ओमिक्स अनुसंधान में कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस (सी एलिगेंस)का उपयोग करने के लिए, कीड़े की बड़ी आबादी उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है जहां तुलनात्मक विश्लेषण के लिए प्लेटफार्मों पर एक नमूना मापा जा सकता है। यहां, बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेटों (LSCPs) पर सी elegans आबादी संस्कृति के लिए एक विधि प्रस्तुत की है ।
कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस (सी एलिगेंस)विकासात्मक जीव विज्ञान, उम्र बढ़ने, न्यूरोबायोलॉजी और आनुवंशिकी का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव रहा है और बना हुआ है। सी एलिगेंस पर काम का बड़ा शरीर जटिल जैविक घटकों और किसी अन्य जीव के साथ उनके संबंधों को विच्छेदन करने के लिए बड़ी आबादी, पूरे पशु अध्ययनों में एकीकृत करने के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बनाता है। सहयोगी-ओमिक्स अनुसंधान में सी एलिगेंस का उपयोग करने के लिए, जानवरों की बड़ी आबादी उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है जहां तुलनात्मक विश्लेषणों के लिए विविध प्लेटफार्मों पर एक नमूना विभाजित और परख किया जा सकता है।
यहां, संस्कृति के लिए एक विधि और एक बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेट (LSCP) और बाद में फेनोटाइपिक डेटा पर एक प्रचुर मात्रा में मिश्रित चरण सी elegans आबादी इकट्ठा प्रस्तुत किया है । यह पाइपलाइन फेनोटाइपिक और जनसंख्या डेटा एकत्र करने के लिए पर्याप्त संख्या में जानवरों की पैदावार करती है, साथ ही-ओमिक्स प्रयोगों (यानी जीनोमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, प्रोटेओमिक्स और मेटाबोलोमिक्स) के लिए आवश्यक किसी भी डेटा के साथ। इसके अलावा, एलएससीपी विधि को स्वयं जानवरों के लिए न्यूनतम हेरफेर की आवश्यकता होती है, कम उपयोगकर्ता तैयार करने का समय, तंग पर्यावरणीय नियंत्रण प्रदान करता है, और यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक नमूने की हैंडलिंग समग्र प्रजनन क्षमता के लिए पूरे अध्ययन में सुसंगत है। अंत में, किसी दिए गए एलएससीपी में सी एलिगेंस लाइफ चरणों के जनसंख्या आकार और जनसंख्या वितरण को दस्तावेज करने के तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं ।
सी एलिगेंस एक छोटा सा मुक्त रहने वाला सूत्रकृमि है जो दुनिया भर में विभिन्न प्राकृतिक आवासों में पाया जाता है1। इसकी विकास में सापेक्ष आसानी, तेज पीढ़ी का समय, प्रजनन प्रणाली और पारदर्शी शरीर इसे एक शक्तिशाली मॉडल जीव बनाते हैं जिसका विकासात्मक जीवविज्ञान, उम्र बढ़ने, न्यूरोबायोलॉजी और जेनेटिक्स2,3में व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। सी एलिगेंस पर प्रचुर काम यह एक प्रमुख उंमीदवार में उपयोग करने के लिए-omics अध्ययन व्यापक जटिल जैविक घटकों और एक दिए गए जीव में उनके संबंधों के साथ फेनोटाइप लिंक बनाता है ।
सहयोगी-ओमिक्स अनुसंधान में सी एलिगेंस का उपयोग करने के लिए, जानवरों की बड़ी मिश्रित चरण आबादी उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है जहां तुलनात्मक विश्लेषण के लिए विविध प्लेटफार्मों और उपकरणों में एक नमूना विभाजित और उपयोग किया जा सकता है। इस तरह के नमूने उत्पन्न करने के लिए एक पाइपलाइन बनाने के लिए आहार, पर्यावरण, तनाव, जनसंख्या संरचना, और नमूना हैंडलिंग और संग्रह के बारे में गहरी जागरूकता की आवश्यकता होती है। इसलिए, मानक और प्रजनन योग्य संस्कृति की स्थिति को बड़े पैमाने पर पाइपलाइनों में एकीकृत करना महत्वपूर्ण है। सी एलिगेंस रिसर्च में, दो पारंपरिक तरीकों का उपयोग कीड़े-एगर पेट्री व्यंजन और तरल संस्कृति 4 को संस्कृति के लिए कियाजाताहै ।
