Summary
Om Caenorhabditis elegans (C. elegans) te gebruiken in omics-onderzoek, is een methode nodig om grote populaties wormen te genereren waar een enkel monster kan worden gemeten op verschillende platforms voor vergelijkende analyses. Hier wordt een methode gepresenteerd om C. eleganspopulaties op grootschalige cultuurplaten (LSCPs) te culteren en de bevolkingsgroei te documenteren.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) is en blijft een waardevol modelorganisme om ontwikkelingsbiologie, veroudering, neurobiologie en genetica te bestuderen. De grote hoeveelheid werk aan C. elegans maakt het een ideale kandidaat om te integreren in studies met grote populaties, hele dieren om de complexe biologische componenten en hun relaties met een ander organisme te ontleden. Om C. elegans te gebruiken in collaboratief -omics onderzoek, is een methode nodig om grote populaties dieren te genereren waar een enkele steekproef kan worden gesplitst en onderzocht over verschillende platforms voor vergelijkende analyses.
Hier wordt een methode gepresenteerd om een overvloedige C. eleganspopulatie in gemengd stadium op een grootschalige cultuurplaat (LSCP) en daaropvolgende fenotypische gegevens te verzamelen. Deze pijpleiding levert voldoende aantallen dieren op om fenotypische en populatiegegevens te verzamelen, samen met alle gegevens die nodig zijn voor -omics-experimenten (d.w.z. genomica, transcriptomics, proteomics en metabolomics). Bovendien vereist de LSCP-methode minimale manipulatie van de dieren zelf, minder voorbereidingstijd voor de gebruiker, zorgt voor een strakke milieucontrole en zorgt ervoor dat de behandeling van elk monster gedurende het hele onderzoek consistent is voor de algehele reproduceerbaarheid. Ten slotte worden methoden gepresenteerd om de populatiegrootte en populatieverdeling van C. elegans levensfasen in een bepaalde LSCP te documenteren.
Introduction
C. elegans is een klein vrijlevend nematode dat over de hele wereld wordt aangetroffen in een verscheidenheid aan natuurlijke habitats1. Zijn relatieve gemak van groei, snelle generatietijd, reproductiesysteem, en transparant lichaam maken het een krachtig modelorganisme dat wijd in ontwikkelingsbiologie, het verouderen, neurobiologie, en genetica2,3is bestudeerd. Het overvloedige werk aan C. elegans maakt het een uitstekende kandidaat om in -omics studies te gebruiken om fenotypes uitgebreid te koppelen aan complexe biologische componenten en hun relaties in een bepaald organisme.
Om C. elegans te gebruiken in collaboratief -omics onderzoek, is een methode nodig om grote populaties van dieren in gemengde fase te genereren waar een enkele steekproef kan worden gesplitst en gebruikt over verschillende platforms en instrumenten voor vergelijkende analyses. Het creëren van een pijplijn om een dergelijk monster te genereren vereist een scherp bewustzijn van dieet, omgeving, stress, bevolkingsstructuur en monsterbehandeling en -verzameling. Daarom is het van cruciaal belang dat standaard en reproduceerbare kweekomstandigheden worden geïntegreerd in grootschalige pijpleidingen. In C. elegans onderzoek, twee traditionele methoden worden gebruikt om wormen te cultuur - agar Petri gerechten en vloeibare cultuur4.
Historisch gezien, wanneer grote hoeveelheden C. elegans nodig zijn, worden ze gekweekt in vloeibare cultuur4. De stappen die betrokken zijn bij het genereren van een grote populatie wormen in vloeibare cultuur vereisen meerdere behandelingsstappen die vaak bleekmiddelsynchronisatie omvatten om gravid volwassen nagelriemen te scheuren, embryo's vrij te geven om de gewenste populatiegrootte te bereiken. Wanneer bleekmiddelsynchronisatie echter wordt gebruikt, is de bevolkingsgroei afhankelijk van de begintellingsgrootte en heeft dit dus gevolgen voor de daaropvolgende groei en bevolkingsaantallen. Bovendien variëren C. elegans-stammen in hun cuticulagevoeligheid, blootstellingstijd en stressrespons op bleeksynchronisatie, waardoor het moeilijk is om veel stammen tegelijk te assayen5,6,7,8,9.
Bovendien vereist wormgroei in vloeibare cultuur een paar overdrachtsstappen, omdat het vaak wordt aanbevolen om slechts één generatie wormen te laten groeien voordat u gaat oogsten, omdat overbevolking gemakkelijk kan optreden als het meerdere generaties wordt gekweekt en kan leiden tot dauervorming ondanks de aanwezigheid van voedsel10. Dauer-vorming vindt plaats door kleine signaalmoleculen zoals ascarosiden, vaak aangeduid als "dauer feromonen"11,12,13,14, worden vrijgegeven in vloeibare media en hebben invloed op de groei van de bevolking. Bovendien leidt het kweken van grote wormpopulaties in vloeibare cultuur tot overmatige ophoping van bacteriën in de cultuur, waardoor problemen ontstaan wanneer een schoon monster nodig is voor downstream fenotypische assays. Ten slotte, wanneer een vloeibare cultuur besmet raakt, is het moeilijker te handhaven omdat schimmelsporen of bacteriële cellen gemakkelijk door de media worden verspreid15.
De andere traditionele methode om C. elegans te kweken is op agar Petri-gerechten. In de handel verkrijgbare Petrischalen stellen men in staat om gemakkelijk meerdere generaties wormen met gemengd stadium te laten groeien zonder de snelle effecten van overbevolking en hoge dauervorming zoals te zien in vloeibare culturen. Een nadeel van wormgroei op traditionele agar Petri-schotels is echter dat de grootste commercieel beschikbare Petrischaal geen grote wormpopulaties oplevert voor een -omics-studie zonder een bleeksynchronisatiestap toe te voegen. Kortom, het cultiveren van populaties van C. elegans op agar Petri-schotels is meer geschikt voor het verzamelen van -omics-gegevens, maar we hadden een methode nodig om zeer grote populatiegroottes te genereren zonder vloeibare cultivering.
Hier presenteren we een methode aan cultuur en verzamelen we grote gemengde C. eleganspopulaties op grootschalige cultuurplaten (LSCP). Het verzamelen van monsters via deze pijpleiding levert voldoende monster op om fenotypische en populatiegegevens te verzamelen, samen met alle gegevens die nodig zijn voor -omics-experimenten(d.w.z.genomica, transcriptomics, proteomics en metabolomics). Bovendien vereist de LSCP-methode minimale manipulatie van de dieren, minder voorbereidingstijd voor de gebruiker, zorgt voor een strakke milieucontrole en zorgt ervoor dat de behandeling van elk monster consistent is gedurende het hele onderzoek voor algehele reproduceerbaarheid.
