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Genetics

संस्कृति और बड़े पैमाने पर मिश्रित मंच Caenorhabditis elegans आबादी की परख

doi: 10.3791/61453 Published: May 5, 2021

Summary

ओमिक्स अनुसंधान में कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस (सी एलिगेंस)का उपयोग करने के लिए, कीड़े की बड़ी आबादी उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है जहां तुलनात्मक विश्लेषण के लिए प्लेटफार्मों पर एक नमूना मापा जा सकता है। यहां, बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेटों (LSCPs) पर सी elegans आबादी संस्कृति के लिए एक विधि प्रस्तुत की है ।

Abstract

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस (सी एलिगेंस)विकासात्मक जीव विज्ञान, उम्र बढ़ने, न्यूरोबायोलॉजी और आनुवंशिकी का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव रहा है और बना हुआ है। सी एलिगेंस पर काम का बड़ा शरीर जटिल जैविक घटकों और किसी अन्य जीव के साथ उनके संबंधों को विच्छेदन करने के लिए बड़ी आबादी, पूरे पशु अध्ययनों में एकीकृत करने के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बनाता है। सहयोगी-ओमिक्स अनुसंधान में सी एलिगेंस का उपयोग करने के लिए, जानवरों की बड़ी आबादी उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है जहां तुलनात्मक विश्लेषणों के लिए विविध प्लेटफार्मों पर एक नमूना विभाजित और परख किया जा सकता है।

यहां, संस्कृति के लिए एक विधि और एक बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेट (LSCP) और बाद में फेनोटाइपिक डेटा पर एक प्रचुर मात्रा में मिश्रित चरण सी elegans आबादी इकट्ठा प्रस्तुत किया है । यह पाइपलाइन फेनोटाइपिक और जनसंख्या डेटा एकत्र करने के लिए पर्याप्त संख्या में जानवरों की पैदावार करती है, साथ ही-ओमिक्स प्रयोगों (यानी जीनोमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, प्रोटेओमिक्स और मेटाबोलोमिक्स) के लिए आवश्यक किसी भी डेटा के साथ। इसके अलावा, एलएससीपी विधि को स्वयं जानवरों के लिए न्यूनतम हेरफेर की आवश्यकता होती है, कम उपयोगकर्ता तैयार करने का समय, तंग पर्यावरणीय नियंत्रण प्रदान करता है, और यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक नमूने की हैंडलिंग समग्र प्रजनन क्षमता के लिए पूरे अध्ययन में सुसंगत है। अंत में, किसी दिए गए एलएससीपी में सी एलिगेंस लाइफ चरणों के जनसंख्या आकार और जनसंख्या वितरण को दस्तावेज करने के तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं ।

Introduction

सी एलिगेंस एक छोटा सा मुक्त रहने वाला सूत्रकृमि है जो दुनिया भर में विभिन्न प्राकृतिक आवासों में पाया जाता है1। इसकी विकास में सापेक्ष आसानी, तेज पीढ़ी का समय, प्रजनन प्रणाली और पारदर्शी शरीर इसे एक शक्तिशाली मॉडल जीव बनाते हैं जिसका विकासात्मक जीवविज्ञान, उम्र बढ़ने, न्यूरोबायोलॉजी और जेनेटिक्स2,3में व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। सी एलिगेंस पर प्रचुर काम यह एक प्रमुख उंमीदवार में उपयोग करने के लिए-omics अध्ययन व्यापक जटिल जैविक घटकों और एक दिए गए जीव में उनके संबंधों के साथ फेनोटाइप लिंक बनाता है ।

सहयोगी-ओमिक्स अनुसंधान में सी एलिगेंस का उपयोग करने के लिए, जानवरों की बड़ी मिश्रित चरण आबादी उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है जहां तुलनात्मक विश्लेषण के लिए विविध प्लेटफार्मों और उपकरणों में एक नमूना विभाजित और उपयोग किया जा सकता है। इस तरह के नमूने उत्पन्न करने के लिए एक पाइपलाइन बनाने के लिए आहार, पर्यावरण, तनाव, जनसंख्या संरचना, और नमूना हैंडलिंग और संग्रह के बारे में गहरी जागरूकता की आवश्यकता होती है। इसलिए, मानक और प्रजनन योग्य संस्कृति की स्थिति को बड़े पैमाने पर पाइपलाइनों में एकीकृत करना महत्वपूर्ण है। सी एलिगेंस रिसर्च में, दो पारंपरिक तरीकों का उपयोग कीड़े-एगर पेट्री व्यंजन और तरल संस्कृति 4 को संस्कृति के लिए कियाजाताहै ।

ऐतिहासिक रूप से, जब बड़ी मात्रा में सी एलिगेंस की आवश्यकता होती है, तो वे तरल संस्कृति4में उगाए जाते हैं। तरल संस्कृति में कीड़े की एक बड़ी आबादी पैदा करने में शामिल कदम कई हैंडलिंग कदम है कि अक्सर ग्रेविड वयस्क क्यूटिकल टूटना करने के लिए ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन शामिल हैं, वांछित जनसंख्या आकार को प्राप्त करने के लिए भ्रूण जारी करने की आवश्यकता है । हालांकि, जब ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन का उपयोग किया जाता है, तो जनसंख्या वृद्धि जनगणना के आकार को शुरू करने पर निर्भर करती है और इसलिए, बाद में वृद्धि और जनसंख्या संख्या को प्रभावित करती है। इसके अलावा, सी एलिगेंस उपभेदों को उनकी क्यूटिकल संवेदनशीलता, एक्सपोजर समय और ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन के लिए तनाव प्रतिक्रिया में भिन्न होता है जिससे एक समय में कई उपभेदों को परखना मुश्किल हो जाता है5,6,7,8,9।

इसके अतिरिक्त, तरल संस्कृति में कृमि वृद्धि के लिए कुछ हस्तांतरण चरणों की आवश्यकता होती है क्योंकि अक्सर कटाई से पहले कीड़े की सिर्फ एक पीढ़ी बढ़ने की सिफारिश की जाती है क्योंकि भीड़ आसानी से हो सकती है यदि कई पीढ़ियों के लिए उगाया जाता है और भोजन10की उपस्थिति के बावजूद डायर गठन का कारण बन जाता है। दाऊर गठन छोटे सिग्नलिंग अणुओं जैसे एस्कारोसिड्स के माध्यम से होता है, जिसे अक्सर "दाऊर फेरोमोन" के रूप में जाना जाता है11,12,13,14,तरल मीडिया में जारी किए जाते हैं और जनसंख्या के विकास को प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, तरल संस्कृति में बड़ी कृमि आबादी बढ़ने से संस्कृति में अतिरिक्त बैक्टीरिया संचय होता है, जिससे कठिनाइयां पैदा होती हैं जब डाउनस्ट्रीम फेनोटाइपिक परख के लिए एक साफ नमूने की आवश्यकता होती है। अंत में, जब एक तरल संस्कृति दूषित हो जाती है, तो फंगल बीजाणुओं या जीवाणु कोशिकाओं को आसानी से मीडिया में फैलाया जाता है15के रूप में बनाए रखना अधिक कठिन होता है।

सी एलिगेंस उगाने की अन्य पारंपरिक विधि आगर पेट्री व्यंजनों पर है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेट्री व्यंजन तरल संस्कृतियों में देखे गए भीड़-भाड़ और उच्च दाऊर गठन के तेजी से प्रभाव के बिना मिश्रित चरण कीड़े की कई पीढ़ियों को आसानी से विकसित करने की अनुमति देते हैं। हालांकि, पारंपरिक एगर पेट्री व्यंजनों पर कृमि विकास के लिए एक नुकसान यह है कि सबसे बड़ा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेट्री डिश ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन चरण में जोड़ने के बिना-ओमिक्स अध्ययन के लिए बड़ी कृमि आबादी नहीं देती है। संक्षेप में, एगर पेट्री व्यंजनों पर सी एलिगेंस की मिश्रित चरण आबादी को इकट्ठा करने के लिए अधिक उपयुक्त है- ओमिक्स डेटा, लेकिन हमें तरल संस्कृति के बिना बहुत बड़ी जनसंख्या आकार उत्पन्न करने के लिए एक विधि की आवश्यकता होती है।

यहां, हम संस्कृति के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं और बड़े पैमाने पर संस्कृति प्लेटों (एलएससीपी) पर बड़े मिश्रित चरण सी एलिगेंस आबादी एकत्र करते हैं। इस पाइपलाइन के माध्यम से नमूने एकत्र करने से फेनोटाइपिक और जनसंख्या डेटा इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त नमूना होता है, साथ ही-ओमिक्स प्रयोगों(यानीजीनोमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, प्रोटेओमिक्स और मेटाबोलोमिक्स) के लिए आवश्यक किसी भी डेटा के साथ। इसके अलावा, एलएससीपी विधि को जानवरों के न्यूनतम हेरफेर की आवश्यकता होती है, कम उपयोगकर्ता प्रस्तुत करने का समय, तंग पर्यावरणीय नियंत्रण प्रदान करता है, और यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक नमूने की हैंडलिंग समग्र प्रजनन क्षमता के लिए पूरे अध्ययन में सुसंगत है।