ऐतिहासिक रूप से, जब बड़ी मात्रा में सी एलिगेंस की आवश्यकता होती है, तो वे तरल संस्कृति4में उगाए जाते हैं। तरल संस्कृति में कीड़े की एक बड़ी आबादी पैदा करने में शामिल कदम कई हैंडलिंग कदम है कि अक्सर ग्रेविड वयस्क क्यूटिकल टूटना करने के लिए ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन शामिल हैं, वांछित जनसंख्या आकार को प्राप्त करने के लिए भ्रूण जारी करने की आवश्यकता है । हालांकि, जब ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन का उपयोग किया जाता है, तो जनसंख्या वृद्धि जनगणना के आकार को शुरू करने पर निर्भर करती है और इसलिए, बाद में वृद्धि और जनसंख्या संख्या को प्रभावित करती है। इसके अलावा, सी एलिगेंस उपभेदों को उनकी क्यूटिकल संवेदनशीलता, एक्सपोजर समय और ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन के लिए तनाव प्रतिक्रिया में भिन्न होता है जिससे एक समय में कई उपभेदों को परखना मुश्किल हो जाता है5,6,7,8,9।
इसके अतिरिक्त, तरल संस्कृति में कृमि वृद्धि के लिए कुछ हस्तांतरण चरणों की आवश्यकता होती है क्योंकि अक्सर कटाई से पहले कीड़े की सिर्फ एक पीढ़ी बढ़ने की सिफारिश की जाती है क्योंकि भीड़ आसानी से हो सकती है यदि कई पीढ़ियों के लिए उगाया जाता है और भोजन10की उपस्थिति के बावजूद डायर गठन का कारण बन जाता है। दाऊर गठन छोटे सिग्नलिंग अणुओं जैसे एस्कारोसिड्स के माध्यम से होता है, जिसे अक्सर “दाऊर फेरोमोन” के रूप में जाना जाता है11,12,13,14,तरल मीडिया में जारी किए जाते हैं और जनसंख्या के विकास को प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, तरल संस्कृति में बड़ी कृमि आबादी बढ़ने से संस्कृति में अतिरिक्त बैक्टीरिया संचय होता है, जिससे कठिनाइयां पैदा होती हैं जब डाउनस्ट्रीम फेनोटाइपिक परख के लिए एक साफ नमूने की आवश्यकता होती है। अंत में, जब एक तरल संस्कृति दूषित हो जाती है, तो फंगल बीजाणुओं या जीवाणु कोशिकाओं को आसानी से मीडिया में फैलाया जाता है15के रूप में बनाए रखना अधिक कठिन होता है।
सी एलिगेंस उगाने की अन्य पारंपरिक विधि आगर पेट्री व्यंजनों पर है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेट्री व्यंजन तरल संस्कृतियों में देखे गए भीड़-भाड़ और उच्च दाऊर गठन के तेजी से प्रभाव के बिना मिश्रित चरण कीड़े की कई पीढ़ियों को आसानी से विकसित करने की अनुमति देते हैं। हालांकि, पारंपरिक एगर पेट्री व्यंजनों पर कृमि विकास के लिए एक नुकसान यह है कि सबसे बड़ा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेट्री डिश ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन चरण में जोड़ने के बिना-ओमिक्स अध्ययन के लिए बड़ी कृमि आबादी नहीं देती है। संक्षेप में, एगर पेट्री व्यंजनों पर सी एलिगेंस की मिश्रित चरण आबादी को इकट्ठा करने के लिए अधिक उपयुक्त है- ओमिक्स डेटा, लेकिन हमें तरल संस्कृति के बिना बहुत बड़ी जनसंख्या आकार उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है।
