Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Kultur og analyse av storskala blandet-stage Caenorhabditis elegans populasjoner

doi: 10.3791/61453 Published: May 5, 2021

Summary

For å bruke Caenorhabditis elegans (C. elegans) i omics forskning, er det nødvendig med en metode for å generere store populasjoner av ormer der en enkelt prøve kan måles på tvers av plattformer for komparative analyser. Her presenteres en metode for kultur C. eleganspopulasjoner på store kulturplater (LSCPer) og for å dokumentere befolkningsvekst.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) har vært og forblir en verdifull modellorganisme for å studere utviklingsbiologi, aldring, nevrobiologi og genetikk. Den store kroppen av arbeid på C. elegans gjør det til en ideell kandidat til å integrere seg i storbefolkningsstudier av hele dyr for å dissekere de komplekse biologiske komponentene og deres forhold til en annen organisme. For å kunne bruke C. elegans i samarbeidende omics forskning, er det nødvendig med en metode for å generere store populasjoner av dyr der en enkelt prøve kan deles og analyseres på tvers av forskjellige plattformer for komparative analyser.

Her presenteres en metode for kultur og innsamling av en rikelig blandet fase C. elegans befolkning på en storstilt kulturplate (LSCP) og påfølgende fenotypiske data. Denne rørledningen gir tilstrekkelig antall dyr til å samle inn fenotypiske data og populasjonsdata, sammen med data som trengs for -omics-eksperimenter (dvs. genomikk, transkripsjonomikk, proteomikk og metabolomikk). I tillegg krever LSCP-metoden minimal manipulering til dyrene selv, mindre brukerforberedelsestid, gir tett miljøkontroll og sikrer at håndteringen av hver prøve er konsistent gjennom hele studien for generell reproduserbarhet. Til slutt presenteres metoder for å dokumentere befolkningsstørrelse og befolkningsfordeling av C. elegans livsstadier i en gitt LSCP.

Introduction

C. elegans er en liten frittlevende nematode som finnes over hele verden i en rekke naturlige habitater1. Dens relative enkel vekst, rask generasjonstid, reproduksjonssystem og gjennomsiktig kropp gjør det til en kraftig modellorganisme som har blitt studert mye i utviklingsbiologi, aldring, nevrobiologi og genetikk2,3. Det omfattende arbeidet med C. elegans gjør det til en ypperlig kandidat å bruke i -omics studier for å fullstendig koble fenotyper med komplekse biologiske komponenter og deres relasjoner i en gitt organisme.

For å bruke C. elegans i samarbeidsforskning er det nødvendig med en metode for å generere store blandede populasjoner av dyr der en enkelt prøve kan deles og brukes på tvers av forskjellige plattformer og instrumenter for komparative analyser. Å lage en rørledning for å generere et slikt utvalg krever stor bevissthet om kosthold, miljø, stress, befolkningsstruktur og prøvehåndtering og innsamling. Derfor er det avgjørende å ha standard og reproduserbare kultiveringsforhold integrert i store rørledninger. I C. elegans forskning brukes to tradisjonelle metoder til kultur ormer - agar Petri retter og flytende kultur4.

Historisk, når store mengder C. elegans er nødvendig, vokser de i flytende kultur4. Trinnene som er involvert i å generere en stor populasjon av ormer i flytende kultur krever flere håndteringstrinn som ofte inkluderer blekemiddelsynkronisering for å briste gravide voksne kutikkler, og frigjør embryoer for å oppnå ønsket befolkningsstørrelse. Men når blekemiddelsynkronisering brukes, er befolkningsveksten avhengig av start på tellingsstørrelse og påvirker derfor etterfølgende vekst og befolkningstall. I tillegg varierer C. elegans stammer i deres kutikale følsomhet, eksponeringstid og stressrespons på blekemiddelsynkronisering, noe som gjør det vanskelig å analyse mange stammer om gangen5,6,7,8,9.

I tillegg krever ormvekst i flytende kultur et par overføringstrinn, da det ofte anbefales å vokse bare en generasjon ormer før høsting fordi overbefolkning lett kan oppstå hvis de vokser i flere generasjoner og fører til dauerformasjon til tross for tilstedeværelsen av mat10. Dauerformasjon skjer gjennom små signalmolekyler som askarosider, ofte referert til som "dauer feromoner"11,12,13,14, frigjøres i flytende medier og påvirker veksten av befolkningen. Videre fører voksende store ormpopulasjoner i flytende kultur til overflødig bakterieakkumulering i kulturen, noe som skaper vanskeligheter når en ren prøve er nødvendig for nedstrøms fenotypiske analyser. Til slutt, når en flytende kultur blir forurenset, er det vanskeligere å opprettholde som soppsporer eller bakterieceller spres lett gjennom media15.

Den andre tradisjonelle metoden for å dyrke C. elegans er på agar Petri retter. Kommersielt tilgjengelige Petri-retter gjør det enkelt å dyrke flere generasjoner av blandede ormer uten de raske effektene av overbefolkning og høy dauerformasjon sett i flytende kulturer. Imidlertid er en ulempe med ormvekst på tradisjonelle agar Petri-retter at den største kommersielt tilgjengelige Petri-parabolen ikke gir store ormpopulasjoner for en -omics studie uten å legge til et blekemiddelsynkroniseringstrinn. Oppsummert er kultivering av blandede populasjoner av C. elegans på agar Petri-retter mer egnet for innsamling av -omics data, men vi krevde en metode for å generere svært store befolkningsstørrelser uten flytende kulturing.

Her presenterer vi en metode for kultur og samler store C. eleganspopulasjoner i blandet fase på storskala kulturplater (LSCP). Innsamling av prøver gjennom denne rørledningen gir nok utvalg til å samle inn fenotypiske data og populasjonsdata, sammen med data som trengs for -omics-eksperimenter (dvs.genomikk, transkripsjon, proteomikk og metabolomikk). I tillegg krever LSCP-metoden minimal manipulering av dyrene, mindre brukerforberedelsestid, gir tett miljøkontroll og sikrer at håndteringen av hver prøve er konsistent gjennom hele studien for generell reproduserbarhet.