Protocol

1. एलएससीपी और उपकरणों को स्टरलाइज करें

  1. हैंडवाशिंग द्वारा ग्लास एलएससीपी तैयार करें, इसके बाद डिशवॉशिंग, और बाद में यह सुनिश्चित करने के लिए ऑटोक्लेविंग करें कि प्रयोग शुरू करने से पहले कांच के बर्तन ों से मुक्त है। उपयोग में जब तक एक स्वच्छ शुष्क स्थान में ऑटोक्लेव एलएससीपी स्टोर करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि एलएससीपी डिशवॉशर और ऑटोक्लेव सुरक्षित हैं। सुनिश्चित करें कि एलएससीपी ढक्कन डिशवॉशर सुरक्षित हैं।
  2. डिशवॉशिंग के बाद हैंडवाशिंग द्वारा एलएससीपी ढक्कन तैयार करें। जरूरत होने तक एक साफ बिन में एलएससीपी ढक्कन स्टोर करें।
  3. जिस दिन नेमाटोड ग्रोथ मीडिया एग्रीज (एनजीएमए) को प्रीपेड किया गया है, एलएससीपी लिड्स को दो बार 10% ब्लीच समाधान के साथ मिटा दें, इसके बाद 70% इथेनॉल होता है। एक बार 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ नीचे मिटा दिया, लेएससीपी lids लेमिनार प्रवाह हुड में एक साफ बिन में जहां NGMA prepped किया जाएगा रखें।

2. नेमाटोड विकास मीडिया agarose (NGMA) तैयार

  1. निम्नलिखित अभिकर्मकों को एक ऑटोक्लेवेड 2 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क में एक हलचल प्लेट पर हलचल पट्टी के साथ जोड़कर एनजीएमए तैयार करें: 2.5 ग्राम पेप्टोन, 3 ग्राम एनएसीएल, 7 ग्राम एगर, 10 ग्राम एगर, और 975 एमएल बाँझ पानी16। सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा 1 एल टेप फ्लास्क के लिए एक पन्नी टोपी के बराबर होती है।
    नोट: एनजीएमए के लिए तैयारी कदम के रूप में यहां वर्णित २.५ LSCPs के लिए पर्याप्त सामग्री निकलेगा । प्रोटोकॉल को दिए गए प्रयोग में आवश्यक एलएससीपी बैच आकार के अनुरूप किया जा सकता है।
  2. तरल चक्र पर 121 डिग्री सेल्सियस और 45 मिनट के लिए 21 पी.एस.आई. पर ऑटोक्लेव।
  3. पानी स्नान चालू करें और 50 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के लिए पानी स्नान करने के लिए ऑटोक्लेवेड एनजीएमए लाओ।
  4. एनजीएमए के 2 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क को हुड या साफ किए गए स्थान में लाएं और हलचल प्लेट पर सेट करें। एनजीएमए तापमान को ट्रैक करने के लिए थर्मामीटर का उपयोग करें।
  5. एनजीएमए के बाद 50 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया है, हुड या साफ अंतरिक्ष के अंदर एक बाँझ डिस्पोजेबल पिपेट के साथ सूचीबद्ध आदेश में निम्नलिखित जोड़ें: 1 एम KH2पीओ4 (कश्मीर फॉस्फेट बफर), कोलेस्ट्रॉल के 1 एमएल (इथेनॉल में 5mg/mL), 1 मीटर की 25 एमएल 1 एम सीएसीएल2,1 एम एमजीएसओ 4 का1एमएल, 1 एमएल ऑफ नास्टेटिन (10 मिलीग्राम/एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम/एमएल)16का 1 एमएल ।
  6. एनजीएमए के 400 एमएल को बाँझ ग्लास एलएससीपी में डालें, लगभग 1.3 सेमी गहरी, एलएससीपी को हुड में सपाट सतह पर जमना और ऑटोक्लेव्ड फॉइल ढक्कन को वापस एलएससीपी पर रखने की अनुमति दें।
  7. एक बार एगर सेट होने के बाद, पन्नी को हटा दें, और एलएससीपी पर एक साफ हवा-तंग ढक्कन रखें और भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जाएं। 5 दिनों के भीतर उपयोग और उपयोग में जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एलएससीपी में एनजीएमए स्टोर करें।

3. एलएससीपी पर एनजीएमए के लिए ई कोलाई भोजन उत्पन्न करें

  1. एक स्थिर खाद्य स्रोत उत्पन्न करने के लिए, केंद्रीय सीमा प्रमेय 17 के अनुरूप एक छोटे बैच औसत अवधारणा का उपयोग करकेHT115(DE3) ई. कोलाई के बैच उत्पन्न करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। जब जरूरत ई. कोलाई बैक्टीरियल स्टॉक (एस) से-८० डिग्री सेल्सियस सेगल 18
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, ई. कोलाई बैक्टीरियल स्टॉक एक बायोरिएक्टर में उगाए गए थे। संस्कृति के विकास के अंत में, संस्कृति 1:50 पतला था, और मापा OD६०० ०.४ था । इस प्रकार, संस्कृति 20 के एक प्रभावी आयुध डिपो६०० था । बैक्टीरिया को 0.5 ग्राम/एमएल (गीले वजन) की एकाग्रता पर कश्मीर माध्यम में गोली, तौला और पुनः निलंबित किया गया था, जो 2 एमएल एलिकोट्स में स्थानांतरित हो गया था, और जमेहुए 19।

4. NGMA पर बैक्टीरियल लॉन

  1. NGMA LSCPs को 4 डिग्री सेल्सियस से बाहर लाने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) बैक्टीरियल लॉन फैलाने से पहले कई घंटे के लिए पूरे LSCP तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. बाहर खींचने की जरूरत ई. कोलाई बैक्टीरियल स्टॉक (ओं) से-८० डिग्री सेल्सियस सेगल 18
  3. तनु ई कोलाई बैक्टीरियल स्टॉक (एस) बाँझ कश्मीर के 2 मिलीलीटर के साथ मध्यम 4 एमएल प्रति एनजीएमए एलएससीपी में 0.5 ग्राम ई. कोलाई प्राप्त करने के लिए। एनजीएमए एलएससीपी के बीच में ई कोलाई के 4 एमएल को ध्यान से पिपेट करें।
  4. एक बाँझ स्प्रेडर का उपयोग करने के लिए एक आयत में बैक्टीरिया फैल एनजीएमए ई. कोलाई मुक्त के किनारों के आसपास कमरे के लगभग ३.८ सेमी छोड़ ।
  5. ई. कोलाई निलंबन पूरी तरह से सूख जाता है सुनिश्चित करने के लिए 1 घंटे के लिए पर प्रशंसक के साथ हुड में ई. कोलाई के साथ NGMA LSCP छोड़ दें ।
  6. एक बार बैक्टीरियल लॉन सूखी है, कसकर पर ढक्कन धक्का और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक इस्तेमाल किया ।

5. नमूनों में तनाव और उम्र परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए हिस्सा कीड़े

  1. एक जमे हुए कीड़े भंडार से लकीर कीड़े एक नए वरीयता प्राप्त 6 सेमी प्लेट4के लिए । यह प्लेट "मास्टर हिस्सा" प्लेट के रूप में काम करेगी।
    नोट: एक होमोज़िगस तनाव20से कीड़े स्थानांतरित करने के लिए एक इष्टतम तरीका है । यदि एक तनाव विषम है या उठा और संभोग द्वारा बनाए रखने की जरूरत है, तो चंकिंग उचित नहीं है। इस्तेमाल किए गए कृमि जीनोटाइप, विकास के लिए चुने गए तापमान और डाउनस्ट्रीम चरणों के आधार पर चंकिंग फ्रीक्वेंसी को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  2. मास्टर हिस्सा प्लेट के बाद स्वस्थ ग्रेविड वयस्कों (लगभग 3 दिन) ई. कोलाई लॉन के बहुत से अभी भी मौजूद है, मानक सी elegans chunking दिशा निर्देशों का पालन के रूप में WormBook में वर्णित करने के लिए चार कुल हिस्सा प्लेटें4का उत्पादन ।
  3. सभी हिस्सा प्लेटों को नियंत्रित तापमान (सीटी) कमरे में 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि अन्यथा विकास के लिए निर्दिष्ट न हो।
    नोट: यदि इस प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ताओं के पास सीटी कक्ष तक पहुंच नहीं है जैसा कि यहां वर्णित है तो या तो एक छोटे इनक्यूबेटर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जहां तापमान को नियंत्रित किया जा सकता है या एक नामित कमरा जहां पर्यावरणीय स्थितियों को यथासंभव नियंत्रित किया जा सकता है। यदि इनमें से कोई वैकल्पिक विकल्प उपलब्ध नहीं है, तो ध्यान दें कि नमूना वृद्धि में भिन्नता अधिक हो सकती है।
  4. एक बार कई ग्रेविड वयस्कों को 4 हिस्सा प्लेट में मनायाजाता है, तो चरण 6 पर जाएं।

