For at bruge Caenorhabditis elegans (C. elegans) i omics forskning, en metode er nødvendig for at generere store populationer af orme, hvor en enkelt prøve kan måles på tværs af platforme for sammenlignende analyser. Her præsenteres en metode til kultur C. elegans populationer på store kulturplader (LSCP’er) og til at dokumentere befolkningstilvæksten.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) har været og er fortsat en værdifuld model organisme til at studere udviklingsbiologi, aldring, neurobiologi og genetik. Den store mængde arbejde på C. elegans gør det til en ideel kandidat til at integrere sig i store, hele dyreforsøg for at dissekere de komplekse biologiske komponenter og deres forhold til en anden organisme. For at kunne anvende C. elegans i forskningssamarbejde er der behov for en metode til at generere store populationer af dyr, hvor en enkelt prøve kan opdeles og analyseres på tværs af forskellige platforme til sammenlignende analyser.
Her præsenteres en metode til kultur og indsamling af en rigelig blandet fase C. elegans befolkning på en storstilet kulturplade (LSCP) og efterfølgende fænotypiske data. Denne rørledning giver et tilstrækkeligt antal dyr til at indsamle fænotypiske data og befolkningsdata sammen med alle data, der er nødvendige for -omics-forsøg (dvs. genomik, transskriptionomics, proteomics og metabolomics). Desuden kræver LSCP-metoden minimal manipulation af dyrene selv, mindre brugerforberedelsestid, giver en stram miljøkontrol og sikrer, at håndteringen af hver prøve er konsistent under hele forsøget for generel reproducerbarhed. Endelig præsenteres metoder til at dokumentere befolkningsstørrelse og befolkningsfordeling af C. elegans livsstadier i et givet LSCP.
C. elegans er en lille fritlevende nematode, der findes over hele verden i en række naturlige levesteder1. Dens relative lethed af vækst, hurtig generationstid, reproduktionssystem og gennemsigtig krop gør det til en stærk modelorganisme, der er blevet bredt undersøgt i udviklingsbiologi, aldring, neurobiologi og genetik2,3. Det rigelige arbejde med C. elegans gør det til en oplagt kandidat til at bruge i-omics undersøgelser til omfattende link fænotyper med komplekse biologiske komponenter og deres relationer i en given organisme.
For at kunne anvende C. elegans i forskningssamarbejde er der behov for en metode til at generere store populationer af dyr i blandede faser, hvor en enkelt prøve kan opdeles og anvendes på tværs af forskellige platforme og instrumenter til sammenlignende analyser. Oprettelse af en rørledning til at generere en sådan prøve kræver stor bevidsthed om kost, miljø, stress, befolkningsstruktur, og prøve håndtering og indsamling. Derfor er det afgørende at have standard- og reproducerbare dyrkningsforhold integreret i store rørledninger. I C. elegans forskning, to traditionelle metoder bruges til at dyrke orme – agar Petri retter og flydende kultur4.
Historisk set, når der er behov for store mængder C. elegans, dyrkes de i flydende kultur4. De skridt, der er involveret i at generere en stor population af orme i flydende kultur kræver flere håndtering trin, der ofte omfatter blegemiddel synkronisering til brud gravid voksne neglebånd, frigive embryoner for at opnå den ønskede befolkning størrelse. Men når blegemiddel synkronisering anvendes, befolkningstilvæksten er afhængig af start folketælling størrelse og dermed virkninger efterfølgende vækst og befolkningstal. Derudover varierer C. elegans-stammer i deres neglebåndsfølsomhed, eksponeringstid og stressrespons på blegemiddelsynkronisering, hvilket gør det vanskeligt at analysere mange stammer ad gangen5,6,7,8,9.
Derudover kræver ormvækst i flydende kultur et par overførselstrin, da det ofte anbefales at dyrke kun en generation af orme før høst, fordi overbelægning let kan forekomme, hvis den dyrkes i flere generationer og fører til dauerdannelse på trods af tilstedeværelsen af mad10. Dauer dannelse sker gennem små signalering molekyler såsom ascarosider, ofte benævnt “dauer feromoner”11,12,13,14, frigives i flydende medier og virkning væksten af befolkningen. Desuden fører voksende store ormpopulationer i flydende kultur til overskydende bakterieakkumulering i kulturen, hvilket skaber vanskeligheder, når der er behov for en ren prøve til downstream-fænotypiske assays. Endelig, når en flydende kultur bliver forurenet, er det vanskeligere at opretholde som svampesporer eller bakterieceller let spredes i hele medierne15.
