For å bruke Caenorhabditis elegans (C. elegans) i omics forskning, er det nødvendig med en metode for å generere store populasjoner av ormer der en enkelt prøve kan måles på tvers av plattformer for komparative analyser. Her presenteres en metode for kultur C. eleganspopulasjoner på store kulturplater (LSCPer) og for å dokumentere befolkningsvekst.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) har vært og forblir en verdifull modellorganisme for å studere utviklingsbiologi, aldring, nevrobiologi og genetikk. Den store kroppen av arbeid på C. elegans gjør det til en ideell kandidat til å integrere seg i storbefolkningsstudier av hele dyr for å dissekere de komplekse biologiske komponentene og deres forhold til en annen organisme. For å kunne bruke C. elegans i samarbeidende omics forskning, er det nødvendig med en metode for å generere store populasjoner av dyr der en enkelt prøve kan deles og analyseres på tvers av forskjellige plattformer for komparative analyser.
Her presenteres en metode for kultur og innsamling av en rikelig blandet fase C. elegans befolkning på en storstilt kulturplate (LSCP) og påfølgende fenotypiske data. Denne rørledningen gir tilstrekkelig antall dyr til å samle inn fenotypiske data og populasjonsdata, sammen med data som trengs for -omics-eksperimenter (dvs. genomikk, transkripsjonomikk, proteomikk og metabolomikk). I tillegg krever LSCP-metoden minimal manipulering til dyrene selv, mindre brukerforberedelsestid, gir tett miljøkontroll og sikrer at håndteringen av hver prøve er konsistent gjennom hele studien for generell reproduserbarhet. Til slutt presenteres metoder for å dokumentere befolkningsstørrelse og befolkningsfordeling av C. elegans livsstadier i en gitt LSCP.
C. elegans er en liten frittlevende nematode som finnes over hele verden i en rekke naturlige habitater1. Dens relative enkel vekst, rask generasjonstid, reproduksjonssystem og gjennomsiktig kropp gjør det til en kraftig modellorganisme som har blitt studert mye i utviklingsbiologi, aldring, nevrobiologi og genetikk2,3. Det omfattende arbeidet med C. elegans gjør det til en ypperlig kandidat å bruke i -omics studier for å fullstendig koble fenotyper med komplekse biologiske komponenter og deres relasjoner i en gitt organisme.
For å bruke C. elegans i samarbeidsforskning er det nødvendig med en metode for å generere store blandede populasjoner av dyr der en enkelt prøve kan deles og brukes på tvers av forskjellige plattformer og instrumenter for komparative analyser. Å lage en rørledning for å generere et slikt utvalg krever stor bevissthet om kosthold, miljø, stress, befolkningsstruktur og prøvehåndtering og innsamling. Derfor er det avgjørende å ha standard og reproduserbare kultiveringsforhold integrert i store rørledninger. I C. elegans forskning brukes to tradisjonelle metoder til kultur ormer – agar Petri retter og flytende kultur4.
Historisk, når store mengder C. elegans er nødvendig, vokser de i flytende kultur4. Trinnene som er involvert i å generere en stor populasjon av ormer i flytende kultur krever flere håndteringstrinn som ofte inkluderer blekemiddelsynkronisering for å briste gravide voksne kutikkler, og frigjør embryoer for å oppnå ønsket befolkningsstørrelse. Men når blekemiddelsynkronisering brukes, er befolkningsveksten avhengig av start på tellingsstørrelse og påvirker derfor etterfølgende vekst og befolkningstall. I tillegg varierer C. elegans stammer i deres kutikale følsomhet, eksponeringstid og stressrespons på blekemiddelsynkronisering, noe som gjør det vanskelig å analyse mange stammer om gangen5,6,7,8,9.
I tillegg krever ormvekst i flytende kultur et par overføringstrinn, da det ofte anbefales å vokse bare en generasjon ormer før høsting fordi overbefolkning lett kan oppstå hvis de vokser i flere generasjoner og fører til dauerformasjon til tross for tilstedeværelsen av mat10. Dauerformasjon skjer gjennom små signalmolekyler som askarosider, ofte referert til som “dauer feromoner”11,12,13,14, frigjøres i flytende medier og påvirker veksten av befolkningen. Videre fører voksende store ormpopulasjoner i flytende kultur til overflødig bakterieakkumulering i kulturen, noe som skaper vanskeligheter når en ren prøve er nødvendig for nedstrøms fenotypiske analyser. Til slutt, når en flytende kultur blir forurenset, er det vanskeligere å opprettholde som soppsporer eller bakterieceller spres lett gjennom media15.