6. एलएससीपी पर स्पॉट ब्लीचिंग ग्रेविड वयस्कों

नोट: इस ब्लीचिंग तकनीक का उपयोग अधिकांश संदूषकों को समाप्त करने और वयस्क कीड़े से भ्रूण को छोड़ने वाले हर्मेफ्रोडाइट्स के क्यूटिकल को भंग करने के लिए किया जाता है। ब्लीच समाधान भ्रूण हैचिंग से पहले NGMA में सोख जाएगा ।

  1. एलएससीपी को स्पॉट ब्लीचिंग कीड़े से पहले कई घंटों तक आरटी में लाएं।
  2. डीडीएच 2 ओ का7:2:1अनुपात तैयार करें: ब्लीच: 5 एम नाओएच। उपयोग से ठीक पहले इस क्षारीय हाइपोक्लोराइट समाधान को ताजा करें।
    नोट: ब्लीच बैच प्रभावित से बचने के लिए दिए गए प्रयोग की अवधि के दौरान ब्लीच और NaOH के एक ही स्टॉक का उपयोग करें । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाले ब्लीच में 5-10% सोडियम हाइपोक्लोराइट था।
  3. एक Bunsen बर्नर प्रकाश और आगे बढ़ने से पहले एक कीड़ा लेने लौ । एलएससीपी पर बैक्टीरियल लॉन के किनारे से एक बाँझ लेने पर ताजा ई. कोलाई स्कूप ।
  4. स्पॉट ब्लीचिंग के लिए 4th चंक प्लेट से एक भी ग्रेविड वयस्क चुनें।
  5. ई. कोलाई लॉन से दूर एलएससीपी के एक कोने में क्षारीय हाइपोक्लोराइट समाधान के पिपेट 5 माइक्रोन।
  6. उठाया ग्रेविड वयस्क 5 μL क्षारीय हाइपोक्लोराइट समाधान में रखें। क्यूटिकल को बाधित करने और अंडे छोड़ने में मदद करने के लिए नेमाटोड पर टैप करें।
  7. कुल 4x के लिए कदम 6.4 - 6.6 दोहराएं और ई. कोलाई लॉन के चारों ओर समान रूप से 5 ग्रेविड वयस्कों को रखें। लगभग आनुवंशिक रूप से आइसोजेनिक व्यक्तियों को दिए गए नमूने में जोड़ाजाता है सुनिश्चित करने के लिए एक ही 4 हिस्सा प्लेट से सभी 5 ग्रेविड वयस्कों उठाओ ।
  8. ढक्कन को वापस एलएससीपी पर रखें।
  9. सभी एलएससीपी के लिए दोहराएं कदम।

7. नियंत्रित तापमान (सीटी) कमरे में कृमि वृद्धि

  1. स्पॉट ब्लीचिंग के बाद, ढक्कन को एलएससीपी पर कसकर रखें और सीटी रूम में लगातार एयरफ्लो और 12 एल: 12डी फोटोपीरियोड (12 एच लाइट और 12 एच अंधेरा) के साथ 20 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
  2. सीटी रूम में सैंपल कहां रखा गया था, उस समय और स्थिति पर ध्यान दें।
    नोट: कमरे के भीतर की स्थिति हमेशा किसी भी पर्यावरण मतभेद है कि नमूने है कि संभावित मुठभेड़ सकता है, जबकि बढ़ रिकॉर्ड प्रलेखित किया जाना चाहिए । एक बार नमूना सीटी कक्ष में है, यह अपने सौंपा जगह में अशान्त रहना चाहिए । दूषित होने की संभावना को कम करने के लिए सीटी कक्ष में एलएससीपी का ढक्कन न खोलें।
  3. जनसंख्या वृद्धि और घनत्व का निरीक्षण करने के लिए सीटी कक्ष के बाहर एलएससीपी को माइक्रोस्कोप में ले जाएं।
    नोट: प्रत्येक सी elegans तनाव और नमूना इसके विकास में भिंन होगा, तो बारीकी से नमूनों की निगरानी । हालांकि सीटी रूम में एलएससीपी की ग्रोथ को डिस्टर्ब न करने की सिफारिश की जाती है, लेकिन सैंपल ग्रोथ पर नजर रखने के लिए हर 2 दिन में एलएससीपी को सीटी रूम से बाहर ले जाया जाता था। एलएससीपी से हर 2 दिन में सीलबंद ढक्कन लेना भी ओ2 को एलएससीपी में प्रवाहित करने की अनुमति देता है।
  4. कटाई से पहले यह सुनिश्चित करें कि एलएससीपी कीड़े की एक बड़ी आबादी से भरा हो गया है। एलएससीपी एकत्र करने के लिए तैयार है, यह तय करने के लिए निम्नलिखित मानदंडों का उपयोग करें।
    1. सुनिश्चित करें कि एलएससीपी ग्रेविड वयस्क कीड़े से भरा हुआ है।
    2. सुनिश्चित करें कि प्लेट में एक बड़ी आबादी का आकार होता है (यानी, कीड़े आगर की पूरी सतह को कवर करते हैं)।
    3. सुनिश्चित करें कि प्लेट में आगर की सतह पर कई अंडे नहींहैं (यानी,अधिकतम कीड़े की संख्या रची जाना चाहिए थी)।
    4. सुनिश्चित करें कि प्लेट में कम से कम ई. कोलाई नहीं है, यह दर्शाता है कि कीड़े भूखे होंगे और यदि प्लेट पर अतिरिक्त दो दिनों के लिए छोड़ दिया जाए तो डौयर लार्वा उत्पन्न होगा।
      नोट: हालांकि अधिकांश एलएससीपी तनाव और नमूने के आधार पर 10 से 20 दिनों के बीच फसल के लिए तैयार हैं, सामान्य फसल समय निर्धारित करने के लिए इस प्रोटोकॉल की स्थापना पर अक्सर प्रत्येक एलएससीपी की जांच करें।
  5. उपभेदों के बीच क्रॉस संदूषण से बचने के लिए एलएससीपी को संभालने के बीच 70% इथेनॉल के साथ साफ दस्ताने और क्षेत्र।

8. एलएससीपी नमूने की कटाई

  1. चालू करें और नमूनों की कटाई से पहले अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
  2. काटा जा करने के लिए प्रति एलएससीपी M9 समाधान के 50 एमएल के साथ तीन 50 एमएल शंकु ट्यूब तैयार करें।
  3. एलएससीपी प्रति एक 15 एमएल शंकु नली लेबल करें।
    नोट: सभी अपकेंद्रित्र कदम 15 एमएल शंकु नली में किए जाते हैं, क्योंकि कीड़े इन ट्यूबों में अच्छी तरह से गोली करते हैं।
  4. एलएससीपी सतह पर एम9 समाधान (चरण 8.2 में एक 50 एमएल शंकु नली से) के 50 एमएल डालें और यह सुनिश्चित करने के लिए चारों ओर घूमता है कि एम 9 पूरे एनजीएमए सतह को कवर करता है।
  5. जबकि M9 LSCP सतह पर बैठता है, प्रधानमंत्री M9 के साथ एक बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट ।
    नोट: M9 के साथ बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट को भड़काना यह सुनिश्चित करता है कि कम कीड़े प्लास्टिक पिपेट के अंदर चिपके रहते हैं, नमूना हानि को रोकते हैं।
  6. एलएससीपी को झुकाएं तो M9 और कीड़ा आबादी एलएससीपी के एक कोने में इकट्ठा होती है।
    नोट: एलएससीपी से M9 समाधान और कीड़े के मिश्रण को डाउनस्ट्रीम चरणों में "कृमि निलंबन" के रूप में संदर्भित किया जाएगा।
  7. एक स्वचालित पिपेटर, पिपेट वर्म सस्पेंशन के साथ एक प्राइमेड सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करना और मूल 50 एमएल शंकु नली में रखें। एक बार 50 एमएल कीड़ा निलंबन एकत्र हो जाने के बाद, बैक्टीरिया झुरमुट और मलबे को बाधित करने के लिए शंकु नली को एक घुमाव पर रखें।
  8. दोहराएं कदम 8.4 - 8.7 एलएससीपी प्रति कृमि निलंबन के 150 एमएल का संग्रह।
  9. 15 एमएल रीस्पेंशन को तीन 50 एमएल शंकु नलियों में से एक से स्थानांतरित करें, एक लेबल 15 एमएल शंकु नली में डाल कर कदम 8.3 में अलग सेट करें। सेंट्रलाइज 15 एमएल शंकु नली 884 एक्स जी पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। अधिकांश कीड़े ट्यूब के नीचे गोली चलेंगे।
  10. कीड़ा गोली को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए सुपरनेट बंद आकांक्षी।
  11. एक ही 15 एमएल शंकु नली दोहरा कदम 8.9 और 8.10 के लिए कृमि निलंबन के लगभग 13 एमएल जोड़ने जारी रखें जब तक कि सभी 150 एमएल कृमि निलंबन का सेवन न हो जाए। ट्यूब को उलटें और जितना संभव हो उतना बैक्टीरिया और मलबे को धोने और बंद करने के लिए अपकेंद्री के बीच गोली को परेशान करें।
    नोट: इस कदम पर, सभी तीन 50 एमएल शंकु ट्यूबों से सामग्री एक 15 एमएल ट्यूब में गाढ़ा कर रहे हैं।
  12. 15 एमएल शंकु नली में स्वच्छ M9 के 10 एमएल जोड़ें और उलटा करके कीड़ा गोली उत्तेजित करें। सेंट्रलाइज 15 एमएल शंकु नली 884 एक्स जी पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। कीड़ा गोली को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए सुपरनेट बंद आकांक्षी। दो बार दोहराएं।
    नोट: यदि नमूने में मलबे या बैक्टीरिया की एक बड़ी मात्रा है, तो नमूना साफ होने तक 8.12 चरण दोहराएं।
  13. एक बार नमूना साफ होने के बाद, डीडीएच2ओ और कीड़े के कुल 10 एमएल के लिए कीड़ा गोली में डीडीएच2ओ जोड़ें। उलटा कर कीड़ा गोली को उत्तेजित करें। 9.1 चरण में जल्दी से आगे बढ़ें, क्योंकि कीड़े को ओस्मोटिक तनाव से बचने के लिए 5 मिनट या उससे कम समय के लिए डीडीएच2ओ में रहना चाहिए।
    नोट: डीडीएच2ओ में कृमि छर्रों को निलंबित करना डाउनस्ट्रीम-ओमिक्स चरणों के लिए पसंदीदा सॉल्वेंट है। यदि वे दिए गए प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह के साथ संगत हैं तो कीड़े को अन्य सॉल्वैंट्स या बफ़र्स में निलंबित किया जा सकता है।