Protocol
1. Steriliseer LSCP en apparatuur
- Bereid glazen LSCPs voor door met de hand te wassen, gevolgd door afwassen en daaropvolgende autoclaaf om ervoor te zorgen dat glaswerk vrij is van verontreinigingen voordat u met het experiment begint. Bewaar autoclaaf LSCPs op een schone droge plaats tot in gebruik.
OPMERKING: Zorg ervoor dat LSCPs vaatwasmachine- en autoclaafbestendig zijn. Zorg ervoor dat de LSCP-deksels vaatwasmachinebestendig zijn. - Bereid LSCP-deksels door met de hand te wassen, gevolgd door afwassen. Bewaar LSCP-deksels in een schone bak totdat dit nodig is.
- Op de dag dat Nematode Growth Media Agarose (NGMA) is voorbereid, veegt u LSCP-deksels twee keer af met 10% bleekoplossing, gevolgd door 70% ethanol. Eenmaal afgeveegd met 10% bleekmiddel en 70% ethanol, bewaar LSCP-deksels in een schone bak in de laminaire stroomkap waar de NGMA wordt voorbereid.
2. Bereid nematodengroeimedia agarose voor (NGMA)
- Bereid NGMA door de volgende reagentia te combineren in een autoclaafkolf van 2 L Erlenmeyer met roerstaaf op een roerplaat: 2,5 g pepton, 3 g NaCl, 7 g agarose, 10 g agar en 975 ml steriel water16. Zorg ervoor dat het totale volume gelijk is aan 1 L. Plak een foliedop op de kolf.
OPMERKING: De voorbereidingsstappen voor de NGMA zoals hier beschreven, leveren voldoende materiaal op voor 2,5 LSCPs. Het protocol kan worden aangepast aan de benodigde LSCP-batchgrootte in een bepaald experiment. - Autoclaaf op vloeistofcyclus bij 121 °C en 21 p.s.i. gedurende 45 min.
- Zet het waterbad aan en zet op 50 °C. Breng de autoclaaf NGMA naar het waterbad om af te koelen tot 50 °C.
- Breng 2 L Erlenmeyer kolf van NGMA in de kap of gereinigde ruimte en zet op een roerplaat. Gebruik een thermometer om de NGMA-temperatuur bij te houden.
- Nadat de NGMA 50 °C heeft bereikt, voegt u het volgende toe in de volgorde vermeld met een steriele wegwerppipet in de kap of gereinigde ruimte:25ml van 1 ml KH 2 PO4 (K-fosfaatbuffer), 1 ml cholesterol (5 mg/ ml in ethanol), 1 ml van 1 M CaCl 2, 1 ml van 1 M MgSO 4 , 1 ml nystatine(1mg / ml in ethanol), 1 ml 1 ml 1 mL cacl2,1 ml van 1 m MgSO4,1 ml nystatine (1 mg/ ml in ethanol)
- Giet 400 ml NGMA in een steriel glazen LSCP, ongeveer 1,3 cm diep, laat de LSCP stollen op een plat oppervlak in de kap en plaats het deksel van de autoclaaffolie terug op de LSCP.
- Zodra de agar is ingesteld, verwijdert u de folie en plaatst u een schoon luchtdicht deksel op LSCP en gaat u naar 4 °C voor opslag. Bewaar NGMA in LSCPs bij 4 °C tot in gebruik en gebruik binnen 5 dagen.
3. Genereer E. coli-voedsel voor NGMA op LSCP
- Om een stabiele voedselbron te genereren, genereert u batches HT115 (DE3) E. coli met behulp van een klein batchmiddelingsconcept dat overeenkomt met de centrale limietstelling17. Bewaren bij -80 °C. Trek indien nodig E. coli bacteriebestand(en) van -80 °C tot dooi18.
OPMERKING: In dit protocol werden E. coli bacteriebestanden gekweekt in een bioreactor. Aan het einde van de cultuurgroei werd de cultuur verwaterd 1:50 en de gemeten OD600 was 0,4. Aldus, had de cultuur een efficiënte OD600 van 20. Bacteriën werden geplet, gewogen en geresuspendeerd in K-medium bij een concentratie van 0,5 g/ml (nat gewicht), overgebracht in 2 ml aliquots en bevroren19.
4. Bacterieel gazon op NGMA
- Breng NGMA LSCPs van 4 °C enkele uren op kamertemperatuur (RT) voordat u het bacteriële gazon verspreidt, zodat de hele LSCP RT kan bereiken.
- Haal de benodigde E. coli bacterievoorraden uit van -80 °C tot dooi18.
- Verdun E. coli bacteriebestand(en) met 2 ml steriel K-medium om 0,5 g E. coli te bereiken in 4 ml per NGMA LSCP. Pipetteer voorzichtig 4 ml E. coli in het midden van de NGMA LSCP.
- Gebruik een steriele strooier om bacteriën in een rechthoek te verspreiden, waardoor ongeveer 3,8 cm ruimte rond de randen van de NGMA E. coli vrij blijft.
- Laat de NGMA LSCP met E. coli in de motorkap met de ventilator op gedurende 1 uur om ervoor te zorgen dat de E. coli suspensie volledig droogt.
- Zodra het bacteriële gazon droog is, duwt u het deksel stevig aan en bewaart u het bij 4 °C tot het wordt gebruikt.
5. Chunk wormen om stress en leeftijdsvariabiliteit tussen monsters te verminderen
- Streepwormen van een bevroren wormenbouillon naar een nieuw gezaaid bord van 6 cm4. Deze plaat zal dienen als de "master chunk" plaat.
OPMERKING: Chunking is een optimale methode om wormen over te brengen van een homozygote stam20. Als een soort heterozygoot is of moet worden onderhouden door te plukken en te paren, is brokken niet aan te raden. Chunking frequentie kan nodig zijn om te worden geoptimaliseerd, afhankelijk van worm genotypen gebruikt, temperatuur gekozen voor groei, en downstream stappen. - Nadat de master chunk plate vol zit met gezonde gravid volwassenen (ongeveer 3 dagen) met veel E. coli gazon nog steeds aanwezig, volg de standaard C. elegans chunking richtlijnen zoals beschreven in WormBook om vier totale chunk plates te produceren4.
- Bewaar alle brokplaten in een ct-ruimte (controlled temperature) bij 20 °C, tenzij anders aangegeven voor groei.
OPMERKING: Als gebruikers van dit protocol geen toegang hebben tot een CT-ruimte zoals hier beschreven, wordt aanbevolen om een kleine incubator te gebruiken waar de temperatuur kan worden geregeld of een aangewezen ruimte waar de omgevingsomstandigheden zoveel mogelijk kunnen worden geregeld. Als geen van deze alternatieve opties beschikbaar is, moet u er rekening mee houden dat de variatie in de groei van de steekproef groter kan zijn. - Zodra veel gravid volwassenen worden waargenomen in de 4e brokplaat, ga je verder met stap 6.