Protocol

1. Steriliser LSCP og utstyr

  1. Forbered glass-LSCPer ved håndvask, etterfulgt av oppvask og påfølgende autoklavering for å sikre at glassvarer er fri for forurensninger før du starter eksperimentet. Oppbevar autoklavede LSCPer på et rent, tørt sted til de er i bruk.
    MERK: Sørg for at LSCPer er oppvaskmaskin og autoklaver trygge. Sørg for at LSCP-lokkene kan vaskes i oppvaskmaskin.
  2. Forbered LSCP-lokk ved håndvask etterfulgt av oppvask. Oppbevar LSCP-lokkene i en ren beholder til det er nødvendig.
  3. På dagen Nematode Growth Media Agarose (NGMA) er preppet, tørk LSCP lokk med 10% blekemiddelløsning to ganger, etterfulgt av 70% etanol. Når LSCP-dekslene er tørket av med 10 % blekemiddel og 70 % etanol, holder du de i en ren beholder i laminær strømningshette der NGMA vil bli klargjort.

2. Forbered nematode vekstmedier agarose (NGMA)

  1. Forbered NGMA ved å kombinere følgende reagenser i en autoklavert 2 L Erlenmeyer-kolbe med rørestang på en røreplate: 2,5 g peptone, 3 g NaCl, 7 g agarose, 10 g agar og 975 ml sterilt vann16. Påse at det totale volumet er lik 1 L. Tape en foliehette til kolben.
    MERK: Forberedelsestrinnene for NGMA som beskrevet her, vil gi nok materiale til 2,5 LSCPer. Protokollen kan skreddersys til ønsket LSCP batchstørrelse i et gitt eksperiment.
  2. Autoklav på væskesyklus ved 121 °C og 21 p.s.i. i 45 min.
  3. Slå på vannbadet og sett det til 50 °C. Ta med autoklavede NGMA til vannbadet for å avkjøles til 50 °C.
  4. Ta med 2 L Erlenmeyer-kolbe av NGMA inn i hetten eller rengjort plass og sett på en røreplate. Bruk et termometer for å spore NGMA-temperatur.
  5. Etter at NGMA har nådd 50 °C, legg til følgende i rekkefølgen som er oppført med en steril engangspipette inne i hetten eller rengjort plass: 25 ml 1 M KH2PO4 (K fosfatbuffer), 1 ml kolesterol (5 mg / ml i etanol), 1 m L av 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml nystatin (10mg/ml) og 1 ml streptomycin (100 mg/ml)16.
  6. Hell 400 ml NGMA i et sterilt glass LSCP, ca. 1,3 cm dypt, la LSCP størkne på flat overflate i hetten og legg det autoklavede folielokket tilbake på LSCP.
  7. Når agaren er stilt inn, fjern folien og sett et rent lufttett lokk på LSCP og flytt til 4 °C for oppbevaring. Oppbevar NGMA i LSCPer ved 4 °C til den er i bruk og bruk innen 5 dager.

3. Generer E. coli-mat til NGMA på LSCP

  1. For å generere en stabil matkilde, generer partier med HT115 (DE3) E. coli ved hjelp av et lite batchgjennomsnittskonsept i samsvar med sentralgrenseteoremet17. Oppbevars ved -80 °C. Trekk ved behov E. coli bakteriebestand(er) fra -80 °C for å tine18.
    MERK: I denne protokollen ble E. coli bakteriebestander dyrket i en bioreaktor. På slutten av kulturveksten ble kulturen fortynnet 1:50, og den målte OD600 var 0,4. Dermed hadde kulturen en effektiv OD600 av 20. Bakterier ble pelletert, veid og resuspendert i K-medium i en konsentrasjon på 0,5 g/ml (våtvekt), overført til 2 ml aliquots og frosset19.

4. Bakteriell plen på NGMA

  1. Ta NGMA LSCPer ut av 4 °C til romtemperatur (RT) i flere timer før du sprer den bakterielle plenen slik at hele LSCP når RT.
  2. Trekk ut nødvendig E. coli bakteriebestand (er) fra -80 °C for å tine18.
  3. Fortynn E. coli bakteriebestand(er) med 2 ml sterilt K-medium for å oppnå 0,5 g E. coli i 4 ml per NGMA LSCP. Pipette 4 ml E. coli forsiktig midt i NGMA LSCP.
  4. Bruk en steril spreder for å spre bakterier inn i et rektangel som etterlater omtrent 3,8 cm plass rundt kantene på NGMA E. coli-fri.
  5. La NGMA LSCP med E. coli stå i hetten med viften på i 1 time for å sikre at E. coli-fjæringen tørker helt.
  6. Når bakteriell plen er tørr, skyv lokket tett på og oppbevar ved 4 °C til det er brukt.

5. Del ormer for å redusere stress og aldersvariabilitet på tvers av prøver

  1. Strek ormer fra en frossen orm lager til en nylig frø 6 cm plate4. Denne platen vil fungere som "master chunk" -platen.
    MERK: Chunking er en optimal metode for å overføre ormer fra en homozygot stamme20. Hvis en stamme er heterzygot eller må opprettholdes ved plukking og parring, er det ikke tilrådelig å dele. Chunking frekvens må kanskje optimaliseres avhengig av orm genotyper som brukes, temperatur valgt for vekst, og nedstrøms trinn.
  2. Etter at master chunk plate er full av sunne gravid voksne (ca 3 dager) med rikelig med E. coli plen fortsatt til stede, følg standard C. elegans chunking retningslinjer som beskrevet i WormBook å produsere fire totale chunk plates4.
  3. Oppbevar alle delplater i et kontrollert temperaturrom (CT) ved 20 °C med mindre annet er spesifisert for vekst.
    MERK: Hvis brukere av denne protokollen ikke har tilgang til et CT-rom som beskrevet her, anbefales det å bruke enten en liten inkubator der temperaturen kan kontrolleres eller et utpekt rom der miljøforholdene kan kontrolleres så mye som mulig. Hvis ingen av disse alternative alternativene er tilgjengelige, må du være oppmerksom på at variasjonen i utvalgsveksten kan være større.
  4. Når mange gravide voksne er observert i denfjerde delplaten, gå videre til trinn 6.

6. Spot bleking gravid voksne på LSCP

MERK: Denne blekingsteknikken brukes til å utrydde de fleste forurensninger og oppløse kutiklet av hermafrodittene som frigjør embryoer fra voksenormen. Blekemiddelløsningen vil suge inn i NGMA før embryoene klekkes.