Den anden traditionelle metode til dyrkning af C. elegans er på agar Petri retter. Kommercielt tilgængelige Petri retter giver en mulighed for nemt at dyrke flere generationer af blandet fase orme uden de hurtige virkninger af overbelægning og høj dauer dannelse som set i flydende kulturer. Men en ulempe ved orm vækst på traditionelle agar Petri retter er, at den største kommercielt tilgængelige Petri parabol ikke giver store orm befolkninger for en-omics undersøgelse uden at tilføje i en blegemiddel synkronisering trin. Sammenfattende er dyrkning af blandede stadier af C. elegans på agar Petri retter mere egnet til indsamling af -omics data, men vi krævede en metode til at generere meget store befolkningsstørrelser uden flydende dyrkning.
Her præsenterer vi en metode til kultur og samler store blandede C. elegans populationer på store kulturplader (LSCP). Indsamling af prøver gennem denne rørledning giver tilstrækkelig prøve til at indsamle fænotypiske data og befolkningsdata sammen med alle data, der er nødvendige for -omics-eksperimenter (dvs.genomik, transskriptionomics, proteomics og metabolomics). Desuden kræver LSCP-metoden minimal manipulation af dyrene, mindre brugerforberedelsestid, giver en stram miljøkontrol og sikrer, at håndteringen af hver prøve er konsistent under hele undersøgelsen for generel reproducerbarhed.
En række fartøjer kan bruges som LSCP. I denne protokol blev der brugt en standard glasbageplade. De LSC’er, der var i brug, havde ydre dimensioner på 35,56 x 20,32 cm, indvendige dimensioner på 27,94 x 17,78 cm og ca. 4,45 cm dybe og kom med et monteret låg. Således er mængden af bakterier, der anvendes her, blevet optimeret til et LSCP med ovenstående dimensioner for at give en stor population af orme i blandet fase. Bakteriel volumen og koncentration kan justeres, så de passer til forsøgsbehovene.
Forurening med skimmel, svampe eller andre bakterielle kilder kan forekomme på ethvert trin i LSCP-metoden, så håndter prøver med omhu. Før du starter et trin i protokollen, skal du sikre dig, at arbejdsområdet rengøres med 70% ethanol og 10% blegemiddel. Hvis det er muligt, behandle brugte områder med UV-lys i 30 min og tænde en HEPA luftfilter 30 min før du starter hvert trin.
Ved at dyrke LSCP i kontrollerede omgivelser (dvs.i et CT-rum, der er indstillet til 20 °C), kan brugeren lettere spore prøvens vækst og dokumentere potentiel kontaminering. Hvis LSCP’s overflade bliver forurenet, skal forureningen enten udskæres, når det er muligt, og prøven fortsætte med at vokse eller kassere prøven, hvis kontamineringen ikke er mulig at kontrollere. Det er bydende nødvendigt at håndtere forurening hurtigt for at reducere uønsket vækst og for at sikre, at det ikke udkonkurrerer orme for ressourcer.
Denne metode er beregnet til dem, der ønsker at dyrke store blandede befolkningskulturer i C. elegans. Selv om det kan være muligt at dyrke synkroniserede populationer af orme på LSCP som gjort på kommercielt tilgængelige Petri retter og i flydende kultur, har forfatterne ikke testet denne mulighed. Hvis brugerne desuden ønsker at dyrke mere end ca. 2,4 millioner orme i gennemsnit i en given prøve, anbefales en anden metode4. Vækstsucces afhænger af den belastning, der behandles i pipelinen. Forfatterne var i stand til at vokse populationer på ca. 2,4 millioner orme i mindst fem biologiske replikater af 15 C. elegans stammer, hvilket indikerer, at metoden er robust.
Før eksperimentet påbegyndes, skal du bemærke, at en given orms alder og sundhed kan påvirke fecundity og efterfølgende befolkningstilvæksttid. Sørg for, at orme opretholdes under sunde forhold med minimal stress, før de bruges i denne rørledning. Det antages, at der er skabt, frosset og opbevaret lagerprøver ved -80 °C for at reducere den genetiske afdrift over tid.
Afhængigt af behovene i et givet eksperiment kan antallet af begyndende gravide voksne på et LSCP ændres. Ændring af antallet af begyndende gravide voksne på LSCP vil ændre vækstraten og dermed tid til at høste. Fem gravide voksne er vant til frø hver LSCP af følgende grunde: (1) En enkel, hurtig og effektiv måde at frø mange C. elegans stammer på LSCPs på én gang var nødvendig, og (2) for at reducere aldersforskellene blandt de gravide voksne plukket, der kan føre til vækst heterogenitet.