6. Spot blekende gravid volwassenen op LSCP
OPMERKING: Deze bleektechniek wordt gebruikt om de meeste verontreinigingen uit te roeien en de nagelriem van de hermafrodieten op te lossen die embryo's van de volwassen worm vrijgeven. De bleekoplossing zal in de NGMA weken voordat de embryo's uitkomen.
- Breng LSCPs enkele uren naar RT voordat u bleekwormen ziet.
- Bereid een verhouding van 7:2:1 ddH2O : bleekmiddel : 5 M NaOH. Maak deze alkalische hypochlorietoplossing vlak voor gebruik vers.
OPMERKING: Gebruik dezelfde voorraad bleekmiddel en NaOH gedurende de duur van een bepaald experiment om te voorkomen dat bleekmiddel partij beïnvloedt. Bleekmiddel gebruikt in dit protocol was 5-10% natriumhypochloriet. - Steek een Bunsen brander aan en vlam een wormpriem voordat je verder gaat. Schep verse E. coli op een steriele plectrum vanaf de rand van het bacteriegazon op de LSCP.
- Kies een enkele gravid volwassene van de 4e brokplaat voor spot bleken.
- Pipet 5 μL van de alkalische hypochlorietoplossing in een hoek van de LSCP, weg van het E. coli gazon.
- Plaats de geplukte gravid volwassene in de 5 μL alkalische hypochlorietoplossing. Tik op de nematode om de nagelriem te verstoren en eieren vrij te geven.
- Herhaal stap 6.4 – 6.6 voor een totaal van 4x en plaats 5 gravid volwassenen gelijkmatig rond het E. coli gazon. Kies alle 5 gravid volwassenen uit dezelfde 4e brokplaat om ervoor te zorgen dat bijna genetisch isogene individuen aan een bepaald monster worden toegevoegd.
- Plaats het deksel terug op de LSCP.
- Herhaal stappen voor alle LSCPs.
7. Wormgroei in gecontroleerde temperatuur (CT) ruimte
- Plaats na het bleken het deksel stevig op de LSCP en plaats het in de CT-ruimte ingesteld op 20 °C met constante luchtstroom en een 12L:12D fotoperiode (12 uur licht en 12 uur duisternis).
- Noteer de tijd en positie waar het monster in de CT-ruimte is geplaatst.
OPMERKING: De positie in de ruimte moet altijd worden gedocumenteerd om eventuele omgevingsverschillen vast te leggen die monsters kunnen tegenkomen tijdens het groeien. Zodra het monster zich in de CT-kamer bevindt, moet het ongestoord op de toegewezen plek blijven. Open het deksel van de LSCP niet in de CT-ruimte om de kans op besmetting te verkleinen. - Breng de LSCP naar een microscoop, buiten de CT-kamer, om de bevolkingsgroei en dichtheid te observeren.
OPMERKING: Elke C. elegans stam en monster zal variëren in zijn groei, dus controleer monsters nauwlettend. Hoewel het wordt aanbevolen om de groei van de LSCP niet te verstoren terwijl in de CT-kamer, LSCPs werden vervoerd uit de CT-kamer en deksels werden geopend om de 2 dagen om de monstergroei te controleren. Door de verzegelde deksels om de 2 dagen van de LSCPs te halen, kan O2 ook in de LSCP stromen. - Zorg er voor de oogst voor dat de LSCP vol zit met een grote populatie wormen. Gebruik de volgende criteria om te bepalen of de LSCP klaar is om te worden verzameld.
- Zorg ervoor dat de LSCP vol zit met gravid volwassen wormen.
- Zorg ervoor dat de plaat een grote populatiegrootte bevat (d.w.z. wormen bedekken het hele oppervlak van de agar).
- Zorg ervoor dat de plaat niet veel eieren op het oppervlak van de agar heeft(d.w.z.het maximale aantal wormen moet zijn uitgekomen).
- Zorg ervoor dat de plaat minimaal tot geen E. coli meer heeft, wat aangeeft dat de wormen zouden verhongeren en dauerlarven zouden genereren als ze nog twee dagen op de plaat zouden blijven liggen.
OPMERKING: Hoewel de meeste LSCPs klaar zijn om te oogsten tussen 10 en 20 dagen, afhankelijk van stam en monster, controleer elke LSCP regelmatig bij het vaststellen van dit protocol om de normale oogsttijden te bepalen.
- Reinig handschoenen en een gebied met 70% ethanol tussen het hanteren van LSCPs om kruisbesmetting tussen stammen te voorkomen.
8. Het LSCP-monster oogsten
- Schakel in en laat de centrifuge afkoelen tot 4 °C voordat u monsters oogst.
- Bereid drie 50 ml conische buizen voor met 50 ml M9-oplossing per LSCP die moet worden geoogst.
- Label één conische buis van 15 ml per LSCP.
OPMERKING: Alle centrifugeerstappen worden uitgevoerd in de conische buis van 15 ml, omdat wormen de neiging hebben om goed in deze buizen te pelleten. - Giet 50 ml M9-oplossing (van één 50 ml conische buis in stap 8.2) op het LSCP-oppervlak en wervel rond om ervoor te zorgen dat M9 het hele NGMA-oppervlak bedekt.
- Terwijl M9 op het LSCP-oppervlak zit, prime een steriele serologische pipet met M9.
OPMERKING: Door de steriele serologische pipet met M9 aan te primen, zorgt dit ervoor dat er minder wormen aan de binnenkant van de plastic pipet blijven plakken, waardoor monsterverlies wordt voorkomen. - Kantel de LSCP zodat M9 en de wormpopulatie zich verzamelen in een hoek van de LSCP.
OPMERKING: Het mengsel van M9-oplossing en wormen uit de LSCP wordt in stroomafwaartse stappen de "wormsuspensie" genoemd. - Met behulp van een geprimeerde serologische pipet met een automatische pipettor, pipet worm ophanging en plaats in de originele 50 ml conische buis. Zodra 50 ml wormsuspensie is verzameld, plaatst u de conische buis op een rocker om bacterieklonters en vuil te verstoren.
- Herhaal stap 8.4 - 8.7 waarbij 150 ml wormsuspensie per LSCP wordt verzameld.
- Breng 15 ml wormsuspensie over uit een van de drie conische buizen van 50 ml door in een gelabelde conische buis van 15 ml te gieten die in stap 8.3 opzij is gezet. Centrifugeer de conische buis van 15 ml gedurende 1 min bij 4 °C op 884 x g. De meerderheid van de wormen zal pellet op de bodem van de buis.
- Aspireer van het supernatant om de wormkorrel niet te verstoren.
- Blijf ongeveer 13 ml wormsuspensie toevoegen aan dezelfde conische buis van 15 ml die stap 8.9 en 8.10 herhaalt totdat alle 150 ml wormsuspensie is verbruikt. Keer de buis om en verstoor de pellet tussen de centrifuges om zoveel mogelijk bacteriën en vuil te wassen en af te zuigen.