  1. Ta med LSCPer ut til RT i flere timer før bleking av flekker.
  2. Forbered et 7:2:1-forhold på ddH2O : blekemiddel : 5 M NaOH. Gjør denne alkaliske hypoklorittoppløsningen frisk like før bruk.
    MERK: Bruk samme lager av blekemiddel og NaOH gjennom hele varigheten av et gitt eksperiment for å unngå blekemiddel batch påvirker. Blekemiddel som ble brukt i denne protokollen var 5-10% natriumhypokloritt.
  3. Tenn en Bunsen brenner og flamme en orm plukke før du fortsetter. Øs fersk E. coli på et sterilt valg fra kanten av bakteriell plen på LSCP.
  4. Velg en enkelt gravid voksen fra denfjerde delplaten for spotbleking.
  5. Pipette 5 μL av den alkaliske hypoklorittoppløsningen i ett hjørne av LSCP vekk fra E. coli-plenen.
  6. Plasser den plukkede gravid voksen i 5 μL alkalisk hypoklorittoppløsning. Trykk på nematoden for å forstyrre kutiklet og frigjøre egg.
  7. Gjenta trinn 6.4 - 6.6 for totalt 4x og plasser 5 gravid voksne jevnt rundt E. coli plenen. Velg alle 5 gravid voksne fra samme fjerdedel plate for å sikre nesten genetisk isogene individer legges til en gitt prøve.
  8. Sett lokket tilbake på LSCP.
  9. Gjenta trinn for alle LSCPer.

7. Ormvekst i kontrollert temperatur (CT) rom

  1. Etter flekker bleking, plasser lokket tett på LSCP og plasser i CT-rommet satt til 20 °C med konstant luftstrøm og en 12L:12D fotoperiod (12 t lys og 12 timers mørke).
  2. Legg merke til tiden og posisjonen der prøven ble plassert i CT-rom.
    MERK: Posisjon i rommet bør alltid dokumenteres for å registrere eventuelle miljøforskjeller som prøver som potensielt kan oppstå mens de vokser. Når prøven er i CT-rommet, bør den forbli på sitt tildelte sted uforstyrret. Ikke åpne lokket på LSCP i CT-rommet for å redusere sjansen for kontaminering.
  3. Ta LSCP til et mikroskop, utenfor CT-rommet, for å observere befolkningsveksten og tettheten.
    MERK: Hver C. elegans belastning og prøve vil variere i veksten, så følg prøvene nøye. Selv om det anbefales å ikke forstyrre veksten av LSCP mens du er i CT-rommet, ble LSCPer transportert ut av CT-rommet og lokk ble åpnet annenhver dag for å overvåke prøvevekst. Hvis du tar de forseglede lokkene av LSCP-ene annenhver dag, kan det også strømme O2 inn i LSCP.
  4. Før høsting må du sørge for at LSCP har blitt full av en stor populasjon av ormer. Bruk følgende kriterier for å avgjøre om LSCP er klar til å samles inn.
    1. Forsikre deg om at LSCP er full av gravid voksne ormer.
    2. Pass på at platen inneholder en stor populasjonsstørrelse (dvs. ormer dekker hele overflaten av agaren).
    3. Pass på at platen ikke har mange egg på overflaten av agaren (dvs.skal maksimalt antall ormer ha klekket ut).
    4. Forsikre deg om at platen har minimal til ingen E. coli igjen, noe som indikerer at ormene vil sulte og generere dauer larver hvis de blir igjen på platen i ytterligere to dager.
      MERK: Selv om de fleste LSCPer er klare til å høste mellom 10 og 20 dager, avhengig av belastning og prøve, må du kontrollere hver LSCP ofte ved å etablere denne protokollen for å bestemme normale høsttider.
  5. Rengjør hansker og areal med 70% etanol mellom håndtering av LSCPer for å unngå krysskontaminering mellom stammer.

8. Høsting av LSCP-prøven

  1. Slå på og la sentrifugen avkjøles til 4 °C før høsting av prøver.
  2. Forbered tre 50 ml koniske rør med 50 ml M9-oppløsning per LSCP som skal høstes.
  3. Merk ett konisk rør på 15 ml per LSCP.
    MERK: Alle sentrifugeringstrinn utføres i det 15 ml kjeglerøret, fordi ormer har en tendens til å pellet godt i disse rørene.
  4. Hell 50 ml M9-oppløsning (fra ett konisk rør på 50 ml i trinn 8.2) på LSCP-overflaten og virvle rundt for å sikre at M9 dekker hele NGMA-overflaten.
  5. Mens M9 sitter på LSCP-overflaten, primer du en steril serologisk pipette med M9.
    MERK: Ved å grunne den sterile serologiske pipetten med M9 sikrer dette at mindre ormer holder seg til innsiden av plastpipetten, og forhindrer prøvetap.
  6. Vipp LSCP slik at M9 og ormepopulasjonen samles i ett hjørne av LSCP.
    MERK: Blandingen av M9-oppløsning og ormer fra LSCP vil bli referert til som "ormfjæring" i nedstrømstrinn.
  7. Bruk en primet serologisk pipette med en automatisk pipettor, pipetteormfjæring og plasser den i det originale 50 ml koniske røret. Når 50 ml orm suspensjon er samlet, plasser det koniske røret på en rocker for å forstyrre bakterier klumper og rusk.
  8. Gjenta trinn 8.4 - 8.7 samle 150 ml orm suspensjon per LSCP.
  9. Overfør 15 ml orm suspensjon, fra en av de tre 50 ml koniske rørene, ved å helles i et merket 15 ml konisk rør satt til side i trinn 8.3. Sentrifuger det koniske røret på 15 ml ved 884 x g i 1 min ved 4 °C. De fleste ormer vil pellet på bunnen av røret.
  10. Aspirer av supernatanten og sørg for ikke å forstyrre ormepellet.
  11. Fortsett å legge til ca. 13 ml ormfjæring til samme 15 ml koniske rør som gjentar trinn 8,9 og 8,10 til alle 150 ml ormeoppheng forbrukes. Snu røret og forstyrr pellet mellom sentrifuger for å vaske og aspirere av så mye bakterier og rusk som mulig.
    MERK: På dette trinnet kondenseres innholdet fra alle tre koniske rør på 50 ml i et enkelt 15 ml rør.
  12. Tilsett 10 ml ren M9 til det koniske røret på 15 ml og rør ormepellet ved å invertere. Sentrifuger det koniske røret på 15 ml ved 884 x g i 1 min ved 4 °C. Aspirer av supernatanten og sørg for ikke å forstyrre ormepellet. Gjenta to ganger.
    MERK: Hvis det er mye rusk eller bakterier i prøven, gjentar du trinn 8.12 til prøven er ren.
  13. Når prøven er ren, legg ddH2O til ormepellet for totalt 10 ml ddH2O og ormer. Agitate orm pellet ved å invertere. Beveg deg raskt inn i trinn 9.1, da ormer må forbli i ddH2O i 5 minutter eller mindre for å unngå osmotisk stress.
    MERK: Suspendering av ormpellets i ddH2O er det foretrukne løsningsmidlet for nedstrøms -omics trinn. Ormer kan suspenderes i andre løsningsmidler eller buffere hvis de er kompatible med en gitt eksperimentell arbeidsflyt.