Denne metode giver brugeren mulighed for at høste store populationer af orme med alle livscyklusstadier til stede. Med de nuværende metoder til rådighed, indsamling af store prøver af C. elegans kræver blegemiddel synkronisering for at opnå det antal orme ønskede for downstream arbejde. I betragtning af denne tilgang kan man nu dyrke så mange orme som tidligere muligt i fermenteringsmaskiner eller store flydende kulturer uden vanskeligheder forbundet med blegemiddelsynkronisering og flere håndteringstrin. Vores protokol gør det muligt at målrette interessestammer effektivt, bruge minimal håndteringstid til at dyrke selve prøven og isolere stadier af orme eller befolkningen efter behov i downstream-rørledninger.
En LPFC blev brugt som et værktøj til at dokumentere befolkningsfordelingen og størrelsen i et givet LSCP. Den anvendte LPFC er et kontinuerligt flowsystem, der analyserer, sorterer og dispenserer orme baseret på deres størrelse (TOF) og optisk tæthed. Som en given orm passerer gennem flowcellen, opfanger den aksiale lystabsdetektor mængden af signallys, der er blokeret af en 488 nm solid state laser i den tid, det tager en orm at passere igennem, hvilket giver brugeren tof og optisk tæthed af ormen. Fluorescens indsamling optik og detektorer kan også bruges til at maksimere fluorescens følsomhed og indsamling på hver prøve. LPFC-indsamlingsparametrene varierer afhængigt af instrumentet. Brugere kan anvende en række forskellige platforme til at registrere ormens størrelse og er ikke begrænset til at bruge denne protokol, hvis en LPFC ikke er tilgængelig.
Forfatterne bruger prøver dyrket i den metode, der er beskrevet her for at identificere ukendte metabolitter i forskellige stammer af C. elegans via Flydende kromatografi – Massespektrometri, NMR-spektroskopi og RNA-sekventering. Forfatterne planlægger at fortsætte med at bruge denne metode til vækst af prøver i denne rørledning med en række C. elegans stammer som nye stammer af interesse let kan behandles ved hjælp af denne rørledning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer af Edison Lab for nyttige diskussioner og feedback på dette manuskript; især B.M. Garcia. Nogle stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), og CeNDR, som er finansieret af NSF Living Collections CSBR 1930382. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra NIH (U2CES030167).
10 mL Sterile Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
10 ul pipette tips | VWR | 89079-438 | |
100 ul pipette tips | VWR | 89079-442 | |
1000 mL Graduated Cylinder | VWR | 10124-380 | |
1000 ul pipette tips | VWR | 89079-488 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-668 | |
190 Proof Ethanol | VWR | 89125-166 | |
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask | VWR | 75804-654 | |
50 mL conical tubes | VWR | 75874-294 | |
Agar | Sigma | 05040-100G | |
Agarose | Sigma | A9539-500G | |
BVC Control G Fluid Aspiration System | Vacuubrand | ||
Calcium Chloride | Sigma | 449709-10G | |
Cholesterol | Sigma | C3045-25G | |
Clorox Bleach | VWR | 89414-502 | |
Conviron Control Temperature Room | Conviron | https://www.conviron.com/environmental-rooms | |
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate | VWR | 89089-866 | |
Fisher Scientific Accuspin 3R | Fisher | ||
Flat-Bottom 24-Well Plate | VWR | 29443-952 | |
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. | Home Depot | 204390560 | |
HT115 E. coli (DE3) | CGC | HT115(DE3) | https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3) |
Kimwipes | VWR | 470224-038 | |
Large Scale Culture Plate (LSCP) | Pyrex | 1090948 | Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid |
Magnesium Sulfate | Sigma | C86677-25G | |
MgSO4 | VWR | 97062-998 | |
Microscope Plain Slides | VWR | 16004-422 | |
Millipore Filter | Millipore | 1.11727.2500 | |
Molecular Devices ImageXpress | Molecular Devices | Model Number:IXMConfocal | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532 |
Nystatin (10mg/mL) | Sigma | N6261-25MU | |
Peptone | Sigma | P7750-100G | |
Petri Dishes (6 cm) | VWR | 25384-092 | |
Pipette Controller | VWR | 613-4180 | |
Potassium Chloride | Fisher | P217-3 | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR | 0781-500G | |
Potasssium Hydroxide | Fisher | P250-500 | |
Red Fluroscent Microspheres | Polysciences | 19507-5 | |
Sodium Chloride | Sigma | 746398-500G | |
Sodium Hydroxide | Fisher | 111357 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher | BP332-500 | |
Standard Gilson Pipette Set | Gilson | FA10002M, FA10004M, FA10006M | |
Streptomycin (100mg/mL) | Sigma | S6501-25G | |
Union Biometrica COPAS BioSorter | Union Biometrica | https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3. |