OPMERKING: Bij deze stap wordt de inhoud van alle drie de 50 ml conische buizen gecondenseerd in een enkele buis van 15 ml. - Voeg 10 ml schone M9 toe aan de conische buis van 15 ml en roer de wormkorrel door om te keren. Centrifugeer de conische buis van 15 ml gedurende 1 min bij 4 °C op 884 x g. Aspireer van het supernatant om de wormkorrel niet te verstoren. Herhaal dit twee keer.
OPMERKING: Als er een grote hoeveelheid vuil of bacteriën in het monster zit, herhaalt u stap 8.12 totdat het monster schoon is. - Zodra het monster schoon is, voegt u ddH2O toe aan de wormkorrel voor een totaal van 10 ml ddH2O en wormen. Roer de wormkorrel door om te keren. Ga snel naar stap 9.1, omdat wormen 5 minuten of minder in ddH2O moeten blijven om osmotische stress te voorkomen.
OPMERKING: Het opschorten van wormkorrels in ddH2O is het voorkeursoplosmiddel voor downstream -omics-stappen. Wormen kunnen worden opgehangen in andere oplosmiddelen of buffers als ze compatibel zijn met een bepaalde experimentele workflow.
9. Schatting bevolkingsomvang
OPMERKING: Ga snel door stap 9.1 – 9.7. Het mengsel van ddH2O en wormen uit stap 8.13 wordt in de volgende stappen het "wormmonster" genoemd.
- Voorafgaand aan het pipetten van het wormmonster, prime pipet tip te gebruiken met M9 om te voorkomen dat wormen plakken aan de binnenkant van de plastic pipet het voorkomen van monsterverlies en het verminderen van de telvariatie.
- Neem een 100 μL aliquot wormmonster en verdun het tot 900 μL M9. Meng goed en maak een seriële verdunning (1:10, 1:100, 1:1000). Herhaal deze stap twee keer om in totaal drie sets aliquot-replica's te bereiken.
OPMERKING: Pipettende wormen kunnen een hoge variabiliteit in het aantal monsterpopulaties veroorzaken. Zorg ervoor dat het wormmonster homogeen is voordat u het gewenste aliquot pipett. - Zet de 15 ml conische buis op een rocker om de bewegende cultuur voort te zetten terwijl aliquots worden geteld.
- Zorg ervoor dat het wormmonster goed gemengd en homogeen is. Pipet 5 μL uit het 1:10 wormmonster, verdeel het over een microscopieschuif en tel het aantal wormen. Als dit aantal minder dan ongeveer 50 wormen is, tel dan ook de verdunningen van 1:100 en 1:1000. Als het meer dan 50 is, gaat u naar de volgende seriële verdunning.
OPMERKING: Als te veel wormen niet nauwkeurig kunnen worden geteld, gebruikt u in plaats daarvan de volgende seriële verdunning om te tellen. - Tel elke aliquot repliceren van elke verdunning 3x. Aan het einde van de telling worden voor de meeste culturen 9 totale tellingen gedocumenteerd(d.w.z.3 totale tellingen voor elke aliquot-replica).
- Gemiddeld het verdunningsaantal om de geschatte populatiegrootte van het wormmonster te bepalen. Deze verdunningstellingen bepalen het volume wormmonster dat nodig is om de gewenste aliquotgrootte voor -omics-stappen te maken.
OPMERKING: In dit experiment werden aliquots van ongeveer 200.000 wormen in gemengd stadium gegenereerd. Bovendien werd één aliquot van ongeveer 50.000 wormen in gemengd stadium gereserveerd voor sortering in een grote deeltjesstroomcytometer (beschreven in stap 10). - Zodra het wormmonster in geschikte aliquots is gesplitst, vriest u in vloeibare stikstof en slaat u het monster op bij -80 °C.
OPMERKING: Vries de aliquot die bestemd is voor cytometrie met grote deeltjesstromen niet in.
10. (Optioneel) Voorbereidingsmonster voor cytometrie met grote deeltjesstroom
OPMERKING: Stappen 10, 11 en 12 zijn de voorkeursmethode van de auteurs om de steekproefgroei(d.w.z.de populatiegrootte en populatieverdeling van de levenscyclusfasen van C. elegans) vast te leggen en het succes van een cultuur te bepalen. Gebruikers van dit protocol kunnen optionele stappen 10, 11 en 12 vervangen door hun eigen statistieken voor groeisucces. De stappen 10, 11 en 12 worden hier om twee redenen beschreven; ten eerste kunnen gebruikers met apparatuur die wordt gebruikt in stap 10, 11 en 12 deze stappen repliceren en ten tweede, om validatie van deze groeimethode weer te geven. Stap 9 hierboven geeft een goede schatting van het totale aantal wormen om aliquotgroottes te bepalen, en stap 10 is een meer kwantitatieve statistiek om het aantal en de populatieverdeling van wormen in een bepaald monster te schatten.
- Breng de aliquot van ongeveer 50.000 wormen in gemengd stadium (opzij gezet in stap 9.6) tot 10 ml totaal volume in M9-oplossing.
- Maak een oplossing bestaande uit 1 mg/ml E. coli en een verdunning van 1:50 van 0,5 μM rode fluorescerende microbolletjes19.
- Voeg 200 μL van deze oplossing toe aan de 10 ml wormen met gemengd stadium in M9 en incubeer tijdens het schommelen gedurende 20 minuten.
- Centrifugeer na 20 min de conische buis van 15 ml op 884 x g gedurende 1 min bij 4 °C.
- Aspireer van het supernatant om de wormkorrel niet te verstoren.
- Was de wormkorrel twee keer met M9-oplossing om overtollige bacteriën en rode fluorescerende microbolletjes te elimineren.
- Voeg 5 ml M9 toe aan de wormkorrel en zorg ervoor dat de pellet er schoon uitziet. Als de pellet schoon is, voeg dan 5 ml M9 met 50 mM natrium azide toe om zowel de wormen recht te maken als te doden voor nauwkeurig tellen en dimensioneren21.
- Documenteer de tijd en datum waarop natriumaziide aan het monster wordt toegevoegd.
- Zet het monster opzij op de rocker tot het nodig is voor cytometrie met grote deeltjesstromen.
OPMERKING: Van natrium azide is bekend dat het de fysiologie van nematoden beïnvloedt(d.w.z.lichaamslengte, metabolisme en thermotolerantie). Daarom is het van cruciaal belang om op te merken dat wormen worden blootgesteld aan natrium azide, omdat veel van deze fysiologische effecten binnen enkele minuten plaatsvinden22. Vanwege de bekende fysiologische effecten van natrium azide op wormen, zal deze behandeling de downstream beeldkwaliteit beïnvloeden en moet worden overwogen.