9. Beregn befolkningsstørrelse

MERK: Gå raskt gjennom trinn 9.1 – 9.7. Blandingen av ddH2O og ormer fra trinn 8.13 kalles "ormeprøven" i etterfølgende trinn.

  1. Før pipettering av ormprøven, må du bruke den beste pipettespissen med M9 for å unngå at ormer fester seg til innsiden av plastpipetten, noe som forhindrer prøvetap og reduserer variasjonen i antall.
  2. Ta en 100 μL aliquot av ormprøve og fortynn den i 900 μL M9. Bland godt og lag en seriell fortynning (1:10, 1:100, 1:1000). Gjenta dette trinnet to ganger for å oppnå totalt tre sett aliquot-replikeringer.
    MERK: Pipetteringsormer kan forårsake høy variasjon i antall utvalgspopulasjoner. Forsikre deg om at ormeprøven er homogen før pipettering ønsket aliquot.
  3. Sett det koniske røret på 15 ml på en rocker for å fortsette å bevege kulturen mens aliquots telles.
  4. Forsikre deg om at ormeprøven er godt blandet og homogen. Pipette 5 μL fra 1:10 ormprøven, dispenser den på en mikroskopisklie og tell antall ormer. Hvis dette tallet er mindre enn ca. 50 ormer, teller du også fortynningene 1:100 og 1:1000. Hvis den er mer enn 50, går du til neste serielle fortynning.
    MERK: Hvis for mange ormer ikke kan telles nøyaktig, bruker du neste serielle fortynning til telling i stedet.
  5. Tell hver aliquot-replikering av hver fortynning 3x. Ved slutten av tellingen, for de fleste kulturer, vil 9 totale tellinger bli dokumentert (dvs., 3 totale antall for hver aliquot replikering).
  6. Gjennomsnittet av fortynningsantallet for å bestemme den estimerte populasjonsstørrelsen for ormeutvalget. Disse fortynningstallene vil bestemme volumet av ormprøve som trengs for å skape ønsket aliquotstørrelse for -omics-trinn.
    MERK: I dette eksperimentet ble det generert aliquots på ca. 200 000 ormer i blandet stadium. I tillegg ble en aliquot på ca. 50 000 ormer i blandet stadium satt til side for sortering i et stort partikkelstrømcytometer (beskrevet i trinn 10).
  7. Når ormeprøven er delt inn i passende aliquots, blinker du fryse i flytende nitrogen og lagrer prøven ved -80 °C.
    MERK: Ikke frys aliquoten beregnet på stor partikkelstrømcytometri.

10. (Valgfritt) Prepping prøve for stor partikkelstrømcytometri

MERK: Trinn 10, 11 og 12 er forfatternes foretrukne metode for å registrere utvalgsvekst (dvs. befolkningsstørrelse og befolkningsfordeling av C. elegans livssyklusstadier) og bestemme suksessen til en kultur. Brukere av denne protokollen kan erstatte valgfrie trinn 10, 11 og 12 med sine egne beregninger for vekstsuksess. Trinn 10, 11 og 12 er beskrevet her av to grunner; Først, slik at brukere som har utstyr som brukes i trinn 10, 11 og 12, kan replikere disse trinnene og sekundet for å vise validering av denne vekstmetoden. Trinn 9 ovenfor gir en god estimering av totalt antall ormer for å bestemme aliquotstørrelser, og trinn 10 er en mer kvantitativ beregning for å estimere antall og populasjonsfordeling av ormer i et gitt utvalg.

  1. Ta med aliquot på ca. 50 000 ormer i blandet stadium (satt til side i trinn 9.6) opp til 10 ml totalt volum i M9-løsning.
  2. Lag en løsning som består av 1 mg/ml E. coli og en 1:50 fortynning av 0,5 μM røde fluorescerende mikrosfærer19.
  3. Tilsett 200 μL av denne løsningen til 10 ml blandede ormer i M9 og inkuber mens du gynger i 20 minutter.
  4. Etter 20 min, sentrifuger 15 ml konisk rør ved 884 x g i 1 min ved 4 °C.
  5. Aspirer av supernatanten og sørg for ikke å forstyrre ormepellet.
  6. Vask ormepellet to ganger med M9-oppløsning for å eliminere overflødige bakterier og røde fluorescerende mikrosfærer.
  7. Tilsett 5 ml M9 i ormepellets og sørg for at pelletsen ser ren ut. Hvis pelletsen er ren, tilsett 5 ml M9 med 50 mM natriumazid for å både rette og drepe ormene for nøyaktig telling og størrelse21.
  8. Dokumentere klokkeslett og dato når natriumazid legges til prøven.
  9. Sett prøven til side på rocker til det er nødvendig for stor partikkelstrømcytometri.
    MERK: Natriumazid er kjent for å påvirke nematodefysiologi (dvs.kroppslengde, metabolisme og termototoleranse). Derfor er det viktig å merke seg tiden ormer blir utsatt for natriumazid, da mange av disse fysiologiske virkningene skjer i løpet av få minutter22. På grunn av de kjente fysiologiske effektene av natriumazid på ormer, vil denne behandlingen påvirke nedstrøms bildekvalitet og bør vurderes.

11. (Valgfritt) Dokumentere befolkningsfordeling og prepping 384-brønnsplate for avbildning

MERK: Trinn 11 bruker et stort partikkelstrømcytometer (LPFC). Grunnleggende kunnskap om en LPFC antas i denne protokollen. Andre metoder kan erstattes for å dokumentere vekst og befolkningsfordeling av prøver. Trinnene som dokumenteres her, er for brukere som planlegger å bruke en LPFC i datasamlebåndet23.