9. जनसंख्या के आकार का अनुमान

नोट: चरण 9.1 - 9.7 जल्दी से आगे बढ़ें। चरण8.13से डीडीएच 2 ओ और कीड़े के मिश्रण को बाद के चरणों में "कृमि नमूना" के रूप में जाना जाता है।

  1. कीड़े के नमूने को पाइपिंग करने से पहले, प्राइम पिपेट टिप का उपयोग एम 9 के साथ किया जाना चाहिए ताकि प्लास्टिक पिपेट के अंदर चिपके हुए कीड़े से बचा जा सके जो नमूना हानि को रोकता है और गिनती भिन्नता को कम करता है।
  2. कृमि के नमूने का 100 μL aliquot लें और इसे एम 9 के 900 माइक्रोन में पतला करें। अच्छी तरह से मिलाएं और एक धारावाहिक कमजोर पड़ने (1:10, 1:100, 1:1000) बनाते हैं। इस चरण को दो बार दोहराएं ताकि अलीकोट प्रतिकृति के कुल तीन सेट प्राप्त किए जा सके।
    नोट: पिपटिंग कीड़े नमूना जनसंख्या गिनती में उच्च परिवर्तनशीलता पैदा कर सकता है। सुनिश्चित करें कि वांछित एलिकोट को पाइप करने से पहले कीड़ा नमूना समरूप है।
  3. एक घुमाव पर 15 एमएल शंकु ट्यूब सेट करने के लिए संस्कृति चलती जारी है, जबकि aliquots गिना जाता है ।
  4. सुनिश्चित करें कि कीड़ा नमूना अच्छी तरह से मिश्रित और समरूप है। 1:10 कीड़े के नमूने से पिपेट 5 माइक्रोल, इसे माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर वितरित करें, और कीड़े की संख्या गिनें। यदि यह संख्या लगभग 50 कीड़े से कम है, तो 1:100 और 1:1000 कमजोर पड़ने की भी गणना करें। अगर यह 50 से ज्यादा है तो अगले सीरियल तनुज की ओर बढ़ें।
    नोट: यदि बहुत सारे कीड़े सही नहीं गिना जा सकता है, बजाय गिनती के लिए अगले धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग करें ।
  5. प्रत्येक कमजोर पड़ने 3x के प्रत्येक aliquot दोहराने की गिनती। मतगणना के अंत में, अधिकांश संस्कृतियों के लिए, 9 कुल गिनती प्रलेखित की जाएगी(यानी,प्रत्येक अलीकोट दोहराने के लिए 3 कुल गिनती)।
  6. औसत कमजोर पड़ने की गिनती कीड़ा नमूने के अनुमानित जनसंख्या आकार निर्धारित करने के लिए। ये कमजोर पड़ने की गिनती-omics कदम के लिए वांछित aliquot आकार बनाने के लिए आवश्यक कीड़ा नमूने की मात्रा का निर्धारण करेगा ।
    नोट: इस प्रयोग में, लगभग 200,000 मिश्रित चरण कीड़े के aliquots उत्पन्न किए गए थे। इसके अलावा, एक बड़े कण प्रवाह साइटोमीटर (चरण 10 में वर्णित) में छंटाई के लिए लगभग 50,000 मिश्रित चरण कीड़े का एक एलिकोट अलग रखा गया था।
  7. एक बार कृमि के नमूने को उपयुक्त aliquots में विभाजित किया गया है, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर।
    नोट: बड़े कण प्रवाह साइटोमेट्री के लिए इरादा aliquot फ्रीज मत करो ।

10. (वैकल्पिक) बड़े कण प्रवाह साइटोमेट्री के लिए नमूना प्रीपिंग

नोट: चरण 10, 11, और 12 नमूना वृद्धि(यानी,जनसंख्या का आकार और सी elegans जीवन चक्र चरणों की जनसंख्या वितरण) रिकॉर्ड करने के लिए लेखकों की पसंदीदा विधि है और एक संस्कृति की सफलता का निर्धारण कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ता विकास की सफलता के अपने मैट्रिक्स के साथ वैकल्पिक चरण 10, 11 और 12 को प्रतिस्थापित कर सकते हैं। चरण 10, 11, और 12 यहां दो कारणों से वर्णित हैं; पहला, इसलिए जिन उपयोगकर्ताओं के पास चरण 10, 11 और 12 में उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं, वे इस विकास विधि के सत्यापन को दिखाने के लिए इन चरणों और दूसरे को दोहरा सकते हैं। ऊपर चरण 9 एलिकोट आकार निर्धारित करने के लिए कीड़े की कुल संख्या का एक अच्छा अनुमान प्रदान करता है, और चरण 10 किसी दिए गए नमूने में कीड़े की संख्या और जनसंख्या वितरण का अनुमान लगाने के लिए एक अधिक मात्रात्मक मीट्रिक है।

  1. एम 9 समाधान में 10 एमएल कुल मात्रा तक लगभग 50,000 मिश्रित चरण कीड़े (चरण 9.6 में अलग सेट) का एलिकोट लाएं।
  2. ई कोलाई के 1 मिलीग्राम/एमएल से बना एक समाधान बनाएं और 0.5 माइक्रोसेम के 1:50 कमजोर पड़ने19
  3. M9 में मिश्रित चरण कीड़े के 10 मिलील के लिए इस समाधान के 200 μL जोड़ें और 20 मिनट के लिए कमाल करते हुए इनक्यूबेट।
  4. 20 मिनट के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 884 x ग्राम पर 15 एमएल शंकु नली को अपकेंद्रित्र करें।
  5. कीड़ा गोली को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए सुपरनेट बंद आकांक्षी।
  6. अतिरिक्त बैक्टीरिया और लाल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर को खत्म करने के लिए M9 समाधान के साथ दो बार कीड़ा गोली धोएं।
  7. कीड़ा गोली के लिए M9 के 5 एमएल जोड़ें और सुनिश्चित करें कि गोली साफ लग रहा है। यदि गोली साफ है, तो 50 एमएल सोडियम एजाइड के साथ एम 9 के 5 एमएल को सीधा करें और सटीक गिनती और आकार लेने के लिए कीड़े को मारदें।
  8. दस्तावेज़ समय और तारीख जब सोडियम एजाइड को नमूने में जोड़ा जाता है।
  9. बड़े कण प्रवाह साइटोमेट्री के लिए आवश्यक होने तक घुमाव पर नमूना अलग सेट करें।
    नोट: सोडियम एजाइड को नेमाटोड फिजियोलॉजी(यानी,शरीर की लंबाई, मेटाबोलिज्म और थर्मोटॉलेंस) को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है। इसलिए, सोडियम एजाइड के संपर्क में आने वाले समय पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है क्योंकि इनमें से कई शारीरिक प्रभाव22मिनट के भीतर होते हैं । कीड़े पर सोडियम एजाइड के ज्ञात शारीरिक प्रभावों के कारण, यह उपचार डाउनस्ट्रीम छवि की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा और इस पर विचार किया जाना चाहिए।

11. (वैकल्पिक) जनसंख्या वितरण का दस्तावेजीकरण और इमेजिंग के लिए ३८४-अच्छी तरह से थाली prepping

नोट: चरण 11 एक बड़े कण प्रवाह साइटोमीटर (एलपीएफसी) का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल में एलपीएफसी का बुनियादी ज्ञान ग्रहण किया जाता है। नमूनों की वृद्धि और जनसंख्या वितरण को दस्तावेज करने के लिए अन्य तरीकों को प्रतिस्थापित किया जा सकता है। यहां प्रलेखित कदम उन उपयोगकर्ताओं के लिए हैं जो अपनी पाइपलाइन23में एलपीएफसी का उपयोग करने की योजना बना रहे हैं ।

  1. चालू करें, साफ करें और एलपीएफसी को प्राइम करें, और नमूनों को छांटने से पहले लेजर (एस) को 1 घंटे के लिए गर्म करने की अनुमति दें।
  2. लेजर गर्म होने के बाद, 2050 के'हिस्टोग्राम'प्रोफाइल और स्केल को एक टाइम ऑफ फ्लाइट (TOF) खोलें।
  3. 100 की एक TOF रेंज में फैले"हिस्टोग्राम"में एक बार क्षेत्र जोड़ें। पहला बार क्षेत्र 50-150 के एक TOF को शामिल किया गया ।
  4. 100 की एक TOF रेंज फैले प्रत्येक बीस बार क्षेत्रों बनाने के लिए जारी रखें। ये बार क्षेत्र पूरे TOF रेंज 50 - 2050 से विस्तारित होंगे। TOF वितरण में उपयोग करने के लिए सटीक गेटेड क्षेत्रों के लिए अनुपूरक तालिका 1 देखें।
  5. भविष्य एलपीएफसी रन में उपयोग करने के लिए एक"प्रयोग"के रूप में स्थापित इस हिस्टोग्राम को सहेजें।
  6. वस्तुओं को वितरित करने के लिए 384-अच्छी तरह से प्लेट या कैलिब्रेट उपकरण को 384-अच्छी तरह से प्लेट में चुनें।
  7. एक बार कैलिब्रेटेड 384-वेल प्लेट टेम्पलेट में, चरण 11.3-4 के दौरान बनाए गए 20 बार क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए चार कुओं (प्रत्येक गेटेड क्षेत्र की चार तकनीकी प्रतिकृति) में 20 गेटेड वस्तुओं को वितरित करने के लिए टेम्पलेट सेट करें। 384-वेल प्लेट में कीड़े को वितरित करने के उदाहरण के लिए पूरक तालिका 2 देखें।
  8. स्टेप 10.9 से 50 एमएल शंकु नली में नमूना स्थानांतरित करें और लगभग 40 एमएल कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त एम 9 समाधान जोड़ें।
  9. स्टेप 11.7 में सेट किए गए मापदंडों के अनुसार नमूने को स्वचालित रूप से छांटना शुरू करें, जबकि नमूने को व्यवस्थित करने से रोकने के लिए लगातार हिलाते हैं और साथ ही नमूने से वस्तुओं को कैलिब्रेटेड 384-वेल प्लेट में वितरित करते हैं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि एलपीएफसी की प्रवाह दर प्रति सेकंड 15-20 वस्तुओं के बीच काम कर रही है और हल करने के लिए कोई युगल निर्दिष्ट नहीं करती है।
  10. एक बार पूरे नमूना हल किया गया है और gated क्षेत्रों की अधिकतम संख्या ३८४-अच्छी तरह से थाली में तिरस्कृत किया गया है, LPFC और स्वच्छ उपकरण से नमूना ले ।
    नोट: जब बड़े TOF क्षेत्रों तक पहुंच रहे हैं, यह चुनौतीपूर्ण हो सकता है कि TOF क्षेत्र में कम घटना मायने रखता है के कारण ३८४ अच्छी तरह से थाली को भरने के लिए जारी रखने के लिए । जहां सी elegans जीवन चरणों LPFC वितरण के भीतर आने के नमूने से बाहर चलाने से पहले का सबसे अच्छा विचार प्राप्त करने के लिए संभव के रूप में gated क्षेत्रों के कई भरें ।
  11. इमेज्ड तक 384-वेल प्लेट के शीर्ष पर एक सीलिंग फिल्म रखें।
    नोट: इमेज प्लेट छंटाई के बाद जितनी जल्दी हो सके क्योंकि नमूनों सोडियम azide22के साथ इलाज कर रहे हैं । लाल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर एकत्र एलपीएफसी डेटा फाइलों में देखा जा सकताहै (यानी उत्पादन पाठ फ़ाइल में पीएच लाल डेटा) प्रत्येक क्रमबद्ध वस्तु में उत्सर्जित लाल फ्लोरेसेंस के स्तर के आधार पर यह पहचानने में मदद करने के लिए कि कौन सी वस्तुएं जीवित कीड़े, मृत कीड़े, डौर, या जंक24हैं।

12. (वैकल्पिक) इमेजिंग ३८४-अच्छी तरह से थाली

नोट: चरण 12 प्लेट-रीडिंग माइक्रो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल में माइक्रो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का बुनियादी ज्ञान ग्रहण किया जाता है। नमूनों की वृद्धि और जनसंख्या वितरण को दस्तावेज करने के लिए अन्य तरीकों को प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

  1. 20x लेंस के साथ प्लेट-रीडिंग माइक्रो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना।
  2. "ऑब्जेक्टिव एंड कैमरा"टैब खोलें और"10x प्लान एपोलम्ब्डा"मोड पर सेट करें।
  3. "कैमराबिनिंग"टैब खोलें और"2"के लिए सेट करें।
  4. "साइट्स टू विजिट ऑन प्लेट"टैब खोलें और"4"साइटों को अच्छी तरह से और"ओवरलैप साइटों को 10%"बाद में छवियों को एक साथ सिलाई करने के लिए सेट करें।
  5. ओपन"तरंगदैर्ध्य"टैब और सेट"ब्राइटफील्ड 1"।
  6. "रोशनी"टैब खोलें और"संचारित प्रकाश, उज्ज्वल नमूना" केलिए सेट करें।
  7. माइक्रोस्कोप में 384-वेल प्लेट रखें और"जेड स्टैक"सेट करने के लिए"ऑफसेट की गणनाकरें" और 384-अच्छी प्लेट में नमूनों के लिए उचित फोकल प्लेन ढूंढें।
  8. माइक्रो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 384-वेल प्लेट चलाएं जो चार छवियों को अच्छी तरह से इकट्ठा करते हैं।
  9. असेंबल चार छवियों को एक साथ अच्छी तरह से प्रति एक छवि बनाने के लिए ।

Representative Results

एलएससीपी विधि का उपयोग करके सी एलिगेंस की वृद्धि 12.2 दिनों में प्रति नमूना लगभग 2.4 मिलियन मिश्रित चरण कीड़े की औसत पैदा करती है। एलएससीपी विधि का उपयोग करके सी एलिगेंस का विकास उपयोगकर्ताओं को जानवरों की थोड़ी हैंडलिंग और हेरफेर के साथ सी एलिगेंस की बड़ी मिश्रित चरण आबादी उत्पन्न करने में सक्षम बनाता है, जो बड़े पैमाने पर -ओमिक्स अध्ययन(चित्रा 1)के लिए आदर्श है। एक बार एक LSCP वयस्क कीड़े से भरा हो गया है, एक बड़ी आबादी के आकार तक पहुंच गया है, और ंयूनतम बैक्टीरिया छोड़ दिया है, उपयोगकर्ताओं को फसल और जनसंख्या के आकार का अनुमान कर सकते हैं । यह बिंदु यह मूल्यांकन करके गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में भी काम कर सकता है कि क्या जनसंख्या -ओमिक्स पाइपलाइन(चित्रा 2)में उपयोग करने के लिए पर्याप्त है। जनसंख्या गतिशीलता तनाव पर ही निर्भर हैं, तनाव के व्यवहार(यानी,बिलिंग उपभेदों को कम कीड़ा वसूली के लिए खड़ा है), और विकास की सफलता(यानी,संदूषण)। एलएससीपी विधि का परीक्षण सी एलिगेंस के 15 उपभेदों पर किया गया था जिसमें कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) म्यूटेंट और कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस प्राकृतिक विविधता संसाधन (CeNDR) जंगली उपभेदों25का मिश्रण था। अनुपूरक तालिका 3में तनाव जीनोटाइप का वर्णन किया गया है ।

एलएससीपी विधि ने जनसंख्या के आकार को लगभग 94,500 से 9,290,000 तक पहुंचाया। संदर्भ तनाव, PD1074 के भीतर मतलब जनसंख्या का आकार, और उपभेदों में लगभग 2.4 मिलियन कीड़े(चित्रा 3)था। 12.2 एलएससीपी विकास दिवसों(चित्रा 4)के औसत के दौरान सी एलिगेंस उपभेदों के बीच अनुमानित जनसंख्या आकार में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। PD1074 LSCPs एक पूर्ण मिश्रित चरण की आबादी के लिए विकसित करने के लिए 10-14 दिनों के बीच ले लिया । PD1074 में मतलब विकास का समय 10 दिन था । सबसे धीमी बढ़ती तनाव अधिकतम 20 दिनों के लिए बढ़ी, और सबसे तेजी से बढ़ते तनाव कम से कम 10 दिनों(चित्रा 4)के लिए बढ़ी।