यहां, हम संस्कृति के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं और बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेटों (एलएससीपी) पर बड़े मिश्रित चरण सी एलिगेंस आबादी एकत्र करते हैं। इस पाइपलाइन के माध्यम से नमूने एकत्र करने से फेनोटाइपिक और जनसंख्या डेटा इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त नमूना होता है, साथ ही-ओमिक्स प्रयोगों(यानीजीनोमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, प्रोटेओमिक्स और मेटाबोलोमिक्स) के लिए आवश्यक किसी भी डेटा के साथ। इसके अलावा, एलएससीपी विधि को जानवरों के न्यूनतम हेरफेर की आवश्यकता होती है, कम उपयोगकर्ता प्रस्तुत करने का समय, तंग पर्यावरणीय नियंत्रण प्रदान करता है, और यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक नमूने की हैंडलिंग समग्र प्रजनन क्षमता के लिए पूरे अध्ययन में सुसंगत है।
एलएससीपी के रूप में विभिन्न प्रकार के जहाजों का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में एक स्टैंडर्ड ग्लास बेकिंग डिश का इस्तेमाल किया गया। उपयोग में एलएसपीसी में 35.56 x 20.32 सेमी के बाहरी आयाम, 27.94 x 17.78 सेमी के आंतरिक आयाम, और लगभग 4.45 सेमी गहरे थे और एक फिट ढक्कन के साथ आए थे। इस प्रकार, यहां उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरिया की मात्रा को मिश्रित चरण के कीड़े की एक बड़ी आबादी को उपज देने के लिए उपरोक्त आयामों के साथ एलएससीपी के लिए अनुकूलित किया गया है। प्रयोगात्मक जरूरतों को फिट करने के लिए बैक्टीरियल वॉल्यूम और एकाग्रता को समायोजित किया जा सकता है।
मोल्ड, कवक, या अन्य जीवाणु स्रोतों द्वारा संदूषण एलएससीपी विधि में किसी भी कदम पर हो सकता है, इसलिए देखभाल के साथ नमूनों को संभालें। प्रोटोकॉल में किसी भी कदम को शुरू करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि काम करने की जगह 70% इथेनॉल और 10% ब्लीच के साथ साफ की गई है। यदि उपलब्ध है, तो 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ इस्तेमाल क्षेत्रों का इलाज करें और प्रत्येक चरण को शुरू करने से पहले हेपा एयर-फिल्टर 30 मिनट चालू करें।
एलएससीपी को नियंत्रित सेटिंग(यानी,20 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए सीटी रूम में) में उगाकर, उपयोगकर्ता अधिक आसानी से नमूना और दस्तावेज़ संभावित संदूषण के विकास को ट्रैक कर सकता है। यदि एलएससीपी की सतह दूषित हो जाती है, तो या तो संभव होने पर संदूषण को काट दें और यदि संदूषण को नियंत्रित करना संभव नहीं है तो नमूना विकसित होता है या छोड़ने दें। अवांछित विकास को कम करने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह संसाधनों के लिए कीड़े को मात नहीं दे रहा है, संदूषण को जल्दी से संबोधित करना अनिवार्य है ।
यह विधि उन लोगों के लिए है जो सी एलिगेंस की बड़े पैमाने पर मिश्रित जनसंख्या संस्कृतियों को विकसित करना चाहते हैं। यद्यपि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेट्री व्यंजनों और तरल संस्कृति पर किए गए एलएससीपी पर कीड़े की समकालिक आबादी विकसित करना संभव हो सकता है, लेखकों ने इस विकल्प का परीक्षण नहीं किया है। इसके अतिरिक्त, यदि उपयोगकर्ता किसी दिए गए नमूने में औसतन लगभग 2.4 मिलियन कीड़े से अधिक विकसित करना चाहते हैं, तो एक अलग विधि की सिफारिश की जाती है4। विकास की सफलता पाइपलाइन में संसाधित किए जा रहे तनाव पर निर्भर है । लेखक 15 सी एलिगेंस उपभेदों के कम से कम पांच जैविक प्रतिकृति में लगभग 2.4 मिलियन कीड़े की आबादी को सफलतापूर्वक विकसित करने में सक्षम थे, यह दर्शाता है कि विधि मजबूत है।