  1. Slå på, rengjør og klargjør LPFC, og la laser(e) varme i 1 time før sorteringsprøver.
  2. Etter at laseren er varmet opp, åpner du profilen "Histogram" og skalerer til en Tof-rute (Time of Flight) fra 2050.
  3. Legg til et stolpeområde ihistogrammetsom strekker seg over et TOF-område på 100. Den første stolperegionen dekker en TOF på 50-150.
  4. Fortsett å opprette tjue stolpeområder som hver strekker seg over et TOF-område på 100. Disse stolpeområdene vil strekke seg over hele TOF-området fra 50 til 2050. Se Supplerende tabell 1 for de nøyaktige inngjerdede områdene som skal brukes på tvers av TOF-fordelingen.
  5. Lagre dette histogramoppsettet som eteksperimentsom skal brukes i fremtidige LPFC-kjøringer.
  6. Velg kalibrert 384-brønnsplate eller kalibrer instrumentet til en 384-brønnsplate for å dispensere gjenstander inn.
  7. Når du er i den kalibrerte 384-brønns platemalen, angir du mal for å dispensere 20 inngjerdede gjenstander i fire brønner (fire tekniske replikeringer av hver inngjerdede region) for hver av de 20 barområdene som ble opprettet i trinn 11.3-4. Se Supplerende tabell 2 for eksempel oppsett av hvordan du dispenserer ormer i 384-brønnsplaten.
  8. Overfør prøven fra trinn 10,9 til et konisk rør på 50 ml og tilsett ekstra M9-løsning for å oppnå omtrent 40 ml totalt volum.
  9. Begynn å sortere prøven automatisk i henhold til parametrene som er angitt i trinn 11.7, mens du kontinuerlig rører prøven for å forhindre at du setter og samtidig dispenserer gjenstander fra prøven til den kalibrerte 384-brønnsplaten.
    MERK: Kontroller at LPFC-strømningshastigheten fungerer mellom 15-20 objekter per sekund og ikke angi noen dobler som skal sorteres.
  10. Når hele prøven er sortert og maksimalt antall inngjerdede regioner er dispensert inn i 384-brønnsplaten, ta prøven av LPFC og rent instrument.
    MERK: Når større TOF-regioner nås, kan det bli utfordrende å fortsette å fylle 384-brønnsplaten på grunn av lave hendelsestall i tof-regionen. Fyll så mange av de inngjerdede regionene som mulig for å få den beste ideen om hvor C. elegans livsstadier faller innenfor LPFC-distribusjonen før du går tom for prøve.
  11. Plasser en tetningsfilm på toppen av 384-brønnsplaten til den er avbildet.
    MERK: Bildeplaten så raskt som mulig etter sortering fordi prøver behandles med natriumazid22. Røde fluorescerende mikrosfærer kan ses i de innsamlede LPFC-datafilene (dvs. PH Red-data i utdatatekstfilen) basert på nivået av rød fluorescens som slippes ut i hvert sortert objekt for å identifisere hvilke objekter som er levende ormer, døde ormer, dauers eller søppel24.

12. (Valgfritt) Bildebehandling 384-brønnsplate

MERK: Trinn 12 bruker et mikrokonfokalt mikroskop som leser platen. Grunnleggende kunnskap om et mikrokonfokalt mikroskop antas i denne protokollen. Andre metoder kan erstattes for å dokumentere vekst og befolkningsfordeling av prøver.

  1. Bruke et platelesende mikrokonfokalt mikroskop med en 20x linse.
  2. Åpne kategorienMål og kamera, og sett til10x Plan ApoLambda-modus.
  3. Åpne kategorienKamerabinning, og sett til2.
  4. Åpne kategorienOmråder å besøke på plateog sett til "4" nettsteder per brønn og " overlappe områder10%" for senere å sy sammen bilder.
  5. Åpne kategorienBølgelengdeog sett til" Brightfield 1".
  6. Åpne kategorienBelysningog sett til "Overført lys, lysprøve".
  7. Plasser 384-brønnsplaten i mikroskopet og sett "Z Stack" til "Beregn forskyvning" og finn riktig brennplan for prøvene i 384-brønnsplaten.
  8. Kjør 384-brønnsplaten på mikrokonfektmikroskopet og samle fire bilder per brønn.
  9. Monter de fire bildene sammen for å lage ett bilde per brønn.

Representative Results

Veksten av C. elegans ved hjelp av LSCP-metoden gir i gjennomsnitt ca. 2,4 millioner blandede ormer per prøve over 12,2 dager. Vekst av C. elegans ved hjelp av LSCP-metoden gjør det mulig for brukere å generere store blandede populasjoner av C. elegans med liten håndtering og manipulering av dyrene, noe som er ideelt for store -omics studier (Figur 1). Når en LSCP har blitt full av voksne ormer, nådd en stor befolkningsstørrelse og har minimale bakterier igjen, kan brukerne høste og estimere befolkningsstørrelsen. Dette punktet kan også fungere som en kvalitetskontroll ved å vurdere om populasjonen er tilstrekkelig til å brukes i en -omics-rørledning (figur 2). Populasjonsdynamikken er avhengig av belastningen selv, oppførselen til stammen (dvs.gravestammer som har en tendens til å ha lavere ormgjenoppretting) og vekstsuksess (dvs., forurensning). LSCP-metoden ble testet på 15 stammer av C. elegans som inneholder en blanding av Caenorhabditis Genetics Center (CGC) mutanter og Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) wild stammer25. Stammegenotyper er beskrevet i Supplerende tabell 3.

LSCP-metoden ga populasjonsstørrelser fra ca. 94 500 til 9 290 000. Gjennomsnittlig populasjonsstørrelse innenfor referansestammen, PD1074, og på tvers av stammer var ca. 2,4 millioner ormer (figur 3). Det ble ikke funnet signifikante forskjeller i estimerte populasjonsstørrelser mellom C. elegans-stammer i løpet av et gjennomsnitt på 12,2 LSCP vekstdager (figur 4). PD1074 LSCPer tok mellom 10 - 14 dager å vokse til en full blandet befolkning. Gjennomsnittlig veksttid på tvers av PD1074 var 10 dager. Den tregeste voksende stammen vokste i maksimalt 20 dager, og den raskest voksende stammen vokste i minst 10 dager (figur 4).

Derfor, ved hjelp av denne LSCP-metoden, kan brukerne enkelt integrere nye interessestammer i en studie med liten kunnskap om utviklingstid og bakgrunnskompetanse. Vær oppmerksom på at stammer og fenotyper som må opprettholdes ved plukking, har fecundity defekter, er heterozygote eller har vekstfeil, kan ikke fungere bra i denne rørledningen.