Den andre tradisjonelle metoden for å dyrke C. elegans er på agar Petri retter. Kommersielt tilgjengelige Petri-retter gjør det enkelt å dyrke flere generasjoner av blandede ormer uten de raske effektene av overbefolkning og høy dauerformasjon sett i flytende kulturer. Imidlertid er en ulempe med ormvekst på tradisjonelle agar Petri-retter at den største kommersielt tilgjengelige Petri-parabolen ikke gir store ormpopulasjoner for en -omics studie uten å legge til et blekemiddelsynkroniseringstrinn. Oppsummert er kultivering av blandede populasjoner av C. elegans på agar Petri-retter mer egnet for innsamling av -omics data, men vi krevde en metode for å generere svært store befolkningsstørrelser uten flytende kulturing.
Her presenterer vi en metode for kultur og samler store C. eleganspopulasjoner i blandet fase på storskala kulturplater (LSCP). Innsamling av prøver gjennom denne rørledningen gir nok utvalg til å samle inn fenotypiske data og populasjonsdata, sammen med data som trengs for -omics-eksperimenter (dvs.genomikk, transkripsjon, proteomikk og metabolomikk). I tillegg krever LSCP-metoden minimal manipulering av dyrene, mindre brukerforberedelsestid, gir tett miljøkontroll og sikrer at håndteringen av hver prøve er konsistent gjennom hele studien for generell reproduserbarhet.
En rekke fartøy kan brukes som LSCP. I denne protokollen ble det brukt en standard glassbakefat. LSPCene i bruk hadde ytre dimensjoner på 35,56 x 20,32 cm, indre dimensjoner på 27,94 x 17,78 cm, og ca. 4,45 cm dype og kom med et montert lokk. Dermed har mengden bakterier som brukes her blitt optimalisert for en LSCP med de ovennevnte dimensjonene for å gi en stor populasjon av blandede ormer. Bakterievolum og konsentrasjon kan justeres for å passe til de eksperimentelle behovene.
Forurensning ved mugg, sopp eller andre bakterielle kilder kan forekomme når som helst i LSCP-metoden, så håndter prøver med forsiktighet. Før du starter et trinn i protokollen, må du sørge for at arbeidsområdet rengjøres med 70% etanol og 10% blekemiddel. Hvis tilgjengelig, behandle brukte områder med UV-lys i 30 min og slå på et HEPA-luftfilter 30 min før du starter hvert trinn.
Ved å dyrke LSCP i kontrollerte omgivelser ( dvs. i etCT-romsatt til 20 °C), kan brukeren lettere spore veksten av prøven og dokumentere potensiell forurensning. Hvis overflaten på LSCP blir forurenset, må du enten kutte ut forurensningen når det er mulig og la prøven fortsette å vokse eller kaste prøven hvis forurensningen ikke er mulig å kontrollere. Det er viktig å håndtere forurensning raskt for å redusere uønsket vekst og for å sikre at det ikke er utkonkurrerende ormer for ressurser.
Denne metoden er ment for de som ønsker å vokse store blandede befolkningskulturer av C. elegans. Selv om det kan være mulig å vokse synkroniserte populasjoner av ormer på LSCP som gjort på kommersielt tilgjengelige Petri-retter og i flytende kultur, har forfatterne ikke testet dette alternativet. I tillegg, hvis brukere ønsker å vokse mer enn ca 2,4 millioner ormer i gjennomsnitt i et gitt utvalg, anbefales en annen metode4. Vekstsuksess er avhengig av belastningen som behandles i rørledningen. Forfatterne var i stand til å lykkes med å vokse populasjoner på ca 2,4 millioner ormer i minst fem biologiske replikeringer av 15 C. elegans stammer, noe som indikerer at metoden er robust.
Før du starter eksperimentet, vær oppmerksom på at alderen og helsen til en gitt orm kan påvirke fecundity og påfølgende befolkningsveksttid. Sørg for at ormer opprettholdes under sunne forhold med minimalt stress før de brukes i denne rørledningen. Det antas at lagerprøver er opprettet, frosset og holdt ved -80 °C for å redusere genetisk drift over tid.
Avhengig av behovene til et gitt eksperiment, kan antall startende gravide voksne på en LSCP endres. Endring av antall startende gravid voksne på LSCP vil endre vekstraten og dermed tid til å høste. Fem gravide voksne brukes til å så hver LSCP av følgende grunner: (1) En enkel, rask og effektiv måte å så mange C. elegans stammer på LSCPs på en gang var nødvendig og (2) å redusere aldersforskjellene blant de voksne plukket som kunne føre til vekst heterogenitet.