इसलिए, इस एलएससीपी विधि का उपयोग करके, उपयोगकर्ता विकासात्मक समय और पृष्ठभूमि विशेषज्ञता के कम ज्ञान के साथ एक अध्ययन में रुचि के नए उपभेदों को आसानी से एकीकृत कर सकते हैं। ध्यान दें कि उपभेदों और फेनोटाइप जिन्हें उठाकर बनाए रखना है, fecundity दोष है, विषम हैं, या विकास दोष हैं, इस पाइपलाइन में अच्छी तरह से काम नहीं कर सकते हैं।

बड़े कण प्रवाह साइटोमेट्री और नमूनों की इमेजिंग उपयोगकर्ताओं को जनसंख्या वितरण दस्तावेज़ करने के लिए अनुमति देता है । सफल जनसंख्या वृद्धि को मापने के लिए विभिन्न प्रकार के प्लेटफार्मों का उपयोग किया जा सकता है।

प्रजनन-ओमिक्स माप के लिए, लगातार संस्कृतियों को विकसित करना महत्वपूर्ण है। संस्कृति प्रजनन क्षमता के मैट्रिक्स कीड़े की संख्या और एक दिए गए तनाव के लिए एक सुसंगत आकार वितरण कर रहे हैं । हम संदर्भ तनाव के लिए नमूना वितरण दिखाते हैं, PD1074 - मूल N2 ब्रिस्टल तनाव का एक संस्करण, विकास की सफलता के लिए प्रॉक्सी के रूप में एलपीएफसी23,26 और माइक्रो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवियों का उपयोग करके। चूंकि एल1 चरण से एलपीएफसी वितरण(चित्रा 5),बाद में इमेजिंग(चित्रा 6)पर ग्रेविड वयस्क के माध्यम से कीड़े को मापा गया था और नमूनों(चित्र 7)में जनसंख्या वितरण में भिन्नता के कारण हम देख सकते हैं कि इस पाइपलाइन ने सी एलिगेंसकी मिश्रित चरण की आबादी उत्पन्न की है ।

हमारे मिश्रित चरण के नमूनों के जनसंख्या वितरण को करीब से देखने के लिए, हमने उड़ान के पूरे समय (TOF)(यानी,शरीर की लंबाई) वितरण (चित्र 7ए, बी)में प्रत्येक क्षेत्र के भीतर आने वाले कीड़े के प्रतिशत को देखकर 35PD1074एलएससीपी के वितरण को देखा।

Figure 1
चित्रा 1: एलएससीपी कृमि विकास पाइपलाइन का अवलोकन। (क)एक बार प्रयोगशाला में प्राप्त होने के बाद, सभी उपभेदों को तैयार किया गया था और -80 डिग्री सेल्सियस 2 पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए जमेहुएथे। (ख)एक "मास्टर हिस्सा" प्लेट एक जमे हुए कीड़ा स्टॉक से तैयार किया गया था और 15 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए एक महीने से अधिक समय के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । (ग)प्रत्येक नमूने को एलएससीपी पर बढ़ने से पहले पीढ़ीगत तनाव को कम करने के लिए लगातार चार चंकिंग कदमों से गुजरना पड़ता है । (घ)5 व्यक्तिगत ग्रेविड वयस्कों को स्टेप (डी) में "हिस्सा 4" 6 सेमी प्लेट से चुना गया था और एलएससीपी के पांच दिए गए क्षेत्रों पर ब्लीच किया गया था। (ई)एलएससीपी को एक नियंत्रित तापमान कक्ष में रखा गया था और 20 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था जब तक कि एलएससीपी वयस्क कीड़े से भरा नहीं था, एक बड़ी जनसंख्या के आकार तक पहुंच गया था, और उसके पास न्यूनतम बैक्टीरिया रह गया था। (च)कीड़ा आबादी को काटा गया और डाउनस्ट्रीम चरणों के लिए एकत्र किया गया । (जी)एलिकोट्स एलएससीपी से बनाए गए थे और डाउनस्ट्रीम वांछित अनुप्रयोगों के लिए फ्लैश जमे हुए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एलएससीपी कटाई और जनसंख्या के आकार का आकलन का अवलोकन। (A)एनजीएमए सतह से कीड़े धोने के लिए एम9 के 50 एमएल का उपयोग किया गया था। वर्म सस्पेंशन को 50 एमएल शंकु नली में पिपेट किया गया था। चरण (ए) को दो बार दोहराया गया। (ख)15 एमएल वर्म सस्पेंशन को नई 15 एमएल शंकु नली में डाला गया । कीड़े अपकेंद्रित्र द्वारा गोली मार रहे थे । M9+ मलबे को बिना किसी परेशान किए कीड़ा गोली से बाहर कर दिया गया । जब तक सभी 150 एमएल कीड़ा निलंबन एकत्र नहीं किया गया तब तक चरण (बी) दोहराया गया था। (ग)शेष मलबे को खत्म करने के लिए एम9 के साथ तीन बार कीड़ा गोली को धोया गया और अपकेंद्री किया गया । एक बार नमूना साफ होने के बाद, कीड़ा गोली को डीडीएच2(डी)के 10 एमएल में फिर से निलंबित कर दिया गया था, कृमि जनसंख्या आकार का अनुमान लगाने के लिए नमूने का एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का निर्माण किया गया था। कमजोर पड़ने वाले कारक (ओं) का उपयोग सही ढंग से कीड़े की गणना करने की अनुमति दी गई थी। एलएससीपी की जनसंख्या के आकार के आधार पर इस्तेमाल किया जाने वाला कमजोर पड़ने वाला कारक (ओं) बदल जाता है। (ई)एक बार कमजोर पड़ने कारक (ओं) को चुना गया था, उस कमजोर पड़ने की तीनों एलिकोट प्रतिकृति से सभी कीड़े एक साफ स्लाइड पर पिपेट किए गए थे और कीड़े को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत गिना गया था । (एफ)नमूना उचित आकार के aliquots में विभाजित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: एलएससीपी विधि औसतन 2.4 मिलियन मिश्रित चरण कीड़े की आबादी पर उत्पन्न होती है। एलएससीपी में सबसे छोटी जनसंख्या वृद्धि में जनसंख्या का आकार लगभग 94,500 और सबसे बड़ी जनसंख्या वृद्धि लगभग 9,290,000 है। सभी उपभेदों में औसत जनसंख्या का आकार 2.4 मिलियन कीड़े था। सी elegans तनाव नाम के नीचे सलाखों से संकेत मिलता है कि क्या एक तनाव एक CGC उत्परिवर्ती या CeNDR प्राकृतिक अलग है । एलएससीपी नमूना आकार प्रत्येक तनाव के लिए प्रदर्शित किया जाता है। तुकी के एचएसडी टेस्ट का उपयोग करके सभी जोड़ों के लिए तुलना की गई। सी एलिगेंस उपभेदों (एफ (14,108) = 0.7, पी = 0.77) में अनुमानित जनसंख्या आकारों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। रंगीन सलाखों संबंधित सी elegans तनाव प्रतिनिधित्व के लिए मानक रंग प्रदर्शित करता है संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एलएससीपी विधि ने 10 - 20 दिनों में कीड़े की बड़ी मिश्रित चरण की आबादी उत्पन्न की। एक दिया सी elegans LSCP बढ़ी जब तक नमूना वयस्क कीड़े से भरा था, एक बड़ी आबादी के आकार तक पहुंच गया, और ंयूनतम जीवाणु लॉन छोड़ दिया था । LSCPs तनाव के आधार पर, एक पूर्ण मिश्रित चरण की आबादी के लिए विकसित करने के लिए 10-20 दिनों के बीच ले लिया । उपभेदों के पार मतलब विकास का समय १२.२ दिन था । एलएससीपी नमूना आकार प्रत्येक तनाव के लिए प्रदर्शित किया जाता है। प्रत्येक त्रुटि बार का निर्माण मतलब से 1 मानक विचलन का उपयोग करके किया गया था। एक ही पत्र से जुड़े नहीं स्तर काफी अलग हैं। तुकी के एचएसडी टेस्ट का उपयोग करके सभी जोड़ों के लिए तुलना। सी एलिगेंस उपभेदों (एफ (14,108) = 8.8, पी < 0.0001 *) में आवश्यक एलएससीपी पर विकास समय की मात्रा में एक महत्वपूर्ण अंतर पाया गया था। रंगीन सलाखों संबंधित सी elegans तनाव प्रतिनिधित्व के लिए मानक रंग प्रदर्शित करता है संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: मिश्रित जनसंख्या और जंगली प्रकार के संदर्भ तनाव, PD1074 के विकास माप । जंगली प्रकार के संदर्भ तनाव के एक एलएससीपी विकास का एक प्रतिनिधि एलपीएफसी वितरण, मूल एन 2 ब्रिस्टल तनाव का एक संस्करण, (PD1074) मिश्रित चरण की आबादी के आकार वितरण और घटना की गिनती को दस्तावेज करता है। एक्स-एक्सिस कीड़े की लंबाई (उड़ान का समय, TOF) हल करता है। वाई-एक्सिस कीड़े के ऑप्टिकल घनत्व (ऑप्टिकल विलुप्त होने, EXT) को हल करता है। प्रत्येक डेटा बिंदु एक कीड़ा है जिसे नमूने में प्रलेखित किया गया था। छवि विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाने वाला प्रत्येक TOF क्षेत्र एक अलग रंग में प्रदर्शित होता है। बीस TOF क्षेत्रों (R2 - R21) 50 से 2050 के एक TOF से लेकर बनाया गया था। प्रत्येक TOF क्षेत्र पर विवरण अनुपूरक तालिका 1 में पाया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: R2 से लेकर TOF क्षेत्रों से हल किए गए कीड़े की छवियां - R12 PD1074 LPFC वितरण दिखाते हैं। इस क्षेत्र में R2, L1 कीड़े की पहचान की जा सकती है और क्षेत्र में R9 मुख्य रूप से ग्रेविड वयस्कों की पहचान की जाती है, जो दो विकासात्मक लार्वा चरम सीमाओं को फैलाते हैं जो हमें प्रवाह साइटोमीटर वितरण के भीतर अनुमानित क्षेत्र देते हैं जहां वितरण में चरणों की उम्मीद की जाती है। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। प्रतिनिधि चित्र चित्र 5में प्रदर्शित एलपीएफसी वितरण से लिए गए थे और रंगीन बक्से चित्र 5के क्षेत्रों के अनुरूप हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: जंगली प्रकार के संदर्भ तनाव, PD1074 में उड़ान (TOF) क्षेत्रों के समय में जनसंख्या वितरण । पूरे TOF क्षेत्र में कीड़े का वितरण उन क्षेत्रों को दिखाता है जहां कीड़े पाए गए थे। प्रत्येक PD1074 एलएससीपी एक व्यक्ति के रंग के रूप में प्रतिनिधित्व किया है। (क)एक्स-एक्सिस बीस TOF क्षेत्रों (R2-R21) को दिखाया गया है और एलएससीपी के लिए गिना जाता है, जो पूरे आकार के वितरण को प्रदर्शित करता है । वाई-एक्सिस एक दिए गए एलएससीपी से कीड़े का प्रतिशत दिखाता है जिसमें शरीर का आकार था जो दिए गए TOF क्षेत्र में गिर गया था। (ख)के रूप में कीड़ा आबादी का एक छोटा सा अंश R7-R21 क्षेत्रों के बीच आता है, कीड़े के प्रतिशत है कि प्रत्येक क्षेत्र के भीतर गिर के लॉग जनसंख्या वितरण प्रदर्शित करने के लिए लिया गया था । एक्स-एक्सिस R7-R21 TOF क्षेत्रों को प्रदर्शित करता है। वाई-एक्सिस एक दिए गए एलएससीपी से कीड़े के प्रतिशत के लॉग को प्रदर्शित करता है जिसमें शरीर का आकार था जो दिए गए TOF क्षेत्र में गिर गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 1: विकास की स्थिति का औसत दैनिक तापमान (डिग्री सेल्सियस) जिसके तहत एलएससीपी उगाया गया था और संभाला गया था। नियंत्रित तापमान (सीटी) कक्ष के तापमान की सूचना प्रलेखित और नमूना विकास और संग्रह के छह महीने की अवधि में एकत्र किए गए थे । यहां औसत दैनिक तापमान बताया जाता है। जिस तापमान में एलसीएसपी परियोजना की अवधि के दौरान बढ़ा (एफ (5,24) = 2.59, पी = 0.0524) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था। पूरे तापमान अंतर नमूना वृद्धि और उत्पादन की छह महीने की अवधि में ०.००३ डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं फैला । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 1: इमेजिंग के लिए 384-वेल प्लेटों में कीड़े को सॉर्ट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले टीईएफ गेटेड क्षेत्र। 50 - 2050 से पूरे TOF वितरण में 100 के एक TOF अवधि के लिए Binned क्षेत्रों बनाया गया था। गेटेड क्षेत्रों को आपकी आवश्यकताओं के अनुरूप बदला और अनुकूलित किया जा सकता है। छवि विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाने वाला प्रत्येक TOF क्षेत्र एक अलग रंग में प्रदर्शित होता है। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 2: 384-एफईएफ क्षेत्रों की अच्छी प्लेट टेम्पलेट और लेआउट को दोहराने। हर नमूना इमेजिंग के लिए एक ३८४ अच्छी तरह से थाली में हल किया गया था । छंटाई के लिए चयनित प्रत्येक क्षेत्र के लिए चार प्रतिकृतियां बनाई गई थीं । गेटेड क्षेत्रों को आपकी आवश्यकताओं के अनुरूप बदला और अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में बनाए गए और उपयोग किए गए विशिष्ट गेटेड क्षेत्रों के लिए अनुपूरक तालिका 1 देखें। छवि विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाने वाला प्रत्येक TOF क्षेत्र एक अलग रंग में प्रदर्शित होता है। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 3: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सी एलिगेंस उपभेदों में सीजीसी और सीईएनडीआर उपभेदों का मिश्रण होता है। इस तालिका में तनाव, जीनोटाइप, तनाव स्रोत और विवरण वर्णित हैं। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एलएससीपी के रूप में विभिन्न प्रकार के जहाजों का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में एक स्टैंडर्ड ग्लास बेकिंग डिश का इस्तेमाल किया गया। उपयोग में एलएसपीसी में 35.56 x 20.32 सेमी के बाहरी आयाम, 27.94 x 17.78 सेमी के आंतरिक आयाम, और लगभग 4.45 सेमी गहरे थे और एक फिट ढक्कन के साथ आए थे। इस प्रकार, यहां उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरिया की मात्रा को मिश्रित चरण के कीड़े की एक बड़ी आबादी को उपज देने के लिए उपरोक्त आयामों के साथ एलएससीपी के लिए अनुकूलित किया गया है। प्रयोगात्मक जरूरतों को फिट करने के लिए बैक्टीरियल वॉल्यूम और एकाग्रता को समायोजित किया जा सकता है।