Stor partikkelstrømcytometri og avbildning av prøver gjør det mulig for brukere å dokumentere populasjonsfordeling. Et bredt utvalg av plattformer kan brukes til å måle vellykket befolkningsvekst.

For reproduserbare -omics målinger er det viktig å vokse konsistente kulturer. Beregningene av kulturreroduserbarhet er antall ormer og en konsekvent størrelsesfordeling for en gitt belastning. Vi viser prøvefordelingen for referansestammen, PD1074 – en variant av den opprinnelige N2 Bristol-stammen, ved hjelp av LPFC23,26 og mikrokonfokale mikroskopbilder som proxyer for vekstsuksess. Etter hvert som ormer ble målt fra L1-fasen til gravid voksen på LPFC-fordelingen (figur 5), etterfølgende avbildning (figur 6) og variasjonen i populasjonsfordelingen på tvers av utvalg (figur 7), kan vi se at denne rørledningen genererte en blandet populasjon av C. elegans.

For å se nærmere på populasjonsfordelingen av våre blandede faseprøver, så vi på fordelingen av 35 PD1074 LSCPer ved å se på prosentandelen ormer som faller innenfor hver region over hele TOF-distribusjonen(dvs.kroppslengde) (figur 7A,B).

Figure 1
Figur 1: Oversikt over rørledningen for LSCP-ormvekst. (A) Når de ble mottatt i laboratoriet, ble alle stammer tilberedt og frosset for langtidslagring ved -80 °C2. (B) En "master chunk" plate ble fremstilt fra en frossen orm lager og lagret ved 15 °C som skal brukes i ikke mer enn en måned. (C) Hver prøve gikk gjennom fire påfølgende deltrinn for å redusere generasjonsstress før de vokste på LSCP. (D) 5 individuelle gravid voksne ble plukket fra "chunk 4" 6 cm plate i Trinn (D) og spot bleket på fem gitte områder av LSCP. (E) LSCP ble plassert i et kontrollert temperaturrom og vokst ved 20 °C til LSCP var full av voksne ormer, nådde en stor befolkningsstørrelse og hadde minimale bakterier igjen. (F) Ormpopulasjonen ble høstet og samlet inn for nedstrømstrinn. (G) Aliquots ble opprettet fra LSCP og ble flash frosset for nedstrøms ønskede applikasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over LSCP-høsting og estimering av populasjonsstørrelse. (A) 50 ml M9 ble brukt til å vaske ormer av NGMA-overflaten. Ormfjæring ble pipettert inn i et 50 ml konisk rør. Trinn (A) ble gjentatt to ganger. (B) 15 ml orm suspensjon ble hellet i et nytt 15 ml konisk rør. Ormer ble pelletert av sentrifugering. M9 + rusk ble aspirert av uten forstyrrende ormpellet. Trinn (B) ble gjentatt til alle 150 ml orm suspensjon ble samlet inn. (C) Ormpellet ble vasket og sentrifugert tre ganger med M9 for å eliminere gjenværende rusk. Når prøven var ren, ble ormepellet resuspendert i 10 ml ddH2O. (D) En seriell fortynning av prøven ble opprettet for å estimere ormpopulasjonsstørrelse. Fortynningsfaktoren(e) som tillot ormer å telles nøyaktig, ble brukt. Fortynningsfaktoren(e) som brukes, ble endret avhengig av populasjonsstørrelsen til LSCP. (E) Når fortynningsfaktoren(e) ble valgt, ble alle ormer fra alle de tre aliquot-replikeringene av fortynningen pipettert på et rent lysbilde, og ormer ble telt under et dissekerende mikroskop. (F) Prøven ble delt inn i passende aliquots. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: LSCP-metode generert i gjennomsnitt en populasjon på 2,4 millioner ormer i blandet stadium. LSCP gir befolkningsstørrelser i den minste befolkningsveksten på rundt 94.500 og med den største befolkningsveksten på rundt 9.290.000. Gjennomsnittlig befolkningsstørrelse på tvers av alle stammer var 2,4 millioner ormer. Stenger under C. elegans stammenavn indikerer om en stamme er en CGC mutant eller CeNDR naturlig isolere. LSCP-prøvestørrelsen vises for hver belastning. Sammenligninger for alle par ved hjelp av Tukeys HSD-test ble utført. Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom estimerte populasjonsstørrelser på tvers av C. elegansstammer (F(14,108) = 0,7, p = 0,77). Fargede stolper angir standard fargeskjermer for respektive C. elegans belastningsrepresentasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: LSCP-metoden genererte store populasjoner av ormer i blandet fase på 10 – 20 dager. En gitt C. elegans LSCP vokste til prøven var full av voksne ormer, nådde en stor befolkningsstørrelse og hadde minimal bakteriell plen igjen. LSCPer tok mellom 10 - 20 dager å vokse til en full blandet befolkning, avhengig av belastningen. Gjennomsnittlig veksttid på tvers av stammene var 12,2 dager. LSCP-prøvestørrelsen vises for hver belastning. Hvert feilfelt ble konstruert ved hjelp av 1 standardavvik fra gjennomsnittet. Nivåer som ikke er forbundet med samme bokstav, er signifikant forskjellige. Sammenligninger for alle par ved hjelp av Tukeys HSD-test. En signifikant forskjell ble funnet i mengden veksttid på LSCP som trengs på tvers av C. elegans stammer (F (14,108) = 8,8, p < 0,0001*). Fargede stolper angir standard fargeskjermer for respektive C. elegans belastningsrepresentasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Blandet populasjons- og vekstmåling av den ville referansestammen, PD1074. En representativ LPFC-distribusjon av en LSCP-vekst av den ville referansestammen, en variant av den opprinnelige N2 Bristol-stammen ( PD1074) dokumenterer størrelsesfordelingen og hendelsestallene til en befolkning i blandet fase. X-aksen viser lengden (Flytid, TOF) på de sorterte ormene. Y-aksen viser den optiske tettheten (optisk utryddelse, EXT) av ormene sortert. Hvert datapunkt er en orm som ble dokumentert i eksemplet. Hvert TOF-område som ble brukt til bildeanalyse, vises i forskjellige farger. Tjue TOF-regioner ble opprettet (R2 - R21) fra en TOF på 50 til 2050. Du finner mer informasjon om hver TOF-region i supplerende tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Bilder av ormer sortert fra TOF-regioner fra R2 – R12 viser PD1074 LPFC-fordelingen. I region R2 kan L1 ormer identifiseres, og i region R9 identifiseres overveiende gravide voksne, som spenner over de to utviklingsmessige larval ekstremene som gir oss omtrentlige regioner innenfor strømningscytometerfordelingen av hvor stadier forventes i fordelingen. Skalastang representerer 1 mm. Representative bilder ble tatt fra LPFC-fordelingen som vises i figur 5, og de fargede boksene tilsvarer områder fra figur 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Befolkningsfordeling på tvers av flytidsregioner (TOF) i den ville referansestammen PD1074. Distribusjon av ormer over hele TOF-området viser områdene der ormer ble funnet. Hver PD1074 LSCP er representert som en individuell farge. (A) X-aksen viser de tjue TOF-områdene (R2 – R21) som er observert og telt for LSCP, og viser hele størrelsesfordelingen. Y-aksen viser prosentandelen ormer fra en gitt LSCP som hadde en kroppsstørrelse som falt inn i et gitt TOF-område. (B) Når en mindre brøkdel av ormepopulasjonen faller mellom R7-R21-regionene, ble loggen over prosentandelen ormer som falt innenfor hvert område, tatt for å vise populasjonsfordelingen. X-aksen viser områdene for R7-R21 TOF. Y-aksen viser loggen over prosentandelen ormer fra en gitt LSCP som hadde en kroppsstørrelse som falt inn i et gitt TOF-område. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Gjennomsnittlig daglig temperatur (°C) på vekstforhold der LSCP ble dyrket og håndtert. Rapporterte temperaturer på rommet kontrollert temperatur (CT) ble dokumentert og samlet inn i løpet av seks måneders periode med prøvevekst og innsamling. Den gjennomsnittlige daglige temperaturen rapporteres her. Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom temperaturen der LCSP vokste i løpet av prosjektets varighet (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Hele temperaturforskjellen strakte seg ikke over 0,003 °C gjennom hele seksmånedersvarigheten for prøvevekst og -generering. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende tabell 1: TOF-inngjerdede områder som brukes til å sortere ormer i 384-brønnsplater for avbildning. Binned regioner ble opprettet for å spenne over en TOF på 100 på tvers av hele TOF-distribusjonen fra 50 til 2050. Inngjerdede områder kan endres og optimaliseres for å passe dine behov. Hvert TOF-område som ble brukt til bildeanalyse, vises i forskjellige farger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: 384-brønns platemal av TOF-regioner og replikeringsoppsett. Hver prøve ble sortert i en 384-brønns plate for avbildning. Fire replikeringer ble opprettet for hvert område som ble valgt for sortering. Inngjerdede områder kan endres og optimaliseres for å passe dine behov. Se Supplerende tabell 1 for bestemte inngjerdede områder som er opprettet og brukt i denne protokollen. Hvert TOF-område som ble brukt til bildeanalyse, vises i forskjellige farger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 3: C. elegans stammer som brukes i denne protokollen inneholder en blanding av CGC- og CeNDR-stammer. Belastningen, genotypen, strekkkilden og detaljene er beskrevet i denne tabellen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