Denne metoden lar brukeren høste store populasjoner av ormer med alle livssyklusstadier til stede. Med dagens metoder tilgjengelig, krever innsamling av store prøver av C. elegans blekemiddelsynkronisering for å oppnå antall ormer som ønskes for nedstrømsarbeid. Gitt denne tilnærmingen kan man nå vokse så mange ormer som tidligere mulig i gjærere eller store flytende kulturer uten vanskeligheter forbundet med blekemiddelsynkronisering og flere håndteringstrinn. Vår protokoll gjør det mulig for en å målrette interessestammer effektivt, bruke minimal håndteringstid i å utvide selve prøven og isolere stadier av ormer eller befolkningen etter behov i nedstrøms rørledninger.
En LPFC ble brukt som et verktøy for å dokumentere populasjonsfordelingen og størrelsen i en gitt LSCP. LPFC som brukes er et kontinuerlig strømningssystem som analyserer, sorterer og dispenserer ormer basert på deres størrelse (TOF) og optisk tetthet. Når en gitt orm passerer gjennom strømningscellen, fanger den aksiale lystapdetektoren mengden signallys blokkert av en 488 nm-solid state laser i den tiden det tar en orm å passere gjennom, noe som gir brukeren TOF og optisk tetthet av ormen. Fluorescensoppsamlingsoptikk og detektorer kan også brukes til å maksimere fluorescensfølsomhet og innsamling på hver prøve. LPFC-samlingsparametere vil variere avhengig av instrument. Brukere kan bruke en rekke plattformer for å fange ormstørrelse og er ikke begrenset til å bruke denne protokollen hvis en LPFC ikke er tilgjengelig.
Forfatterne bruker prøver dyrket i metoden beskrevet her for å identifisere ukjente metabolitter i ulike stammer av C. elegans via Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, NMR spektroskopi og RNA sekvensering. Forfatterne planlegger å fortsette å bruke denne metoden for vekst av prøver i denne rørledningen med en rekke C. elegans stammer som nye stammer av interesse kan enkelt behandles ved hjelp av denne rørledningen.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer av Edison Lab for nyttige diskusjoner og tilbakemeldinger på dette manuskriptet; spesielt, B.M. Garcia. Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), og CeNDR, som er finansiert av NSF Living Collections CSBR 1930382. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (U2CES030167).
10 mL Sterile Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
10 ul pipette tips | VWR | 89079-438 | |
100 ul pipette tips | VWR | 89079-442 | |
1000 mL Graduated Cylinder | VWR | 10124-380 | |
1000 ul pipette tips | VWR | 89079-488 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-668 | |
190 Proof Ethanol | VWR | 89125-166 | |
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask | VWR | 75804-654 | |
50 mL conical tubes | VWR | 75874-294 | |
Agar | Sigma | 05040-100G | |
Agarose | Sigma | A9539-500G | |
BVC Control G Fluid Aspiration System | Vacuubrand | ||
Calcium Chloride | Sigma | 449709-10G | |
Cholesterol | Sigma | C3045-25G | |
Clorox Bleach | VWR | 89414-502 | |
Conviron Control Temperature Room | Conviron | https://www.conviron.com/environmental-rooms | |
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate | VWR | 89089-866 | |
Fisher Scientific Accuspin 3R | Fisher | ||
Flat-Bottom 24-Well Plate | VWR | 29443-952 | |
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. | Home Depot | 204390560 | |
HT115 E. coli (DE3) | CGC | HT115(DE3) | https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3) |
Kimwipes | VWR | 470224-038 | |
Large Scale Culture Plate (LSCP) | Pyrex | 1090948 | Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid |
Magnesium Sulfate | Sigma | C86677-25G | |
MgSO4 | VWR | 97062-998 | |
Microscope Plain Slides | VWR | 16004-422 | |
Millipore Filter | Millipore | 1.11727.2500 | |
Molecular Devices ImageXpress | Molecular Devices | Model Number:IXMConfocal | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532 |
Nystatin (10mg/mL) | Sigma | N6261-25MU | |
Peptone | Sigma | P7750-100G | |
Petri Dishes (6 cm) | VWR | 25384-092 | |
Pipette Controller | VWR | 613-4180 | |
Potassium Chloride | Fisher | P217-3 | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR | 0781-500G | |
Potasssium Hydroxide | Fisher | P250-500 | |
Red Fluroscent Microspheres | Polysciences | 19507-5 | |
Sodium Chloride | Sigma | 746398-500G | |
Sodium Hydroxide | Fisher | 111357 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher | BP332-500 | |
Standard Gilson Pipette Set | Gilson | FA10002M, FA10004M, FA10006M | |
Streptomycin (100mg/mL) | Sigma | S6501-25G | |
Union Biometrica COPAS BioSorter | Union Biometrica | https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3. |