATM durch DNA-Ende löst ATM eine Kaskade von DDR-Ereignissen am Ort der Pause aus, die mit einem Schlüsselereignis die Phosphorylierung der Histonvariante H2AX6einlöst. Die H2AX-Phosphorylierung auf Rückstand S139 aktiviert sie in die Region H2AX und spannt Regionen bis zu Megabasen um die DNA-Läsion6,7,8,9. Dieses Ereignis erhöht die Zugänglichkeit der DNA, was zur Rekrutierung und Akkumulation anderer DNA-Reparaturproteine führt7. Da h2AX reichlich und spezifisch um d.B. heruminduziert ist, kann es mit spezifischen Antikörpern leicht visualisiert werden und wird häufig als Ersatzmarker für DSBs im DNA-Reparaturfeld verwendet. Sobald der Bruch signalisiert ist, aktivieren Zellen ihre DNA-Reparaturwege und verarbeiten die DNA-Schäden. Das Protein MDC1 (Mediator des DNA-Schadens-Checkpoint-Proteins101) bindet direkt mit AtM11 und auch mit NBS112,13. Es trägt dazu bei, die Konzentration des MRN-Komplexes am DSB zu erhöhen und eine positive ATM-Rückkopplungsschleife zu starten. H2AX wird nach der Reparatur des Bruchs schnell entfernt, so dass die DSB-Freigabe überwacht werden kann. Gefolgt von der Mikroskopie, bietet die Abnahme von H2AX im Laufe der Zeit eine indirekte Messung von Restbrüchen und DNA-Reparatureffizienz.

Eukaryotische Zellen können DSBs durch mehrere Wege reparieren, wobei die beiden wichtigsten nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und homologe Rekombination (HR)(Abbildung 1) sind. NHEJ liiert im Wesentlichen DNA-Doppelstrangenden ohne die Verwendung von erweiterter Homologie und arbeitet im gesamten Zellzyklus14,15. HR überwiegt in S- und G2-Phasen und wird ansonsten unterdrückt, da es ein Schwesterchromatid als homologe Schablone für die Reparatur14,16benötigt. Die Wahl des Weges zwischen NHEJ und HR hängt nicht nur von der physischen Nähe des Schwesterchromatids ab, sondern auch von der Ausdehnung der DNA-Endresektion17, die NHEJ hemmt.

Die homologieabhängige DSB-Reparatur initiiert durch nukleolytische Degradation des 5'-Strangs von den Bruchenden, um 3' einsträngige DNA-Schwänze (ssDNA) zu erzeugen, ein Prozess, der als 5'-3'-Resektion bezeichnet wird. Der MRN-Komplex initiiert die DNA-Endresektion und weitere Resektion wird in Kombination mit BLM/EXO1 (Bloom-Syndrom-Protein/Exonuklease 1) oder BLM/DNA2 (DNA-Replikation ATP-abhängige Helicase/Nuklease)18,19,20,21,22verarbeitet. Die DNA-Endresektion wird durch CtIP (CtBP-interagierendes Protein) durch seine direkte Interaktion mit dem MRN-Komplex23 und die Rekrutierung von BRCA1 (Brustkrebs Typ 1 Anfälligkeitsprotein)24,25verstärkt. Replikationsprotein A (RPA) bindet sich prompt an die ssDNA exponiert und wird dann durch das rekombinante Protein RAD51 zu einem Nukleoprotein-Filament verdrängt, das homologe Suche und Stranginvasion katalysiert26,27,28.

Die Einleitung der Resektion ist ein entscheidender Schritt für die Reparaturwegwahl. Sobald die Resektion eingeleitet wurde, werden die DNA-Enden zu schlechten Substraten für die Bindung durch Ku70/Ku80-Heterodimer (Komponente des NHEJ-Signalwegs) und Zellen werden HR17,29,30verschrieben. Der Ku70/Ku80 Heterodimer bindet an DSB-Enden und rekrutiert DNA-PKcs und p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 wirkt als Hemmungshindernis in G1 und blockiert damit HR beigleichzeitigerFörderung von NHEJ 31,32, wird aber in der S-Phase in BRCA1-abhängiger Weise entfernt, so dass eine Resektion33,34möglich ist. Daher spielen 53BP1 und BRCA1 bei der DSB-Reparatur eine gegensätzliche Rolle, wobei 53BP1 ein NHEJ-Moderator ist, während BRCA1-Akte Pausen für die Reparatur durch HR ermöglichen.