En rekke fartøy kan brukes som LSCP. I denne protokollen ble det brukt en standard glassbakefat. LSPCene i bruk hadde ytre dimensjoner på 35,56 x 20,32 cm, indre dimensjoner på 27,94 x 17,78 cm, og ca. 4,45 cm dype og kom med et montert lokk. Dermed har mengden bakterier som brukes her blitt optimalisert for en LSCP med de ovennevnte dimensjonene for å gi en stor populasjon av blandede ormer. Bakterievolum og konsentrasjon kan justeres for å passe til de eksperimentelle behovene.

Forurensning ved mugg, sopp eller andre bakterielle kilder kan forekomme når som helst i LSCP-metoden, så håndter prøver med forsiktighet. Før du starter et trinn i protokollen, må du sørge for at arbeidsområdet rengjøres med 70% etanol og 10% blekemiddel. Hvis tilgjengelig, behandle brukte områder med UV-lys i 30 min og slå på et HEPA-luftfilter 30 min før du starter hvert trinn.

Ved å dyrke LSCP i kontrollerte omgivelser ( dvs. i etCT-romsatt til 20 °C), kan brukeren lettere spore veksten av prøven og dokumentere potensiell forurensning. Hvis overflaten på LSCP blir forurenset, må du enten kutte ut forurensningen når det er mulig og la prøven fortsette å vokse eller kaste prøven hvis forurensningen ikke er mulig å kontrollere. Det er viktig å håndtere forurensning raskt for å redusere uønsket vekst og for å sikre at det ikke er utkonkurrerende ormer for ressurser.

Denne metoden er ment for de som ønsker å vokse store blandede befolkningskulturer av C. elegans. Selv om det kan være mulig å vokse synkroniserte populasjoner av ormer på LSCP som gjort på kommersielt tilgjengelige Petri-retter og i flytende kultur, har forfatterne ikke testet dette alternativet. I tillegg, hvis brukere ønsker å vokse mer enn ca 2,4 millioner ormer i gjennomsnitt i et gitt utvalg, anbefales en annen metode4. Vekstsuksess er avhengig av belastningen som behandles i rørledningen. Forfatterne var i stand til å lykkes med å vokse populasjoner på ca 2,4 millioner ormer i minst fem biologiske replikeringer av 15 C. elegans stammer, noe som indikerer at metoden er robust.

Før du starter eksperimentet, vær oppmerksom på at alderen og helsen til en gitt orm kan påvirke fecundity og påfølgende befolkningsveksttid. Sørg for at ormer opprettholdes under sunne forhold med minimalt stress før de brukes i denne rørledningen. Det antas at lagerprøver er opprettet, frosset og holdt ved -80 °C for å redusere genetisk drift over tid.

Avhengig av behovene til et gitt eksperiment, kan antall startende gravide voksne på en LSCP endres. Endring av antall startende gravid voksne på LSCP vil endre vekstraten og dermed tid til å høste. Fem gravide voksne brukes til å så hver LSCP av følgende grunner: (1) En enkel, rask og effektiv måte å så mange C. elegans stammer på LSCPs på en gang var nødvendig og (2) å redusere aldersforskjellene blant de voksne plukket som kunne føre til vekst heterogenitet.