प्रयोग शुरू करने से पहले ध्यान दें कि किसी दिए गए कीड़े की उम्र और स्वास्थ्य fecundity और बाद में जनसंख्या वृद्धि के समय को प्रभावित कर सकता है। सुनिश्चित करें कि इस पाइपलाइन में उपयोग किए जाने से पहले न्यूनतम तनाव के साथ स्वस्थ परिस्थितियों में कीड़े बनाए रखे जाते हैं। यह माना जाता है कि समय के साथ आनुवंशिक बहाव को कम करने के लिए स्टॉक नमूने बनाए गए हैं, जमे हुए हैं, और -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है।
किसी दिए गए प्रयोग की जरूरतों के आधार पर, एलएससीपी पर ग्रेविड वयस्कों की संख्या को बदला जा सकता है। एलएससीपी पर शुरू ग्रेविड वयस्कों की संख्या में फेरबदल विकास दर और इस तरह फसल के लिए समय बदल जाएगा । पांच ग्रेविड वयस्कों का उपयोग निम्नलिखित कारणों से प्रत्येक एलएससीपी को बीज देने के लिए किया जाता है: (1) एक समय में एलएससीपी पर कई सी एलिगेंस उपभेदों को बीज करने के लिए एक सरल, तेज और कुशल तरीका आवश्यक था और (2) ग्रेविड वयस्कों के बीच उम्र के अंतर को कम करने के लिए चुना गया है जो विकास विषमता का कारण बन सकता है।
यह विधि उपयोगकर्ता को सभी जीवन चक्र चरणों के साथ कीड़े की बड़ी आबादी को फसल करने की अनुमति देती है। वर्तमान तरीकों के उपलब्ध होने के साथ, सी एलिगेंस के बड़े पैमाने पर नमूनों को इकट्ठा करने के लिए डाउनस्ट्रीम काम के लिए वांछित कीड़े की संख्या प्राप्त करने के लिए ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन की आवश्यकता होती है। इस दृष्टिकोण को देखते हुए, अब कोई भी ब्लीच सिंक्रोनाइजिंग और कई हैंडलिंग चरणों से जुड़ी कठिनाइयों के बिना किण्वितर या बड़े पैमाने पर तरल संस्कृतियों में पहले से संभव के रूप में कई कीड़े विकसित कर सकता है। हमारा प्रोटोकॉल किसी को ब्याज के उपभेदों को कुशलतापूर्वक लक्षित करने, नमूना खुद को बढ़ाने में न्यूनतम हैंडलिंग समय का उपयोग करने और डाउनस्ट्रीम पाइपलाइनों में आवश्यकतानुसार कीड़े या जनसंख्या के चरणों को अलग करने की अनुमति देता है।
एक एलपीएफसी का उपयोग एक दिए गए एलएससीपी में जनसंख्या वितरण और आकार को दस्तावेज करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया गया था। एलपीएफसी का उपयोग किया जाने वाला एक सतत प्रवाह प्रणाली है जो उनके आकार (TOF) और ऑप्टिकल घनत्व के आधार पर कीड़े का विश्लेषण, प्रकार और वितरण करती है। के रूप में एक दिया कृमि प्रवाह सेल के माध्यम से गुजरता है, अक्षीय प्रकाश हानि डिटेक्टर एक ४८८ एनएम ठोस राज्य लेजर द्वारा अवरुद्ध संकेत प्रकाश की मात्रा को समय की लंबाई के लिए यह एक कीड़ा के माध्यम से पारित करने के लिए लेता है, उपयोगकर्ता TOF और कीड़ा के ऑप्टिकल घनत्व दे रही है । फ्लोरेसेंस संग्रह प्रकाशिकी और डिटेक्टरों का उपयोग प्रत्येक नमूने पर फ्लोरेसेंस संवेदनशीलता और संग्रह को अधिकतम करने के लिए भी किया जा सकता है। एलपीएफसी संग्रह पैरामीटर उपकरण के आधार पर अलग-अलग होंगे। उपयोगकर्ता कृमि आकार को पकड़ने के लिए विभिन्न प्लेटफार्मों को नियोजित कर सकते हैं और यदि एलपीएफसी उपलब्ध नहीं है तो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने तक सीमित नहीं हैं।
लेखक यहां वर्णित विधि में उगाए गए नमूनों का उपयोग कर रहे हैं ताकि तरल क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से सी एलिगेंस के विभिन्न उपभेदों में अज्ञात मेटाबोलाइट्स की पहचान की जा सके – मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, और आरएनए अनुक्रमण। लेखकों को इस पाइपलाइन में नमूनों के विकास के लिए इस विधि का उपयोग जारी रखने की योजना है सी elegans उपभेदों की एक किस्म के साथ ब्याज के नए उपभेदों के रूप में आसानी से इस पाइपलाइन का उपयोग कर संसाधित किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम इस पांडुलिपि पर उपयोगी चर्चाओं और प्रतिक्रिया के लिए एडीसन लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं; विशेष रूप से, बी .M गार्सिया । सीजीसी द्वारा कुछ उपभेदों को प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (पी 40 ओडी010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और सीईएनडीआर, जिसे एनएसएफ लिविंग कलेक्शन सीएसबीआर द्वारा वित्त पोषित किया जाता है 1930382। इस काम को एनआईएच (U2CES030167) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
10 mL Sterile Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
10 ul pipette tips | VWR | 89079-438 | |
100 ul pipette tips | VWR | 89079-442 | |
1000 mL Graduated Cylinder | VWR | 10124-380 | |
1000 ul pipette tips | VWR | 89079-488 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-668 | |
190 Proof Ethanol | VWR | 89125-166 | |
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask | VWR | 75804-654 | |
50 mL conical tubes | VWR | 75874-294 | |
Agar | Sigma | 05040-100G | |
Agarose | Sigma | A9539-500G | |
BVC Control G Fluid Aspiration System | Vacuubrand | ||
Calcium Chloride | Sigma | 449709-10G | |
Cholesterol | Sigma | C3045-25G | |
Clorox Bleach | VWR | 89414-502 | |
Conviron Control Temperature Room | Conviron | https://www.conviron.com/environmental-rooms | |
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate | VWR | 89089-866 | |
Fisher Scientific Accuspin 3R | Fisher | ||
Flat-Bottom 24-Well Plate | VWR | 29443-952 | |
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. | Home Depot | 204390560 | |
HT115 E. coli (DE3) | CGC | HT115(DE3) | https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3) |
Kimwipes | VWR | 470224-038 | |
Large Scale Culture Plate (LSCP) | Pyrex | 1090948 | Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid |
Magnesium Sulfate | Sigma | C86677-25G | |
MgSO4 | VWR | 97062-998 | |
Microscope Plain Slides | VWR | 16004-422 | |
Millipore Filter | Millipore | 1.11727.2500 | |
Molecular Devices ImageXpress | Molecular Devices | Model Number:IXMConfocal | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532 |
Nystatin (10mg/mL) | Sigma | N6261-25MU | |
Peptone | Sigma | P7750-100G | |
Petri Dishes (6 cm) | VWR | 25384-092 | |
Pipette Controller | VWR | 613-4180 | |
Potassium Chloride | Fisher | P217-3 | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR | 0781-500G | |
Potasssium Hydroxide | Fisher | P250-500 | |
Red Fluroscent Microspheres | Polysciences | 19507-5 | |
Sodium Chloride | Sigma | 746398-500G | |
Sodium Hydroxide | Fisher | 111357 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher | BP332-500 | |
Standard Gilson Pipette Set | Gilson | FA10002M, FA10004M, FA10006M | |
Streptomycin (100mg/mL) | Sigma | S6501-25G | |
Union Biometrica COPAS BioSorter | Union Biometrica | https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3. |