मोल्ड, कवक, या अन्य जीवाणु स्रोतों द्वारा संदूषण एलएससीपी विधि में किसी भी कदम पर हो सकता है, इसलिए देखभाल के साथ नमूनों को संभालें। प्रोटोकॉल में किसी भी कदम को शुरू करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि काम करने की जगह 70% इथेनॉल और 10% ब्लीच के साथ साफ की गई है। यदि उपलब्ध है, तो 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ इस्तेमाल क्षेत्रों का इलाज करें और प्रत्येक चरण को शुरू करने से पहले हेपा एयर-फिल्टर 30 मिनट चालू करें।

एलएससीपी को नियंत्रित सेटिंग(यानी,20 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए सीटी रूम में) में उगाकर, उपयोगकर्ता अधिक आसानी से नमूना और दस्तावेज़ संभावित संदूषण के विकास को ट्रैक कर सकता है। यदि एलएससीपी की सतह दूषित हो जाती है, तो या तो संभव होने पर संदूषण को काट दें और यदि संदूषण को नियंत्रित करना संभव नहीं है तो नमूना विकसित होता है या छोड़ने दें। अवांछित विकास को कम करने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह संसाधनों के लिए कीड़े को मात नहीं दे रहा है, संदूषण को जल्दी से संबोधित करना अनिवार्य है ।

यह विधि उन लोगों के लिए है जो सी एलिगेंस की बड़े पैमाने पर मिश्रित जनसंख्या संस्कृतियों को विकसित करना चाहते हैं। यद्यपि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेट्री व्यंजनों और तरल संस्कृति पर किए गए एलएससीपी पर कीड़े की समकालिक आबादी विकसित करना संभव हो सकता है, लेखकों ने इस विकल्प का परीक्षण नहीं किया है। इसके अतिरिक्त, यदि उपयोगकर्ता किसी दिए गए नमूने में औसतन लगभग 2.4 मिलियन कीड़े से अधिक विकसित करना चाहते हैं, तो एक अलग विधि की सिफारिश की जाती है4। विकास की सफलता पाइपलाइन में संसाधित किए जा रहे तनाव पर निर्भर है । लेखक 15 सी एलिगेंस उपभेदों के कम से कम पांच जैविक प्रतिकृति में लगभग 2.4 मिलियन कीड़े की आबादी को सफलतापूर्वक विकसित करने में सक्षम थे, यह दर्शाता है कि विधि मजबूत है।

प्रयोग शुरू करने से पहले ध्यान दें कि किसी दिए गए कीड़े की उम्र और स्वास्थ्य fecundity और बाद में जनसंख्या वृद्धि के समय को प्रभावित कर सकता है। सुनिश्चित करें कि इस पाइपलाइन में उपयोग किए जाने से पहले न्यूनतम तनाव के साथ स्वस्थ परिस्थितियों में कीड़े बनाए रखे जाते हैं। यह माना जाता है कि समय के साथ आनुवंशिक बहाव को कम करने के लिए स्टॉक नमूने बनाए गए हैं, जमे हुए हैं, और -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है।

किसी दिए गए प्रयोग की जरूरतों के आधार पर, एलएससीपी पर ग्रेविड वयस्कों की संख्या को बदला जा सकता है। एलएससीपी पर शुरू ग्रेविड वयस्कों की संख्या में फेरबदल विकास दर और इस तरह फसल के लिए समय बदल जाएगा । पांच ग्रेविड वयस्कों का उपयोग निम्नलिखित कारणों से प्रत्येक एलएससीपी को बीज देने के लिए किया जाता है: (1) एक समय में एलएससीपी पर कई सी एलिगेंस उपभेदों को बीज करने के लिए एक सरल, तेज और कुशल तरीका आवश्यक था और (2) ग्रेविड वयस्कों के बीच उम्र के अंतर को कम करने के लिए चुना गया है जो विकास विषमता का कारण बन सकता है।

यह विधि उपयोगकर्ता को सभी जीवन चक्र चरणों के साथ कीड़े की बड़ी आबादी को फसल करने की अनुमति देती है। वर्तमान तरीकों के उपलब्ध होने के साथ, सी एलिगेंस के बड़े पैमाने पर नमूनों को इकट्ठा करने के लिए डाउनस्ट्रीम काम के लिए वांछित कीड़े की संख्या प्राप्त करने के लिए ब्लीच सिंक्रोनाइजेशन की आवश्यकता होती है। इस दृष्टिकोण को देखते हुए, अब कोई भी ब्लीच सिंक्रोनाइजिंग और कई हैंडलिंग चरणों से जुड़ी कठिनाइयों के बिना किण्वितर या बड़े पैमाने पर तरल संस्कृतियों में पहले से संभव के रूप में कई कीड़े विकसित कर सकता है। हमारा प्रोटोकॉल किसी को ब्याज के उपभेदों को कुशलतापूर्वक लक्षित करने, नमूना खुद को बढ़ाने में न्यूनतम हैंडलिंग समय का उपयोग करने और डाउनस्ट्रीम पाइपलाइनों में आवश्यकतानुसार कीड़े या जनसंख्या के चरणों को अलग करने की अनुमति देता है।

एक एलपीएफसी का उपयोग एक दिए गए एलएससीपी में जनसंख्या वितरण और आकार को दस्तावेज करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया गया था। एलपीएफसी का उपयोग किया जाने वाला एक सतत प्रवाह प्रणाली है जो उनके आकार (TOF) और ऑप्टिकल घनत्व के आधार पर कीड़े का विश्लेषण, प्रकार और वितरण करती है। के रूप में एक दिया कृमि प्रवाह सेल के माध्यम से गुजरता है, अक्षीय प्रकाश हानि डिटेक्टर एक ४८८ एनएम ठोस राज्य लेजर द्वारा अवरुद्ध संकेत प्रकाश की मात्रा को समय की लंबाई के लिए यह एक कीड़ा के माध्यम से पारित करने के लिए लेता है, उपयोगकर्ता TOF और कीड़ा के ऑप्टिकल घनत्व दे रही है । फ्लोरेसेंस संग्रह प्रकाशिकी और डिटेक्टरों का उपयोग प्रत्येक नमूने पर फ्लोरेसेंस संवेदनशीलता और संग्रह को अधिकतम करने के लिए भी किया जा सकता है। एलपीएफसी संग्रह पैरामीटर उपकरण के आधार पर अलग-अलग होंगे। उपयोगकर्ता कृमि आकार को पकड़ने के लिए विभिन्न प्लेटफार्मों को नियोजित कर सकते हैं और यदि एलपीएफसी उपलब्ध नहीं है तो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने तक सीमित नहीं हैं।

लेखक यहां वर्णित विधि में उगाए गए नमूनों का उपयोग कर रहे हैं ताकि तरल क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से सी एलिगेंस के विभिन्न उपभेदों में अज्ञात मेटाबोलाइट्स की पहचान की जा सके - मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, और आरएनए अनुक्रमण। लेखकों को इस पाइपलाइन में नमूनों के विकास के लिए इस विधि का उपयोग जारी रखने की योजना है सी elegans उपभेदों की एक किस्म के साथ ब्याज के नए उपभेदों के रूप में आसानी से इस पाइपलाइन का उपयोग कर संसाधित किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि पर उपयोगी चर्चाओं और प्रतिक्रिया के लिए एडीसन लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं; विशेष रूप से, बी .M गार्सिया । सीजीसी द्वारा कुछ उपभेदों को प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (पी 40 ओडी010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और सीईएनडीआर, जिसे एनएसएफ लिविंग कलेक्शन सीएसबीआर द्वारा वित्त पोषित किया जाता है 1930382। इस काम को एनआईएच (U2CES030167) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Sterile Serological Pipettes VWR 89130-898
10 ul pipette tips VWR 89079-438
100 ul pipette tips VWR 89079-442
1000 mL Graduated Cylinder VWR 10124-380
1000 ul pipette tips VWR 89079-488
15 mL conical tubes VWR 89039-668
190 Proof Ethanol VWR 89125-166
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask VWR 75804-654
50 mL conical tubes VWR 75874-294
Agar Sigma 05040-100G
Agarose Sigma A9539-500G
BVC Control G Fluid Aspiration System Vacuubrand
Calcium Chloride Sigma 449709-10G
Cholesterol Sigma C3045-25G
Clorox Bleach VWR 89414-502
Conviron Control Temperature Room Conviron https://www.conviron.com/environmental-rooms
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate VWR 89089-866
Fisher Scientific Accuspin 3R Fisher
Flat-Bottom 24-Well Plate VWR 29443-952
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. Home Depot 204390560
HT115 E. coli (DE3) CGC HT115(DE3) https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)
Kimwipes VWR 470224-038
Large Scale Culture Plate (LSCP) Pyrex 1090948 Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid
Magnesium Sulfate Sigma C86677-25G
MgSO4 VWR 97062-998
Microscope Plain Slides VWR 16004-422
Millipore Filter Millipore 1.11727.2500
Molecular Devices ImageXpress Molecular Devices Model Number:IXMConfocal https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532
Nystatin (10mg/mL) Sigma N6261-25MU
Peptone Sigma P7750-100G
Petri Dishes (6 cm) VWR 25384-092
Pipette Controller VWR 613-4180
Potassium Chloride Fisher P217-3
Potassium Phosphate Monobasic VWR 0781-500G
Potasssium Hydroxide Fisher P250-500
Red Fluroscent Microspheres Polysciences 19507-5
Sodium Chloride Sigma 746398-500G
Sodium Hydroxide Fisher 111357
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher BP332-500
Standard Gilson Pipette Set Gilson FA10002M, FA10004M, FA10006M
Streptomycin (100mg/mL) Sigma S6501-25G
Union Biometrica COPAS BioSorter Union Biometrica https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.

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References

  1. Félix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Current Biology. 20, (22), 965-969 (2010).
  2. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. 1-31 (2015).
  3. Brenner, S. The genetics of behaviour. British Medical Bulletin. 29, (3), 269-271 (1973).
  4. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/ (2006).
  5. Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment. Scientific Reports. 7, (1), 9839 (2017).
  6. Loer, C. M., et al. Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4). Genetics. 200, (1), 237-253 (2015).
  7. Li, Y., Paik, Y. K. A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans. BMB Reports. 44, (4), 285-290 (2011).
  8. Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 21, (10), 1648-1661 (2010).
  9. Fritz, J. A., Behm, C. A. CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity. PloS One. 4, (4), 5117 (2009).
  10. Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218, (4572), 578-580 (1982).
  11. Jeong, P. Y., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433, (7025), 541-545 (2005).
  12. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454, (7208), 1115-1118 (2008).
  13. Kaplan, F., et al. Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage. PLoS One. 6, (3), 17804 (2011).
  14. Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218, (4572), 578-580 (1982).
  15. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19, (1), 562 (2018).
  16. Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology. PLoS Genetics. 10, (2), 1004156 (2014).
  17. Rosenblatt, M. A central limit theorem and a strong mixing condition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 42, (1), 43-47 (1956).
  18. Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology. Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).
  19. Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6, (7), 1923-1933 (2016).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2020).
  21. Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37, (5), 544-548 (2005).
  22. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8, (1), 1-7 (2003).
  23. Kevin, S., Pulak, R. Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System. C. elegans. Methods in Molecular Biology. Strange, K. 351, Humana Press. 275-286 (2006).
  24. Lee, D., et al. Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response. Nature Ecology & Evolution. 3, (10), 1455-1463 (2019).
  25. Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).
  26. Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6, (7), 1923-1933 (2016).
संस्कृति और बड़े पैमाने पर मिश्रित मंच <em>Caenorhabditis elegans आबादी</em> की परख
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Shaver, A. O., Gouveia, G. J., Kirby, P. S., Andersen, E. C., Edison, A. S. Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations. J. Vis. Exp. (171), e61453, doi:10.3791/61453 (2021).More

Shaver, A. O., Gouveia, G. J., Kirby, P. S., Andersen, E. C., Edison, A. S. Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations. J. Vis. Exp. (171), e61453, doi:10.3791/61453 (2021).

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