11. (Optioneel) Documenteren van populatieverdeling en voorbereiden van 384-put plaat voor beeldvorming
OPMERKING: Stap 11 maakt gebruik van een grote deeltjesstroomcytometer (LPFC). Basiskennis van een LPFC wordt in dit protocol verondersteld. Andere methoden kunnen worden vervangen om de groei en populatieverdeling van monsters te documenteren. De hier beschreven stappen zijn voor gebruikers die van plan zijn een LPFC in hun pijplijn te gebruiken23.
- Schakel de LPFC in, reinig en primeer deze en laat de laser(s) 1 uur opwarmen voordat u monsters sorteert.
- Nadat de laser is opgewarmd, opent u het "Histogram" profiel en schaalt u naar een Time of Flight (TOF) van 2050.
- Voeg een staafgebied toe aan het "Histogram" met een TOF-bereik van 100. De eerste barregio beslaat een TOF van 50-150.
- Ga door met het maken van twintig staafregio's met elk een TOF-bereik van 100. Deze staafregio's zullen het hele TOF-bereik van 50 - 2050 omvatten. Zie aanvullende tabel 1 voor de exacte gated regions die in de tof-distributie moeten worden gebruikt.
- Sla dit Histogram op dat is ingesteld als een "Experiment" om te gebruiken in toekomstige LPFC-uitvoeringen.
- Selecteer gekalibreerde 384-put plaat of kalibreer instrument naar een 384-well plaat om objecten in af te geven.
- Eenmaal in de gekalibreerde 384-putplaatsjabloon stelt u sjabloon in om 20 gated objecten in vier putten (vier technische replica's van elke gated region) te doseren voor elk van de 20 bar-regio's die tijdens stap 11.3-4 zijn gemaakt. Zie aanvullende tabel 2 voor een voorbeeld van de indeling van het doseren van wormen in de 384-putplaat.
- Breng het monster van stap 10.9 over in een conische buis van 50 ml en voeg extra M9-oplossing toe om een totaal volume van ongeveer 40 ml te bereiken.
- Begin automatisch met het sorteren van het monster volgens de parameters die zijn ingesteld in stap 11.7, terwijl u het monster continu roert om bezinking te voorkomen en tegelijkertijd voorwerpen uit het monster in de gekalibreerde 384-putplaat te doseren.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het debiet van de LPFC tussen 15-20 objecten per seconde werkt en geef geen verdubbelingen op die moeten worden gesorteerd. - Zodra het hele monster is gesorteerd en het maximale aantal gated regions in de 384-putplaat is afgegeven, neemt u het monster van LPFC en reinigt u het instrument.
OPMERKING: Wanneer grotere TOF-regio's worden bereikt, kan het een uitdaging worden om de 384-putplaat te blijven vullen vanwege het lage aantal gebeurtenissen in die TOF-regio. Vul zoveel mogelijk van de omheinde regio's om het beste idee te krijgen van waar de levensfasen van C. elegans binnen de LPFC-distributie vallen voordat het monster opraakt. - Plaats een afdichtingsfolie op de 384-putplaat totdat deze in beeld is.
OPMERKING: Beeldplaat zo snel mogelijk na het sorteren omdat monsters worden behandeld met natrium azide22. Rode fluorescerende microbolletjes zijn te zien in de verzamelde LPFC-gegevensbestanden(d.w.z. PH Red-gegevens in het uitvoertekstbestand) op basis van het niveau van rode fluorescentie dat in elk gesorteerd object wordt uitgezonden om te helpen identificeren welke objecten levende wormen, dode wormen, dauers of junk zijn24.
12. (Optioneel) Imaging 384-put plaat
OPMERKING: Stap 12 maakt gebruik van een plaatlezende micro confocale microscoop. Basiskennis van een micro confocale microscoop wordt in dit protocol verondersteld. Andere methoden kunnen worden vervangen om de groei en populatieverdeling van monsters te documenteren.
- Met behulp van een plaatlezende micro confocale microscoop met een 20x lens.
- Open het tabblad "Objectief en Camera" en stel in op "10x Plan ApoLambda" modus.
- Open het tabblad "Camera Binning" en stel in op "2".
- Open het tabblad "Sites om te bezoeken op plaat" en stel in op "4" sites per put en "overlap sites 10%" om later afbeeldingen aan elkaar te naaien.
- Open het tabblad "Golflengte" en stel in op "Brightfield 1".
- Open het tabblad "Verlichting" en stel in op "Verzonden licht, helder monster".
- Plaats de 384-put plaat in de microscoop en zet de "Z Stack" op "Calculate Offset" en zoek het juiste brandpuntsvlak voor de samples in de 384-well plaat.
- Voer de 384-put plaat op de micro confocale microscoop en verzamel vier beelden per put.
- Monteer de vier afbeeldingen samen om één beeld per put te creëren.
Representative Results
De groei van C. elegans met behulp van de LSCP-methode levert gemiddeld ongeveer 2,4 miljoen wormen in gemengd stadium per monster op over 12,2 dagen. De groei van C. elegans met behulp van de LSCP-methode stelt gebruikers in staat om grote populaties van C. elegans te genereren met weinig behandeling en manipulatie van de dieren, wat ideaal is voor grootschalige -omics-studies (Figuur 1). Zodra een LSCP vol zit met volwassen wormen, een grote populatiegrootte heeft bereikt en minimale bacteriën over heeft, kunnen gebruikers de populatiegrootte oogsten en schatten. Dit punt kan ook dienen als een kwaliteitscontrole door te evalueren of de populatie voldoende is om te gebruiken in een -omics-pijpleiding (figuur 2). De populatiedynamiek is afhankelijk van de stam zelf, het gedrag van de stam(d.w.z.gravende stammen hadden de neiging om een lager wormherstel te hebben) en groeisucces(d.w.z.besmetting). De LSCP-methode werd getest op 15 stammen van C. elegans die een mengsel bevatten van Caenorhabditis Genetics Center (CGC) mutanten en Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) wilde stammen25. Stam genotypen worden beschreven in aanvullende tabel 3.
De LSCP-methode leverde populatiegroottes op van ongeveer 94.500 tot 9.290.000. De gemiddelde populatiegrootte binnen de referentiestam PD1074 en tussen stammen bedroeg ongeveer 2,4 miljoen wormen (figuur 3). Er werden geen significante verschillen gevonden in de geschatte populatiegrootte tussen C. elegans-stammen in de loop van gemiddeld 12,2 LSCP-groeidagen (figuur 4). PD1074 LSCPs duurde tussen de 10 – 14 dagen om uit te groeien tot een volledige gemengde populatie. De gemiddelde groeitijd over PD1074 was 10 dagen. De langzaamst groeiende soort groeide maximaal 20 dagen en de snelst groeiende soort groeide gedurende minimaal 10 dagen (figuur 4).
Daarom kunnen gebruikers met behulp van deze LSCP-methode eenvoudig nieuwe interessestammen integreren in een studie met weinig kennis van ontwikkelingstiming en achtergrondexpertise. Merk op dat stammen en fenotypes die moeten worden onderhouden door te plukken, vruchtbaarheidsdefecten hebben, heterozygoot zijn of groeistoornissen hebben, mogelijk niet goed werken in deze pijplijn.
Met grote deeltjesstroomcytometrie en beeldvorming van monsters kunnen gebruikers de populatieverdeling documenteren. Een breed scala aan platforms kan worden gebruikt om succesvolle bevolkingsgroei te meten.
Voor reproduceerbare -omics metingen is het belangrijk om consistente culturen te laten groeien. De maatstaven voor de reproduceerbaarheid van de cultuur zijn het aantal wormen en een consistente grootteverdeling voor een bepaalde stam. We tonen de monsterverdeling voor de referentiestam PD1074 – een variant van de originele N2 Bristol-stam, met behulp van de LPFC23,26 en micro confocale microscoopbeelden als proxy's voor groeisucces. Aangezien wormen werden gemeten vanaf het L1-stadium tot en met gravid adult op de LPFC-verdeling (figuur 5), daaropvolgende beeldvorming (figuur 6) en de variatie in de populatieverdeling over monsters (figuur 7), kunnen we zien dat deze pijpleiding een gemengde populatie van C. elegansgenereerde .
Om de populatieverdeling van onze gemengde monsters nader te bekijken, hebben we gekeken naar de verdeling van 35 PD1074 LSCPs door te kijken naar het percentage wormen dat binnen elke regio valt over de gehele time of flight (TOF)(d.w.z.lichaamslengte) verdeling (figuur 7A,B).
Figuur 1: Overzicht van de LSCP wormgroeipijplijn. (A) Eenmaal in het laboratorium ontvangen, werden alle stammen bereid en ingevroren voor langdurige opslag bij -80 °C2. (B) Een "master chunk"-plaat werd bereid uit een bevroren wormvoorraad en bewaard bij 15 °C om niet langer dan een maand te worden gebruikt. (C) Elk monster onderging vier opeenvolgende chunkingstappen om de generatiespanning te verminderen voordat het op de LSCP groeide. (D) 5 individuele gravid volwassenen werden geplukt uit de "chunk 4" 6 cm plaat in Stap (D) en spot gebleekt op vijf bepaalde gebieden van de LSCP. (E) De LSCP werd in een gecontroleerde temperatuurruimte geplaatst en gekweekt bij 20 °C totdat de LSCP vol zat met volwassen wormen, een grote populatiegrootte bereikte en minimale bacteriën over had. (F) De wormpopulatie werd geoogst en verzameld voor stroomafwaartse stappen. (G) Aliquots werden gemaakt van de LSCP en werden flash frozen voor downstream gewenste toepassingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van LSCP oogsten en schatten van populatiegrootte. (A) 50 ml M9 werd gebruikt om wormen van het NGMA-oppervlak te wassen. Wormsuspensie werd in een conische buis van 50 ml gepijpt. Stap (A) werd tweemaal herhaald. (B) 15 ml wormsuspensie werd in een nieuwe conische buis van 15 ml gegoten. Wormen werden geplet door centrifugeren. M9 + puin werd afgezogen zonder wormkorrel te verstoren. Stap (B) werd herhaald totdat alle 150 ml wormsuspensie was verzameld. (C) De wormkorrel werd driemaal gewassen en gecentrifugeerd met M9 om restafval te verwijderen. Zodra het monster schoon was, werd de wormkorrel geresuspendeerd in 10 ml ddH2O. (D) Er werd een seriële verdunning van het monster gemaakt om de populatiegrootte van de worm te schatten. Er werd gebruik gemaakt van de verdunningsfactor(en) waarmee wormen nauwkeurig konden worden geteld. De gebruikte verdunningsfactor(en) veranderde afhankelijk van de populatiegrootte van de LSCP. (E) Zodra de verdunningsfactor(en) waren gekozen, werden alle wormen van alle drie de aliquot-replica's van die verdunning op een schone dia gepijpt en werden wormen geteld onder een ontleedmicroscoop. (F) De steekproef werd opgesplitst in aliquots van passende grootte. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: LSCP-methode genereerde gemiddeld een populatie van 2,4 miljoen wormen in gemengd stadium. LSCP levert bevolkingsgrootte in de kleinste bevolkingsgroei bij rond 94.500 en bij de grootste bevolkingsgroei bij rond 9.290.000. De gemiddelde populatiegrootte van alle stammen was 2,4 miljoen wormen. Staven onder C. elegans stamnamen geven aan of een stam een CGC mutant of CeNDR natuurlijk isolaat is. Voor elke soort wordt de LSCP-steekproefgrootte weergegeven. Vergelijkingen voor alle paren met behulp van Tukey's HSD Test werden uitgevoerd. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de geschatte populatiegroottes tussen C. elegans stammen (F(14.108) = 0,7, p = 0,77). Gekleurde balken geven standaard kleurendisplays aan voor de respectievelijke C. elegans stamweergave. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: LSCP-methode genereerde grote populaties wormen in gemengde fase in 10 – 20 dagen. Een gegeven C. elegans LSCP groeide totdat het monster vol volwassen wormen zat, een grote populatiegrootte bereikte en een minimaal bacterieel gazon over had. LSCPs duurde tussen de 10 – 20 dagen om uit te groeien tot een volledige gemengde populatie, afhankelijk van de stam. De gemiddelde groeitijd van de stammen was 12,2 dagen. Voor elke soort wordt de LSCP-steekproefgrootte weergegeven. Elke foutbalk is geconstrueerd met 1 standaardafwijking van het gemiddelde. Niveaus die niet met dezelfde letter zijn verbonden, zijn aanzienlijk verschillend. Vergelijkingen voor alle paren met behulp van Tukey's HSD Test. Er werd een significant verschil gevonden in de hoeveelheid groeitijd op LSCP die nodig was voor C. elegans stammen (F(14,108) = 8,8, p < 0,0001*). Gekleurde balken geven standaard kleurendisplays aan voor de respectievelijke C. elegans stamweergave. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Gemengde populatie- en groeimeting van de wildtype referentiestam, PD1074. Een representatieve LPFC-verdeling van één LSCP-groei van de wild-type referentiestam, een variant van de oorspronkelijke N2 Bristol-stam (PD1074), documenteert de grootteverdeling en het aantal gebeurtenissen van een populatie in gemengde fase. De x-as geeft de lengte (Vliegtijd, TOF) van de gesorteerde wormen weer. De y-as geeft de optische dichtheid (optische extinctie, EXT) van de gesorteerde wormen weer. Elk gegevenspunt is een worm die in het voor beeld is gedocumenteerd. Elk TOF-gebied dat is gebruikt voor beeldanalyse, wordt in een andere kleur weergegeven. Er werden twintig TOF-regio's gecreëerd (R2 – R21), variërend van een TOF van 50 tot 2050. Details over elke TOF-regio zijn te vinden in aanvullende tabel 1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Afbeeldingen van wormen gesorteerd uit TOF-regio's variërend van R2 - R12 tonen de PD1074 LPFC-verdeling. In regio R2 kunnen L1-wormen worden geïdentificeerd en in regio R9 worden voornamelijk gravid-volwassenen geïdentificeerd, die de twee ontwikkelingslarve extremen overspannen, waardoor we geschatte regio's binnen de stroomcytometerverdeling hebben van waar stadia in de distributie worden verwacht. Schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. Er zijn representatieve afbeeldingen genomen van de LPFC-verdeling die in figuur 5wordt weergegeven , en de gekleurde vakken komen overeen met regio 's uit figuur 5. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Populatieverdeling over tof-regio's (time of flight) in de wild-type referentiestam PD1074. Verspreiding van wormen over het hele TOF-gebied met de regio's waar wormen werden gevonden. Elke PD1074 LSCP wordt weergegeven als een individuele kleur. (A) De x-as toont de twintig TOF-gebieden (R2 – R21) waargenomen en geteld voor de LSCP, met de volledige grootteverdeling. De y-as toont het percentage wormen van een bepaalde LSCP met een lichaamsgrootte die in een bepaald TOF-gebied viel. (B) Aangezien een kleiner deel van de wormpopulatie tussen de R7-R21-regio's valt, werd het logboek van het percentage wormen dat binnen elke regio viel, genomen om de populatieverdeling weer te geven. De x-as geeft de R7-R21 TOF-gebieden weer. De y-as geeft het logboek weer van het percentage wormen van een bepaalde LSCP met een lichaamsgrootte die in een bepaald TOF-gebied viel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Gemiddelde dagtemperatuur (°C) van de groeiomstandigheden waaronder de LSCP werd geteeld en verwerkt. Gerapporteerde temperaturen van de Controlled Temperature (CT)-ruimte werden gedocumenteerd en verzameld gedurende de periode van zes maanden van monstergroei en -verzameling. De gemiddelde dagtemperatuur wordt hier gerapporteerd. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de temperatuur waarin de LCSP tijdens de looptijd van het project groeide (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Het totale temperatuurverschil besloeg niet meer dan 0,003 °C gedurende de periode van zes maanden van monstergroei en -opwekking. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende tabel 1: TOF gated regions used to sort worms in 384-well plates for imaging. Binned-regio's zijn gemaakt om een TOF van 100 te omvatten over de hele TOF-distributie van 50 - 2050. Gated regio's kunnen worden gewijzigd en geoptimaliseerd om aan uw behoeften te voldoen. Elk TOF-gebied dat is gebruikt voor beeldanalyse, wordt in een andere kleur weergegeven. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: 384-put plaatsjabloon van TOF-regio's en repliceer lay-out. Elk monster werd gesorteerd in een 384-put plaat voor beeldvorming. Er zijn vier replica's gemaakt voor elke regio die is geselecteerd voor sortering. Gated regio's kunnen worden gewijzigd en geoptimaliseerd om aan uw behoeften te voldoen. Zie aanvullende tabel 1 voor specifieke gated regions die in dit protocol zijn gemaakt en gebruikt. Elk TOF-gebied dat is gebruikt voor beeldanalyse, wordt in een andere kleur weergegeven. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 3: C. elegans stammen die in dit protocol worden gebruikt, bevatten een mengsel van CGC- en CeNDR-stammen. De stam, het genotype, de stambron en de details worden in deze tabel beschreven. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Een verscheidenheid aan vaten kan worden gebruikt als een LSCP. In dit protocol werd een standaard glazen ovenschaal gebruikt. De in gebruik getreden LSPCs hadden buitenafmetingen van 35,56 x 20,32 cm, binnenafmetingen van 27,94 x 17,78 cm, en ongeveer 4,45 cm diep en werden geleverd met een gemonteerd deksel. Zo is de hoeveelheid bacteriën die hier wordt gebruikt geoptimaliseerd voor een LSCP met de bovenstaande afmetingen om een grote populatie wormen in gemengd stadium op te leveren. Bacterievolume en concentratie kunnen worden aangepast aan de experimentele behoeften.
Verontreiniging door schimmels, schimmels of andere bacteriële bronnen kan bij elke stap in de LSCP-methode voorkomen, dus behandel monsters met zorg. Voordat u begint met een stap in het protocol, moet u ervoor zorgen dat de werkruimte wordt gereinigd met 70% ethanol en 10% bleekmiddel. Behandel gebruikte gebieden indien beschikbaar gedurende 30 minuten met UV-licht en schakel een HEPA-luchtfilter 30 minuten in voordat u met elke stap begint.
Door de LSCP in een gecontroleerde omgeving te laten groeien(d.w.z.in een CT-ruimte op 20 °C), kan de gebruiker gemakkelijker de groei van het monster volgen en mogelijke verontreiniging documenteren. Als het oppervlak van de LSCP verontreinigd raakt, snijdt u de verontreiniging indien mogelijk uit en laat u het monster groeien of gooit u het monster weg als de verontreiniging niet kan worden bekeken. Het is absoluut noodzakelijk om besmetting snel aan te pakken om ongewenste groei te verminderen en ervoor te zorgen dat het wormen niet overcompeteert voor hulpbronnen.
Deze methode is bedoeld voor diegenen die grootschalige gemengde bevolkingsculturen van C. eleganswillen laten groeien. Hoewel het mogelijk is om gesynchroniseerde populaties wormen op de LSCP te kweken, zoals gedaan op commercieel beschikbare Petrischalen en in vloeibare cultuur, hebben de auteurs deze optie niet getest. Bovendien, als gebruikers gemiddeld meer dan ongeveer 2,4 miljoen wormen in een bepaald monster willen kweken, wordt een andere methode aanbevolen4. Groeisucces is afhankelijk van de stam die in de pijplijn wordt verwerkt. De auteurs waren in staat om met succes populaties van ongeveer 2,4 miljoen wormen te laten groeien in ten minste vijf biologische replica's van 15 C. elegans stammen, wat aangeeft dat de methode robuust is.
Voordat u met het experiment begint, moet u opmerken dat de leeftijd en gezondheid van een bepaalde worm de vruchtbaarheid en de daaropvolgende groeitijd van de populatie kunnen beïnvloeden. Zorg ervoor dat wormen in gezonde omstandigheden worden gehouden met minimale stress voordat ze in deze pijpleiding worden gebruikt. Er wordt aangenomen dat voorraadmonsters zijn gemaakt, ingevroren en bewaard op -80 °C om genetische drift in de loop van de tijd te verminderen.
Afhankelijk van de behoeften van een bepaald experiment kan het aantal beginnende gravid volwassenen op een LSCP worden gewijzigd. Het veranderen van het aantal beginnende gravid volwassenen op de LSCP zal de groeisnelheid en dus de tijd om te oogsten veranderen. Vijf gravid volwassenen worden gebruikt om elke LSCP te zaaien om de volgende redenen: (1) Een eenvoudige, snelle en efficiënte manier om veel C. elegans stammen op LSCPs te zaaien was ooit nodig en (2) om de leeftijdsverschillen tussen de gekozen gravid volwassenen te verminderen die kunnen leiden tot de groei heterogeniteit.
Deze methode stelt de gebruiker in staat om grote populaties wormen te oogsten met alle levenscyclusfasen aanwezig. Met de huidige beschikbare methoden vereist het verzamelen van grootschalige monsters van C. elegans bleekmiddelsynchronisatie om het gewenste aantal wormen voor downstreamwerk te verkrijgen. Gezien deze aanpak kan men nu zoveel mogelijk wormen kweken als voorheen mogelijk was in fermentoren of grootschalige vloeibare culturen zonder de problemen die gepaard gaan met bleekmiddelsynchronisatie en meerdere behandelingsstappen. Ons protocol stelt iemand in staat om soorten van belang efficiënt te targeten, minimale verwerkingstijd te gebruiken bij het kweken van het monster zelf en stadia van wormen of de populatie te isoleren indien nodig in downstream pijpleidingen.
Een LPFC werd gebruikt als een hulpmiddel om de populatieverdeling en grootte in een bepaalde LSCP te documenteren. De gebruikte LPFC is een continu stroomsysteem dat wormen analyseert, sorteert en afgeeft op basis van hun grootte (TOF) en optische dichtheid. Terwijl een bepaalde worm door de stroomcel gaat, vangt de axiale lichtverliesdetector de hoeveelheid signaallicht op die wordt geblokkeerd door een 488 nm-solid state laser gedurende de tijd die een worm nodig heeft om door te gaan, waardoor de gebruiker de TOF en optische dichtheid van de worm krijgt. Fluorescentieverzamelingsoptieken en detectoren kunnen ook worden gebruikt om de fluorescentiegevoeligheid en -verzameling op elk monster te maximaliseren. Lpfc-inzamelingsparameters variëren afhankelijk van het instrument. Gebruikers kunnen verschillende platforms gebruiken om de wormgrootte vast te leggen en zijn niet beperkt tot het gebruik van dit protocol als er geen LPFC beschikbaar is.
De auteurs gebruiken monsters gekweekt in de hier beschreven methode om onbekende metabolieten in verschillende stammen van C. elegans te identificeren via Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, NMR spectroscopie en RNA sequencing. De auteurs zijn van plan om deze methode te blijven gebruiken voor de groei van monsters in deze pijpleiding met een verscheidenheid aan C. elegans stammen, omdat nieuwe soorten van belang gemakkelijk kunnen worden verwerkt met behulp van deze pijpleiding.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We danken de leden van het Edison Lab voor nuttige discussies en feedback over dit manuscript; in het bijzonder, B.M. Garcia. Sommige soorten werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), en CeNDR, die wordt gefinancierd door NSF Living Collections CSBR 1930382. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH (U2CES030167).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Sterile Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| 10 ul pipette tips | VWR | 89079-438 | |
| 100 ul pipette tips | VWR | 89079-442 | |
| 1000 mL Graduated Cylinder | VWR | 10124-380 | |
| 1000 ul pipette tips | VWR | 89079-488 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-668 | |
| 190 Proof Ethanol | VWR | 89125-166 | |
| 2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask | VWR | 75804-654 | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 75874-294 | |
| Agar | Sigma | 05040-100G | |
| Agarose | Sigma | A9539-500G | |
| BVC Control G Fluid Aspiration System | Vacuubrand | ||
| Calcium Chloride | Sigma | 449709-10G | |
| Cholesterol | Sigma | C3045-25G | |
| Clorox Bleach | VWR | 89414-502 | |
| Conviron Control Temperature Room | Conviron | https://www.conviron.com/environmental-rooms | |
| Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate | VWR | 89089-866 | |
| Fisher Scientific Accuspin 3R | Fisher | ||
| Flat-Bottom 24-Well Plate | VWR | 29443-952 | |
| Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. | Home Depot | 204390560 | |
| HT115 E. coli (DE3) | CGC | HT115(DE3) | https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3) |
| Kimwipes | VWR | 470224-038 | |
| Large Scale Culture Plate (LSCP) | Pyrex | 1090948 | Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid |
| Magnesium Sulfate | Sigma | C86677-25G | |
| MgSO4 | VWR | 97062-998 | |
| Microscope Plain Slides | VWR | 16004-422 | |
| Millipore Filter | Millipore | 1.11727.2500 | |
| Molecular Devices ImageXpress | Molecular Devices | Model Number:IXMConfocal | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532 |
| Nystatin (10mg/mL) | Sigma | N6261-25MU | |
| Peptone | Sigma | P7750-100G | |
| Petri Dishes (6 cm) | VWR | 25384-092 | |
| Pipette Controller | VWR | 613-4180 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-3 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR | 0781-500G | |
| Potasssium Hydroxide | Fisher | P250-500 | |
| Red Fluroscent Microspheres | Polysciences | 19507-5 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 746398-500G | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | 111357 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher | BP332-500 | |
| Standard Gilson Pipette Set | Gilson | FA10002M, FA10004M, FA10006M | |
| Streptomycin (100mg/mL) | Sigma | S6501-25G | |
| Union Biometrica COPAS BioSorter | Union Biometrica | https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3. |
References
- Félix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Current Biology. 20 (22), 965-969 (2010).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Brenner, S. The genetics of behaviour. British Medical Bulletin. 29 (3), 269-271 (1973).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/ (2006).
- Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment. Scientific Reports. 7 (1), 9839 (2017).
- Loer, C. M., et al. Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4). Genetics. 200 (1), 237-253 (2015).
- Li, Y., Paik, Y. K. A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans. BMB Reports. 44 (4), 285-290 (2011).
- Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1648-1661 (2010).
- Fritz, J. A., Behm, C. A. CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity. PloS One. 4 (4), 5117 (2009).
- Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218 (4572), 578-580 (1982).
- Jeong, P. Y., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Kaplan, F., et al. Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage. PLoS One. 6 (3), 17804 (2011).
- Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218 (4572), 578-580 (1982).
- Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology. PLoS Genetics. 10 (2), 1004156 (2014).
- Rosenblatt, M. A central limit theorem and a strong mixing condition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 42 (1), 43-47 (1956).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology. Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).
- Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2020).
- Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (5), 544-548 (2005).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
- Kevin, S., Pulak, R. Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System. C. elegans. Methods in Molecular Biology. Strange, K. 351, Humana Press. 275-286 (2006).
- Lee, D., et al. Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1455-1463 (2019).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).
- Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).