Im Labor kann die DSB-Bildung durch ionisierende Strahlung (IR) induziert werden. Während dieses Beispiel eine hohe Dosis von 4 Gy verwendet, 1 Gy und 2 Gy auch eine signifikante Menge an DSBs erstellen, geeignet für die Analyse der Foci-Bildung durch reichliche Proteine. Es ist wichtig zu beachten, dass die Art und Dosis der verwendeten Strahlung zu verschiedenen Läsionen in der DNA und in der Zelle führen kann: Während IR DSBs induziert, kann es auch einzelne Strangbrüche oder Base-Modifikation verursachen (siehe35,36 für einen Verweis auf bestrahlung lineare Energieübertragung (LET) und Art der DNA-Schäden). Um die Kinetik der ionisierenden strahlungsinduzierten Brennweite (IRIF) Bildung und deren Clearance zu bestimmen, die auf die Reparatur des Schadens und die Umkehrung der aktivierten DDR8,9,37,38hinweist, kann die Brennpunktbildung zu verschiedenen Zeitpunkten nach ionisierender Strahlung überwacht werden. Timing der Aktivierung und Clearance aller wichtigen DNA-Schäden Proteine ist bekannt39, und viele werden als Ersatzmarker für Schlüsselereignisse untersucht. Beispielsweise wird pRPA, das eine hohe Affinität zu ssDNA besitzt, als Ersatz für die Bruchresektion verwendet, MRN-Proteine (MRE11, RAD50, NBS1) und Exonukleasen können auch verwendet werden, um die Resektionseffizienz zu bewerten. Während RAD51, BRCA1, BRCA2 (Brustkrebs Typ 2 Anfälligkeitsprotein) und PALB2 (Partner und Lokalisierer von BRCA2) überwacht werden können, um die HR-Effizienz zu bewerten, wird das Vorhandensein der Ku-Proteine oder 53BP1 als Marker von NHEJ(Abbildung 1)verwendet.

Während sich Proteine der DNA-Reparaturmaschinen gegenseitig bis zum Bruch rekrutieren und in Superkomplexen zusammensetzen, können DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen abgeleitet werden, indem man ihrer individuellen Lokalisierung im Laufe der Zeit folgt und die Kolokalisierung von Proteinen analysiert, wie durch überlappende Signale in Zelle40,41,42visualisiert. In Zelllinien ermöglicht die Einführung von Punktmutationen oder das Löschen in bestimmten DNA-Reparaturgenen entweder durch Genombearbeitung oder durch Überexpression plasmidbasierter Mutanten die Untersuchung spezifischer Rückstände und ihre mögliche Rolle bei der Erkennung von DNA-Schäden (z. B. Kolokalisierung mit H2AX) oder komplexer Montage (Kolokalisierung mit einem anderen oder mehreren Proteinen) sowie deren Auswirkungen auf die DNA-Reparatur. Hier verwenden wir die indirekte Immunfluoreszenz als Mittel, um die Bildung und Auflösung von DSBs zu untersuchen, indem wir im Laufe der Zeit den H2AX-Brennpunkten folgen. Wir stellen auch ein Beispiel für die Foci-Bildung und Co-Lokalisierungsanalyse durch einen wichtigen Akteur in der DSB-Reparatur vor: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Wie bereits erwähnt, 53BP1 gilt als zentral für DNA-Reparatur-Pfad Wahl. Nach 53BP1 Akkumulation und seine Co-Lokalisierung mit H2AX liefert wertvolle Informationen über Zellzyklusphase, DNA-Schadensakkumulation, und Weg verwendet, um DSBs zu reparieren. Der Zweck der indirekten Immunlokalisierung besteht darin, die Effizienz der REPARATUR von DNA-Schäden in Zelllinien nach IR wie in dieser Studie oder nach Exposition gegenüber verschiedenen Belastungen in der Zelle von der DNA-Vernetzung bis zur Blockierung der Replikationsgabel zu bewerten (eine Liste der DNA-schädlichen Mittel ist in Tabelle 1enthalten).

Figure 1
Abbildung 1: DNA Double Strand Breaks (DSB) Reparaturwege.
Die DSB-Reparatur umfasst zwei Hauptwege: Homologe Rekombination (HR, links) und Non-Homologous End-Joining (NHEJ, rechts). Nach der Pause werden Proteine aktiviert, um den Bruch zu markieren (H2AX), an der Endresektion (MRN) teilnehmen, die resezierte ssDNA (pRPA) beschichten, die Rekombination fördern (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) oder die Resektion begrenzen und NHEJ (53BP1) fördern. Andere Proteine nehmen an der Schadensreparatur teil, aber die aufgeführten Proteine werden routinemäßig mit indirekter Immunfluoreszenz gefolgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DNA-schädigendes Mittel Wirkmechanismus Empfohlene Dosis
A-Strahlen/Röntgenstrahlen Strahlung
Bildung von doppelsträngigen Brüchen mit einigen unkontrollierten zellulären Effekten
1-4 Gy
36 Ar ionen Strahlung
Bildung von Doppelstrandedpausen
270 keV/m
•Partikel Strahlung
Bildung von Doppelstrandedpausen
116 keV/m
Bleomycin Inhibitor der DNA-Synthese 0,4-2 g/ml
Camptothecin Inhibitor der Topoisomerase I 10-200 nM
Cisplatin Alkylierungsmittel
(induzierenintrastrande Querverbindungen)
0,25-2 m
Doxorubicin Intercalating-Agent
Inhibitor der Topoisomerase II
10-200 nM
Etoposide Inhibitor der Topoisomerase II 10 m
Hydroxyurea Inhibitor der DNA-Synthese
(durch Ribonukleotid-Reduktase)
10-200 m
Methylmethansulfonat Alkylierungsmittel 0,25-2 mM
Mitomycin C Alkylierungsmittel 0,25-2 m
Ultraviolettes (UV) Licht Bildung von Thymidin-Dimeren
(Erzeugung von Verzerrungen der DNA-Kette)
50-100 mJ/cm2

Tabelle 1: Genotoxische Mittel. Beispiele für DNA-schädigende Mittel, deren Wirkmechanismus und der verursachte Schaden auf der Grundlage der vorgeschlagenen Arbeitskonzentration.

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Protocol

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1. HeLa Zellkultur

  1. Rundglasabdeckungen mit 1 M HCl bei 50 °C für 16-18 Stunden vorbehandeln. Mit ddH2O abspülen und in 100% EtOH lagern.
  2. Zellkulturmedium vorbereiten: 10% (v/v) FBS zu DMEM medium hinzufügen.
  3. 4,0 x 104 Zellen/gut in steriler 12-Well-Platte mit einem 18 mm runden Glasdeckel bei 37 °C und 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator anbauen. Wachsen Sie Zellen bis zu 80% Koninfluenza (ca. 24 Stunden).

2. Zellbehandlung mit Strahlung (IR)

  1. Um die Bildung von Doppelstrangbrüchen zu induzieren, setzen Sie die Zellen einer 4 Gy-Bestrahlung aus (Kontrolle: Keine Bestrahlung, t=0). In der Gamma-Zelle -40 entspricht dies 4,54 min bei 0,815 Gy pro min.
  2. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C und 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator für die entsprechende Zeitdauer (hier gewählte Zeitpunkte t=1, 2, 4, 16 h).

3. Kernextraktion und Zellfixierung

  1. Lagerlösungen vorbereiten: 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M Saccharose, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8,0).
  2. Nukleare Extraktionspuffer (NEB) vorbereiten: 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 3 mM MgCl2,1 mM EGTA (pH 8,0) und 0,5% (v/v) Triton X-100 in ddH2O. Mix vollständig auflösen.
  3. 4% (v/v) Paraformaldehyd (PFA) vorbereiten: 10 ml 16% PFA wässrige Lösung in 30 ml PBS auflösen. Mischen, bis vollständig aufgelöst.
  4. Zu einem geeigneten Zeitpunkt (t=0, 1, 2, 4, 16 h), Waschen Sie Zellen zweimal mit 1 ml PBS. Entfernen Sie PBS vollständig.
  5. Fügen Sie jedem Brunnen 200 L NEB für die Zellkernextraktion hinzu (Zytoplasma ist abgebaut, nur Kern restiert) (Abbildung 2). 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und vollständig entfernen.
    HINWEIS: Nicht mehr als 2 Minuten.

Figure 2
Abbildung 2: Kerngewinnung.
Repräsentative Bilder von Zellen vor (links) und Post (rechts) kernadierungsischer Extraktion. Zytoplasma sollte verdaut werden, aber die Kernstruktur sollte nach der Extraktion intakt bleiben (rechts). (A) 20-fache Vergrößerung; Skala bar = 20 m und (B) 40x Vergrößerung; Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Waschen Sie Zellen mit 1 ml PBS. Entfernen Sie PBS vollständig. Fügen Sie PBS sorgfältig hinzu, Zellen sind bei diesem Schritt sehr zerbrechlich.
  2. Fügen Sie jedem Bohrkörper 200 l von 4% (v/v) PFA für die Zellfixierung hinzu. 10 Minuten bei 4 °C inkubieren. Entfernen Sie PFA vollständig.
  3. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu.
    HINWEIS: Zellen können in PBS bei 4 °C gelagert werden.

4. Immunfluoreszenzfärbung

  1. Vorbereiten der Blockierlösung: 5% BSA (w/v) in PBS auflösen und 0,3% (v/v) Triton X-100 hinzufügen. Mischen, bis vollständig aufgelöst.
  2. Verdünnungspuffer vorbereiten: 1% BSA (w/v) in PBS auflösen und 0,3% (v/v) Triton X-100 hinzufügen. Mischen, bis vollständig aufgelöst.
  3. Zum Blockieren fügen Sie jedem Bohrwert 200 L Blockierlösung hinzu. 2 Stunden bei Raumtemperatur oder 16-18 Stunden bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Wenn Ziegenantikörper verwendet werden, fügen Sie 5% Ziegenserum zur Blockierlösung hinzu.
  4. Primären Antikörper im Verdünnungspuffer (1:500; siehe Tabelle 2 für Antikörperliste) und Wirbel bis gut gemischt verdünnen.
    HINWEIS: Wenn Ziegenantikörper verwendet wird, fügen Sie 1% Ziegenserum zum Verdünnungspuffer hinzu.
  5. In einer Feuchtigkeits-/Inkubationsbox ein Stück Parafilm aufkleben. Fügen Sie 10 L primären Antikörper hinzu (in einem einzigen Tropfen). Richten Sie eine Kante des Deckels mit dem Tropfen aus und senken Sie langsam auf den Parafilm, damit sich die Flüssigkeit im ganzen ausbreitet (Blasen vermeiden, wenn möglich). 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Waschen Sie Deckellipsen dreimal in PBS für 1 Minute.
  7. Sekundärantikörper im Verdünnungspuffer (Endkonzentration: 2 g/ml) und Wirbel bis gut vermischt verdünnen.
  8. Tragen Sie 10 L sekundären Antikörper n. A. auf, wie für die primären Antikörper beschrieben. 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Schützen Sie sich vor Licht.
Antikörper Unternehmen Verweis Quelle
53BP1 Zellsignalisierung 4937 Kaninchen
Anti-Maus IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150103 Esel
Anti-Phospho-Histon H2A. X (Ser139), Klon JBW301 Millipore 05-636 Maus
Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150081 Ziege

Tabelle 2: Verwendete Antikörper. Liste der in dieser Studie verwendeten Antikörper.

  1. Waschen Sie Deckellipsen dreimal in PBS für 1 Minute.
  2. Abdeckungen mit H2O 1 Minute waschen.
  3. Gegenfleck-DNA mit DAPI: 10 l 300 nM DAPI (wie für Antikörper beschrieben) auftragen, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann mit einem Glyzerin-basierten Montagemedium auf Glasschlitten montieren. Alternativ können Sie einen Tropfen (10 l) kommerzieller Antifade-Montagemedien, die DAPI enthalten, auf ein Schiebeblatt geben und einen Deckelzettel auftragen. Drücken Sie vorsichtig den Deckelund entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit um sie herum mit einem Papiertuch.
  4. Versiegeln Sie Deckellipsen mit transparentem Nagellack und lassen Sie sie für 20 Minuten trocknen.
  5. Dias bei 4 °C lagern.

5. Bildaufnahme

  1. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf die 60x Objektivlinse. Verwenden Sie DAPI, um die Kerne durch das Augenstück zu lokalisieren.
    1. Für die XYZ-Bildaufnahme, öffnen Sie die Erfassungssoftware und wählen Sie Parameter aus: Scannertyp: Galvano; Scanner-Modus: Roundtrip; Bildgröße: 512 x 512; PMT-Modus: VBF; PMT-Durchschnitt: Rahmen (4-mal); PMT-Sequenzseimscan: Zeile.
    2. Wählen Sie den Farbstoff und die Detektoren:
      Kanal (CH1), Farbstoff (DAPI), Detektor (SD1)
      Kanal (CH2), Farbstoff (Alexa Fluor 488), Detektor (HSD3)
      Kanal (CH3), Farbstoff (Alexa Fluor 647), Detektor (HSD4)
    3. Wählen Sie ON in "Z".
  2. Passen Sie das Livebild an. Drücken Sie die Live-Taste im Live-Fenster.
    1. Passen Sie den Fokus an und stellen Sie die Laserintensität (%), Empfindlichkeit (HV), Verstärkung und Versatz auf dem Werkzeugfenster "PMT" ein.
      1. Passen Sie die Laserintensität (%): für Helligkeit und Bleichen an. Je höher die Laserintensität, desto stärker das Signal, aber die Probe wird photobleicht.
      2. Einstellen der Empfindlichkeit (HV): Geräuschpegel. Je höher der HV, desto stärker das Signal, aber das Bild wird laut, wenn zu hoch.
        HINWEIS: Halten Sie die Spannung immer konstant.
      3. Passen Sie den Offset: Hintergrundebene an.
    2. Wählen Sie Start/Ende (15 Slices) für Z-Stacks aus.
  3. Starten Sie die Erfassung.
    1. Wählen Sie den Ordner zum Speichern von Bildern aus. Drücken Sie die LSM-Starttaste, um mit dem Aufnehmen des Bildes zu beginnen. Drücken Sie die Taste Series Done, um die Bildaufnahme abzuschließen.

6. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie zur Bildanalyse die Analysesoftware.
    1. Drücken Sie das Werkzeugfenster Batch, wählen Sie die zu analysierenden Bilder aus, und wählen Sie den Ausgabeordner aus.
    2. Drücken Sie das Werkzeugfenster Analyse, und wählen Sie Projektion aus (zeigt die maximale Intensitätsprojektion aus 15 Slices an).
    3. Wählen Sie unter Eingabe-/Ausgabeeinstellungden erstellten Stapel aus.
    4. Drücken Sie Prozess für die Verarbeitung von Bildern.
    5. Exportieren Sie Bilder als .tiff-Dateien.
  2. Für die Quantifizierung von Kernschwerpunkten, öffnen Sie CellProfiler.
    1. Öffnen Sie die Pipeline für die Quantifizierung von H2AX und 53BP1 (siehe Ergänzende Informationen).
    2. Zeichnen Sie Daten mithilfe einer Tabellensoftware.
  3. Öffnen Sie CellProfiler für die Analyse der Co-Lokalisierung.
    1. Öffnen Sie die Colokalisierungspipeline (siehe Ergänzende Informationen). Eine Tabellenkalkulationsdatei wird erstellt und am bevorzugten Speicherort gespeichert. Diagramme selbst werden jedoch nicht automatisch gespeichert. Es wird empfohlen, eine Momentaufnahme der Fenster zu machen, um die Ergebnisse aufzuzeichnen.
    2. Zeichnen Sie Daten mithilfe einer Tabellensoftware.

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Representative Results

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Am Tag 2 oder 24 h nach der Aussaat von Zellen auf Deckellips haben die Zellen eine Teilung durchlaufen und sind zu 80% konfluent. Spezifische Knockdowns oder Mutationen in DNA-Reparaturproteinen können die Verdoppelungszeit erhöhen oder Zellen für eine genotoxische Behandlung sensibilisieren, und die Saatdichte sowie die Behandlungsdosen sollten entsprechend angepasst werden. Um die besten Arbeitsbedingungen zu bestimmen, kann der Zeitpunkt der Reaktion auf DNA-Schäden durch Western-Blotting von H2AX im Laufe der Zeit ermittelt werden, und die Empfindlichkeit gegenüber Bestrahlung kann durch koloniebildenden Assay identifiziert werden.

Zellen, die nicht mit Bestrahlung behandelt werden, weisen wenig, wenn überhaupt, h2AX-Foci auf (Abbildung 3A). Die Bildung von H2AX-Foci kann jedoch in kultivierten Zellen durch verschiedene Belastungen ausgelöst werden, die den Wachstumsbedingungen innewohnen: Zellen, die in gesäuerten Medien konfluent bleiben, Vorhandensein von genotoxischem Endotoxin in der FBS, Sauerstoffkonzentration, die für Kultur verwendet wird, um einige zu zitieren.

Figure 3
Abbildung 3: Kernschwerpunkte ohne Stress.
In Ermangelung eines externen Stressors werden nur sehr wenige, wenn überhaupt,H2AX-Brennpunkte beobachtet (A). In Ermangelung wesentlicher DNA-Reparaturproteine kann die Akkumulation von H2AX beobachtet werden, da Brüche, die aufgrund endogener Quellen auftreten, nicht repariert werden (B). Die Akkumulation von nicht reparierten Brüchen kann dazu führen, dass Zellen vorapoptotisch werden, was durch eine "feste" H2AX Kernfärbung (C) gekennzeichnet ist. Skalenbalken = 5 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Darüber hinaus werden in Zellen, die für wichtige DNA-Schäden von Proteinen wie BRCA1 oder BRCA2 mutierten Zellen erschöpft sind, DNA-Brüche, die als Folge endogener Spannungen auftreten, nicht wie in Wildzellen repariert und akkumulieren. Infolgedessen kann in HR-Mangelzellen auch unter normalen Wachstumsbedingungen erhöhteH2AX beobachtet werden (Abbildung 3B). Eine Unterpopulation von Zellen kann eine "feste" kerntechnische Färbung mit h2AX aufweisen (Abbildung 3C). Pannukleare Flecken können darauf hinweisen, dass eine Zelle mit Schäden überfordert ist, die unwiederbringlich nicht repariert werden können, und/oder vorapoptotisch ist. Solche Zellen sind typischerweise durch vergrößerte Kerne und das Vorhandensein von zytoplasmatischen Vakuolen gekennzeichnet. Darüber hinaus kann die SH2AX durch replizierende Spannung in der S-Phase und blockierten Replikationsgabeln oder durch G2/M-Ableiter ausgelöst werden. Bei Bedarf können Zellzyklusphasen identifiziert werden, indem der DNA-Gehalt gefärbt oder mit bestimmten Markern verfärbt werden. Bei der Durchführung von DNA-Schadensreparaturanalysen kann Pan-Nuklear unabhängig von individualisierten Brennpunkten quantifiziert werden.

Nach der Bestrahlung weisen die Kerne eine große Anzahl von Doppelstrangbrüchen auf, zu denen sich h2AX extrem schnell lokalisiert (Abbildung 4). Unter optimalen Bedingungen werden bei fehlender Bestrahlung nur wenige, wenn auch irgendwelche H2AX-Brennpunkte beobachtet. Nach der Bestrahlung nimmt die Bildung von H2AX-Brennpunkten stark zu. Wenn die Brüche verarbeitet und repariert werden, wird die Brennweite pro Kern verringert, sowie die Anzahl der Zellen positiv für brennpunkte. Die Intensität und Anzahl der Brennpunkte variiert je nach verwendeter Zelllinie und der Dosis der bestrahlung. In niedrigen DurchgangS-HeLa-Zellen, die in endotoxinfreiem Serum angebaut werden, beobachteten wir routinemäßig einen starken Anstieg der Brennpunkte bei 30 Minuten und 1 h nach der Bestrahlung, der zwischen 1 und 2 h erreicht, dann allmählich bis 16 h abnimmt. Aus diesem Grund werden hier repräsentative Zeitpunkte bei 0, 1, 2, 4 und 16 h nach der Bestrahlung dargestellt. Das Verhalten der Bruchsignalisierung, Reparatur und des Überlebens zur Bestrahlung kann zwischen den Zelllinien sowie bei Erschöpfung oder Mutation von Genen stark variieren. Aus diesem Grund sind die am besten geeigneten Zeitpunkte experiment- und zellabhängig. Im Experiment haben die Restfoen bei 16 h H2AX den gleichen Basalwert erreicht wie nicht bestrahlte Zellen. Wenn Sie mit langsam dividifizierenden Zelllinien arbeiten, wird empfohlen, die Verbleibenden Brennpunkte zu überwachen, um spätere Zeitpunkte einzubeziehen.

Figure 4
Abbildung 4: Kernschwerpunkte und Quantifizierung nach Stress (Zeitverlauf).
H2AX-Foci-Bildung bei t=0 (keine Bestrahlung) und zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung (4 Gy, t=1, 2, 4, 16 h). (A) Repräsentative Bilder werden gezeigt. DAPI gibt die Kerne an. Skalenbalken = 5 m. (B) Die Kernschwerpunkte von H2AX nach Exposition bei der Bestrahlung wurden durch automatisierte Quantifizierung (CellProfiler) in 100 Kernen für jeden Zeitpunkt bewertet. Abhängig von der erhobenen biologischen Frage und der Art der erfassten Daten stehen verschiedene Optionen zur Verfügung, um die Rohdaten darzustellen, um den Vergleich und das kritische Verständnis zu erleichtern. (i) Das Wolkendiagramm zeigt den Mittelwert sD. Das Symbol (*) zeigt die statistische Signifikanz relativ zur Kontrolle an, indem der zwei schwanzige t-Test des Schülers verwendet wird: *** p 0,0001, (ii) Induktionskurve zeigt den Mittelwert SEM, (iii) mehr als 10 Brennpunkte pro Kern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Umgekehrt akkumulieren sich in Zellen, die für DNA-Schadensreparaturfunktionen mangelhaft sind, bei Abwesenheit einer Bestrahlung (t=0 h) und die Reparatur kann verzögert werden oder auch bei langen Zeitpunkten (t=16 h, t=24 h) nach der Bestrahlung fehlen. Der direkte Vergleich zwischen Wildtyp und mutierten Zellen kann wertvolle Informationen über die DNA-Reparaturfunktion des mutierten Gens geben und auf die Art der Reparatur hinweisen. Während ein Mangel an NHEJ die Reparatur der Pause durch HR in der S-Phase erzwingen kann, werden DSBs, die reseziert wurden und von HR repariert werden müssen, nicht von NHEJ repariert. Aus diesem Grund kann die Anhäufung von Schäden nach der S-Phase auf einen HR-Mangel hindeuten, und hohe H2AX-Werte nach der Teilung deuten auf NHEJ-Defekte hin.

Wenn mehrere Proteine in denselben Zellen untersucht werden, kann die Kolokalisierung durch Multiplexieren primärer Antikörper untersucht werden, die in verschiedenen Tierarten aufgezogen werden und diese mit sekundären Antikörpern, die mit ausgeprägten Fluorophoren gekennzeichnet sind, aufdecken (Abbildung 5). Die Kolokalisierung gibt an, ob Proteine (i) zur Pause rekrutiert werden (ii) rechtzeitig rekrutiert werden, (iii) in DNA-Reparaturkomplexen zusammenbauen. Bei der Suche nach Co-Lokalisierung besteht eine allgemein anerkannte qualitative Methode darin, Ergebnisse als einfache Überlagerung der verschiedenen Kanäle (d. h. grün und rot) darzustellen. Die Überlagerung von Grün und Rot führt zu gelben Hotspots, bei denen die beiden Proteine von Interesse in den gleichen Pixeln vorhanden sind (Abbildung 5A). Diese Methode hat jedoch Einschränkungen, da sie von der relativen Signalintensität abhängt, die in beiden Kanälen gesammelt wird, und die beiden Fluorchrome können Unterschiede in der Signalstärke aufweisen. Daher helfen Überlagerungsmethoden, eine visuelle Schätzung von Co-Lokalisierungsereignissen zu generieren, sind jedoch für quantitative Zwecke nicht geeignet. Die quantitative Analyse der Kolokalisierung kann durch einen objektbasierten Ansatz(Abbildung 5B (i-iii) oder durch einen statistischen Ansatz erreicht werden, der eine Intensitätskorrelationskoeffizienten-basierte (ICCB) Analyse durchführt (Abbildung 5B (iv)). Es stehen mehrere Tools für die Co-Lokalisierungsanalyse zur Verfügung, darunter JACoP (Just Another Co-localization Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) und die hier verwendete "Colocalization"-Pipeline (CellProfiler), die als ICCB-Tool verwendet werden kann, um die Beziehung zwischen Fluoreszenzintensitäten zu bewerten. Dies geschieht hauptsächlich durch Berechnung des Korrelationskoeffizienten (Pearson-Koeffizient), der die Stärke der linearen Beziehung zwischen zwei Variablen misst. Fluoreszenz-Kolokalisierung kann grafisch in Streudiagrammen dargestellt werden, wobei die Intensität eines Fluorchroms (grün) gegen die Intensität des zweiten Fluorchroms (rot) für jedes Pixel dargestellt wird. Vollständige Co-Lokalisierung führt zu Punkten, die um eine gerade Linie gruppiert sind, deren Neigung das Verhältnis der Fluoreszenz der beiden Farben widerspiegelt. Im Gegenteil, der Mangel an Kolokalisierung führt zur Verteilung der Punkte in zwei separate Gruppen (verteilt entlang der Achsen), die jeweils unterschiedliche Signalpegel einer Farbe mit wenig oder gar keinem Signal von der anderen Farbe aufweisen. Der Koeffizient von Pearson reicht von 1 bis -1, wobei 1 für eine vollständige positive Korrelation steht, -1 für eine negative Korrelation und Null, was auf keine Korrelation hinweist. Alternativ kann die Pclc-Methode verwendet werden. Diese Methode wurde in einer Vielzahl von Strahlungen angewandt (details siehe36 und frei verfügbare Methode).

Figure 5
Abbildung 5: Analyse der Kolokalisierung.
Durch die Verwendung mehrerer Antikörper, die gegen verschiedene Arten (hier Anti-Maus-H2AX (rot) und Anti-Kaninchen 53BP1 (grün)) erhoben werden, können mehrere Proteine untersucht werden. (A) Repräsentative Bilder werden gezeigt. DAPI gibt die Kerne an. Die Kolokalisierung wird durch Farbe und Flächenüberlappung visualisiert (hier rot + grün = gelb). Skalenbalken = 5 m. (B) Individuelle und kolokalisierende Brennpunkte können einzeln mit einer von mehreren Softwares quantifiziert (hier CellProfiler, siehe weitere Optionen im Haupttext) und geplottet werden. (i-iii) Objektbasierte sanieren, die verwendet wird, um die Für die Co-Lokalisierung erhaltenen Korrelationsergebnisse mithilfe eines pixelbasierten Ansatzes (ICCB-Analyse) zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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Die Analyse des Timings und der Effizienz der Reparatur von DNA-Schäden durch Mikroskopie hat sich als wesentlich erwiesen, um zu verstehen, wie die DNA-Reparaturmaschinerie funktioniert, in normalen Zellen und in menschlichen Pathologien wie Krebs.

Die Entwicklung spezifischer Antikörper, die den Nachweis aktivierter Proteine in ihrer phosphorylierten Version ermöglichen (z. B. H2AX, pRPA, pRAD50 und andere10,23,39,43), hat eine zentrale Rolle dabei gespielt, ein besseres Verständnis des TIMINGs der DNA-Reparatur von Ereignissen und deren Synchronisation mit dem Zellzyklus zu erlangen. Dieser Erfolg wird durch die Analyse von 53BP1 phosphorylierten Rückständen durch Massenspektrometrie und Immunlokalisierung (siehe32 zur Überprüfung) veranschaulicht, die dazu beigetragen hat, die Funktion dieses stark modifizierten Proteins zu verstehen. Mit dem Aufstieg hochauflösender mikroskopischer Technik wie STORM und dem verstärkten Einsatz kleiner Antikörper (Nanokörper) wird die direkte Proteininteraktion in Zellen immer zugänglicher und genauer. Die hier beschriebene indirekte Immunfluoreszenz bleibt jedoch ein wesentliches Experiment, das bei der Untersuchung eines neuartigen potenziellen DNA-Reparaturproteins und der Suche nach einem Zeitpunkt für Die Sende- und Proteinpartner durchgeführt werden muss.

Der Erfolg der indirekten Immunfluoreszenz beruht ausschließlich auf zwei Kriterien: (i) die Qualität von Reagenzien – insbesondere Antikörper, die zum Nachweis von Phosphorückständen auf aktivierten DNA-Reparaturproteinen verwendet werden, und (ii) den Zeitpunkt des Experiments. Die Verwendung veröffentlichter Protokolle und Antikörper sollte gefördert werden, wenn verfügbar ist. Bei der Verwendung eines neuartigen Antikörpers oder bei der Untersuchung eines neuartigen Proteins sollte der Antikörper validiert werden, und die Spezifität sollte entweder durch Abklopfen des Zielproteins in Zellen (das Signal sollte verloren gehen) oder durch Proteinmangel (Verwendung von gereinigtem Protein zur Erschöpfung spezifischer Antikörper vor der Inkubation, wie in44 für RAD51AP1) festgestellt werden.

Optimale Sperrbedingungen und Antikörperverdünnung sollten festgelegt werden, um Artefakte und unspezifische Färbungen zu minimieren. Puffer werden frisch vorbereitet, und wenn die kernnukleare Extraktion durchgeführt wird, muss sie zeitlich so terminiert werden, dass schädliche Kerne vermieden werden. Bei der Untersuchung der Reparatureffizienz in menschlichen Zellen sollte die Quantifizierung von Kernbrennpunkten durchgeführt werden, und die kernnukleare Extraktion kann beim Ausschluss von zytoplasmatischen Proteinen helfen. Es kann jedoch von Vorteil sein, den nuklearen Extraktionsschritt nicht durchzuführen, zum Beispiel zu untersuchen, ob ein mutiertes Protein, das im Verdacht steht, nicht mit seinem Zellpartner zu interagieren, bei DNA-Schäden nicht in den Kern überführt.

Darüber hinaus ist die Qualität der Bildgebung von größter Bedeutung, um sicherzustellen, dass Daten ordnungsgemäß erfasst, analysiert und genaue Daten aufgezeichnet werden können. Die Parameter zur Kontrolle sind vielfältig und umfassen: Spezifität der primären Antikörper, Spektrum der Anregung der gewählten Fluorophore (sekundäre Antikörper), Schutz der Proben vor Photobleichungen, Wahl der Unterstützung für Säzellen, gute Probenahme (mindestens 30 bis 300 Kerne, je nach Frage) und in einigen Fällen nach der Behandlung wie Dekonvolution oder spektrale Un-Mischung. Wenn möglich, wird eine automatisierte Abbildung eines vollständigen Deckblatts vorgeschlagen, mit dem Tausende von Zellen abgebildet werden können. Die Einbeziehung von Bildgebungsspezialisten wie einer Kerneinrichtung vor der Einrichtung des Experiments sollte in Betracht gezogen werden, da dies die Qualität der Ergebnisse erheblich verbessern wird.

Schließlich können die Basalkonzentrationen der Brennpunkte auf der Grundlage der verwendeten Zelllinien, der durchgeführten Behandlung und der untersuchten Proteine stark variieren und die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass Rohdaten in einem Licht zusammengefasst, verarbeitet, analysiert und in einem Licht dargestellt werden, das die Leser verstehen können; Vergleichundt und Trends und Beziehungen innerhalb der Daten aufzudecken. In Abbildung 4Bwird die gleiche Quantifizierung von Brennpunkten in drei getrennten Versionen dargestellt: (i) Gesamtzahl der Brennpunkte (Wolkendiagramm) nach DSBs, die durch Bestrahlung (ii) Induktion von Brennpunkten im Laufe der Zeit induziert werden -kinetik- (iii) % der positiven Zellen (>10 foci/nucleus).

Cloud-Plots sind nach Möglichkeit vorzuziehen(Abbildung 4B i),da sie alle Datenpunkte ohne Diskriminierung zeigen und somit einen möglichst umfassenden Überblick über das Experiment bieten. Das Plotten selektiverer und relevanterer Informationen, wie z. B. die Anzahl der positiven Zellen über einem beliebigen Hintergrundabgeschnitten (5 Schwerpunkte in den meisten Zelllinien), die Anzahl der Brennpunkte, die im Laufe der Zeit mitlokalisiert werden, die Induktion von Brennpunkten oder die Qualitätsmessung der Brennpunkte, wie Pixelgröße oder -intensität, kann in einigen Fällen geeigneter sein und liegt in der Verantwortung der Autoren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der San Antonio Area Foundation unterstützt. Das Mays Cancer Center wird vom NCI Cancer Center Support Core Grant P30 CA054174 unterstützt. Wir danken Stephen Holloway für seine Hilfe bei der Beschaffung der Reagenzien und dem Sung-Labor für die Bereitstellung von Platz- und Mikroskopiekapazitäten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

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References

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Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz
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de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).More

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

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