Denne metoden lar brukeren høste store populasjoner av ormer med alle livssyklusstadier til stede. Med dagens metoder tilgjengelig, krever innsamling av store prøver av C. elegans blekemiddelsynkronisering for å oppnå antall ormer som ønskes for nedstrømsarbeid. Gitt denne tilnærmingen kan man nå vokse så mange ormer som tidligere mulig i gjærere eller store flytende kulturer uten vanskeligheter forbundet med blekemiddelsynkronisering og flere håndteringstrinn. Vår protokoll gjør det mulig for en å målrette interessestammer effektivt, bruke minimal håndteringstid i å utvide selve prøven og isolere stadier av ormer eller befolkningen etter behov i nedstrøms rørledninger.

En LPFC ble brukt som et verktøy for å dokumentere populasjonsfordelingen og størrelsen i en gitt LSCP. LPFC som brukes er et kontinuerlig strømningssystem som analyserer, sorterer og dispenserer ormer basert på deres størrelse (TOF) og optisk tetthet. Når en gitt orm passerer gjennom strømningscellen, fanger den aksiale lystapdetektoren mengden signallys blokkert av en 488 nm-solid state laser i den tiden det tar en orm å passere gjennom, noe som gir brukeren TOF og optisk tetthet av ormen. Fluorescensoppsamlingsoptikk og detektorer kan også brukes til å maksimere fluorescensfølsomhet og innsamling på hver prøve. LPFC-samlingsparametere vil variere avhengig av instrument. Brukere kan bruke en rekke plattformer for å fange ormstørrelse og er ikke begrenset til å bruke denne protokollen hvis en LPFC ikke er tilgjengelig.

Forfatterne bruker prøver dyrket i metoden beskrevet her for å identifisere ukjente metabolitter i ulike stammer av C. elegans via Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, NMR spektroskopi og RNA sekvensering. Forfatterne planlegger å fortsette å bruke denne metoden for vekst av prøver i denne rørledningen med en rekke C. elegans stammer som nye stammer av interesse kan enkelt behandles ved hjelp av denne rørledningen.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Edison Lab for nyttige diskusjoner og tilbakemeldinger på dette manuskriptet; spesielt, B.M. Garcia. Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), og CeNDR, som er finansiert av NSF Living Collections CSBR 1930382. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (U2CES030167).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Sterile Serological Pipettes VWR 89130-898
10 ul pipette tips VWR 89079-438
100 ul pipette tips VWR 89079-442
1000 mL Graduated Cylinder VWR 10124-380
1000 ul pipette tips VWR 89079-488
15 mL conical tubes VWR 89039-668
190 Proof Ethanol VWR 89125-166
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask VWR 75804-654
50 mL conical tubes VWR 75874-294
Agar Sigma 05040-100G
Agarose Sigma A9539-500G
BVC Control G Fluid Aspiration System Vacuubrand
Calcium Chloride Sigma 449709-10G
Cholesterol Sigma C3045-25G
Clorox Bleach VWR 89414-502
Conviron Control Temperature Room Conviron https://www.conviron.com/environmental-rooms
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate VWR 89089-866
Fisher Scientific Accuspin 3R Fisher
Flat-Bottom 24-Well Plate VWR 29443-952
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. Home Depot 204390560
HT115 E. coli (DE3) CGC HT115(DE3) https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)
Kimwipes VWR 470224-038
Large Scale Culture Plate (LSCP) Pyrex 1090948 Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid
Magnesium Sulfate Sigma C86677-25G
MgSO4 VWR 97062-998
Microscope Plain Slides VWR 16004-422
Millipore Filter Millipore 1.11727.2500
Molecular Devices ImageXpress Molecular Devices Model Number:IXMConfocal https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532
Nystatin (10mg/mL) Sigma N6261-25MU
Peptone Sigma P7750-100G
Petri Dishes (6 cm) VWR 25384-092
Pipette Controller VWR 613-4180
Potassium Chloride Fisher P217-3
Potassium Phosphate Monobasic VWR 0781-500G
Potasssium Hydroxide Fisher P250-500
Red Fluroscent Microspheres Polysciences 19507-5
Sodium Chloride Sigma 746398-500G
Sodium Hydroxide Fisher 111357
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher BP332-500
Standard Gilson Pipette Set Gilson FA10002M, FA10004M, FA10006M
Streptomycin (100mg/mL) Sigma S6501-25G
Union Biometrica COPAS BioSorter Union Biometrica https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Félix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Current Biology. 20, (22), 965-969 (2010).
  2. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. 1-31 (2015).
  3. Brenner, S. The genetics of behaviour. British Medical Bulletin. 29, (3), 269-271 (1973).
  4. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/ (2006).
  5. Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment. Scientific Reports. 7, (1), 9839 (2017).
  6. Loer, C. M., et al. Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4). Genetics. 200, (1), 237-253 (2015).
  7. Li, Y., Paik, Y. K. A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans. BMB Reports. 44, (4), 285-290 (2011).
  8. Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 21, (10), 1648-1661 (2010).
  9. Fritz, J. A., Behm, C. A. CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity. PloS One. 4, (4), 5117 (2009).
  10. Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218, (4572), 578-580 (1982).
  11. Jeong, P. Y., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433, (7025), 541-545 (2005).
  12. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454, (7208), 1115-1118 (2008).
  13. Kaplan, F., et al. Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage. PLoS One. 6, (3), 17804 (2011).
  14. Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218, (4572), 578-580 (1982).
  15. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19, (1), 562 (2018).
  16. Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology. PLoS Genetics. 10, (2), 1004156 (2014).
  17. Rosenblatt, M. A central limit theorem and a strong mixing condition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 42, (1), 43-47 (1956).
  18. Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology. Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).
  19. Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6, (7), 1923-1933 (2016).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2020).
  21. Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37, (5), 544-548 (2005).
  22. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8, (1), 1-7 (2003).
  23. Kevin, S., Pulak, R. Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System. C. elegans. Methods in Molecular Biology. Strange, K. 351, Humana Press. 275-286 (2006).
  24. Lee, D., et al. Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response. Nature Ecology & Evolution. 3, (10), 1455-1463 (2019).
  25. Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).
  26. Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6, (7), 1923-1933 (2016).
Kultur og analyse av storskala blandet-stage <em>Caenorhabditis elegans</em> populasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaver, A. O., Gouveia, G. J., Kirby, P. S., Andersen, E. C., Edison, A. S. Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations. J. Vis. Exp. (171), e61453, doi:10.3791/61453 (2021).More

Shaver, A. O., Gouveia, G. J., Kirby, P. S., Andersen, E. C., Edison, A. S. Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations. J. Vis. Exp. (171), e61453, doi:10.3791/61453 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter