För att använda Caenorhabditis elegans (C. elegans) i omikforskning behövs en metod för att generera stora populationer av maskar där ett enda prov kan mätas över plattformar för jämförande analyser. Här presenteras en metod för att odla C. eleganspopulationer på storskaliga kulturplattor (LSCPs) och för att dokumentera befolkningstillväxten.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) har varit och förblir en värdefull modellorganism för att studera utvecklingsbiologi, åldrande, neurobiologi och genetik. Det stora arbetet med C. elegans gör det till en idealisk kandidat att integreras i stora, hela djurstudier för att dissekera de komplexa biologiska komponenterna och deras relationer med en annan organism. För att kunna använda C. elegans i kollaborativ omikforskning behövs en metod för att generera stora populationer av djur där ett enda prov kan delas upp och analyseras över olika plattformar för jämförande analyser.
Här presenteras en metod för att odla och samla in en riklig C. eleganspopulation i blandat stadium på en storskalig odlingsplatta (LSCP) och efterföljande fenotypiska data. Denna rörledning ger tillräckligt många djur för att samla in fenotypiska data och befolkningsdata, tillsammans med alla data som behövs för -omics experiment (dvs. genomik, transkriptomik, proteomik och metabolomik). Dessutom kräver LSCP-metoden minimal manipulering till djuren själva, mindre användarberedningstid, ger noggrann miljökontroll och säkerställer att hanteringen av varje prov är konsekvent under hela studien för övergripande reproducerbarhet. Slutligen presenteras metoder för att dokumentera befolkningsstorlek och befolkningsfördelning av C. elegans livsstadier i en viss LSCP.
C. elegans är en liten fri levande nematod som finns över hela världen i en mängd olika naturliga livsmiljöer1. Dess relativa lätthet att växa, snabb generationstid, reproduktionssystem och transparent kropp gör det till en kraftfull modellorganism som har studerats i stor utsträckning i utvecklingsbiologi, åldrande, neurobiologi och genetik2,3. Det kopiösa arbetet med C. elegans gör det till en huvudkandidat att använda i -omics studier för att på ett omfattande sätt koppla fenotyper med komplexa biologiska komponenter och deras relationer i en viss organism.
För att använda C. elegans i kollaborativ omikforskning behövs en metod för att generera stora populationer av djur i blandat stadium där ett enda prov kan delas upp och användas över olika plattformar och instrument för jämförande analyser. Att skapa en pipeline för att generera ett sådant prov kräver stor medvetenhet om kost, miljö, stress, befolkningsstruktur och provhantering och insamling. Därför är det viktigt att standard- och reproducerbara odlingsförhållanden integreras i storskaliga rörledningar. I C. elegans forskning används två traditionella metoder för att odla maskar – agar Petri rätter och flytande kultur4.
Historiskt sett, när stora mängder C. elegans behövs, odlas de i flytande kultur4. Stegen som är involverade i att generera en stor population av maskar i flytande kultur kräver flera hanteringssteg som ofta inkluderar blekmedelssynkronisering för att spränga gravida vuxna nagelband och släppa embryon för att uppnå önskad populationsstorlek. Men när blekmedelssynkronisering används är befolkningstillväxten beroende av att folkräkningsstorleken börjar och påverkar därför efterföljande tillväxt och befolkningsantal. Dessutom varierar C. elegans-stammarna i nagelbandskänsligheten, exponeringstiden och stressresponsen på blekmedelssynkroniseringen, vilket gör det svårt att analysera många stammar åt gången5,6,7,8,9.
Dessutom kräver masktillväxt i flytande kultur ett par överföringssteg eftersom det ofta rekommenderas att växa bara en generation maskar före skörd eftersom överbeläggning lätt kan uppstå om den odlas i flera generationer och leda till dauerbildning trots närvaron av mat10. Dauer-formation sker genom små signalmolekyler som askarosides, ofta kallade “dauer feromoner”11,12,13,14, släpps ut i flytande medier och påverkar befolkningens tillväxt. Dessutom leder växande stora maskpopulationer i flytande kultur till överskott av bakterieackumulering i kulturen, vilket skapar svårigheter när ett rent prov behövs för fenotypiska analyser nedströms. Slutligen, när en flytande kultur blir förorenad, är det svårare att upprätthålla eftersom svampsporer eller bakterieceller lätt sprids i hela media15.
Den andra traditionella metoden att odla C. elegans är på agar Petri rätter. Kommersiellt tillgängliga Petri-rätter gör det möjligt för man att enkelt odla flera generationer av maskar i blandade steg utan de snabba effekterna av överbeläggning och hög dauerbildning som ses i flytande kulturer. En nackdel med masktillväxt på traditionella agar Petri-rätter är dock att den största kommersiellt tillgängliga Petri-skålen inte ger stora maskpopulationer för en -omics-studie utan att lägga till i ett blekmedelssynkroniseringssteg. Sammanfattningsvis är odling av blandade populationer av C. elegans på agar Petri-rätter mer lämplig för att samla in -omics-data, men vi behövde en metod för att generera mycket stora befolkningsstorlekar utan flytande odling.
Här presenterar vi en metod för kultur och samlar stora C. eleganspopulationer i blandat stadium på storskaliga odlingsplattor (LSCP). Insamling av prover genom denna pipeline ger tillräckligt med prov för att samla in fenotypiska data och befolkningsdata, tillsammans med data som behövs för -omics experiment(dvs.genomik, transkriptomik, proteomik och metabolomik). Dessutom kräver LSCP-metoden minimal manipulering av djuren, mindre förberedelsetid för användare, ger noggrann miljökontroll och säkerställer att hanteringen av varje prov är konsekvent under hela studien för övergripande reproducerbarhet.
En mängd olika fartyg kan användas som LSCP. I detta protokoll användes en vanlig glasbakform. LSPC:erna som används hade yttermått på 35,56 x 20,32 cm, innermått på 27,94 x 17,78 cm och cirka 4,45 cm djupa och kom med ett monterat lock. Således har mängden bakterier som används här optimerats för en LSCP med ovanstående dimensioner för att ge en stor population av maskar i blandat stadium. Bakterievolym och koncentration kan justeras för att passa de experimentella behoven.
Kontaminering genom mögel, svampar eller andra bakteriekällor kan uppstå i vilket steg som helst i LSCP-metoden, så hantera prover med försiktighet. Innan du påbörjar något steg i protokollet, se till att arbetsutrymmet rengörs med 70% etanol och 10% blekmedel. Om tillgängligt, behandla använda områden med UV-ljus i 30 min och slå på ett HEPA-luftfilter 30 minuter innan du startar varje steg.
Genom att odla LSCP i en kontrollerad miljö(dvs. i ett CT-rumvid 20 °C) kan användaren lättare spåra tillväxten av provet och dokumentera potentiell kontaminering. Om LSCP:s yta blir kontaminerad, antingen skära ut kontamineringen när det är möjligt och låt provet fortsätta att växa eller kassera provet om föroreningen inte är möjlig att kontrollera. Det är absolut nödvändigt att snabbt ta itu med kontaminering för att minska oönskad tillväxt och se till att den inte konkurrerar ut maskar för resurser.
Denna metod är avsedd för dem som vill odla storskaliga kulturer med blandad befolkning av C. elegans. Även om det kan vara möjligt att odla synkroniserade populationer av maskar på LSCP som gjorts på kommersiellt tillgängliga Petri-rätter och i flytande kultur, har författarna inte testat detta alternativ. Dessutom, om användare vill växa mer än cirka 2,4 miljoner maskar i genomsnitt i ett visst prov, rekommenderas en annan metod4. Tillväxtframgången är beroende av den påfrestning som bearbetas i pipelinen. Författarna kunde framgångsrikt växa populationer av cirka 2,4 miljoner maskar i minst fem biologiska replikat av 15 C. elegans stammar, vilket indikerar att metoden är robust.
Innan experimentet påbörjas bör du notera att åldern och hälsan hos en viss mask kan påverka fecundity och efterföljande befolkningstillväxttid. Se till att maskar hålls under hälsosamma förhållanden med minimal stress innan de används i denna pipeline. Det antas att lagerprover har skapats, frysts och hållits vid -80 °C för att minska genetisk drift över tid.
Beroende på behoven hos ett visst experiment kan antalet startande gravida vuxna på en LSCP ändras. Att ändra antalet startelvan vuxna på LSCP kommer att förändra tillväxttakten och därmed tiden att skörda. Fem gravida vuxna används för att så varje LSCP av följande skäl: (1) Ett enkelt, snabbt och effektivt sätt att så många C. elegans stammar på LSCPs på en gång behövdes och (2) för att minska åldersskillnaderna mellan de gravida vuxna plockas som kan leda till tillväxt heterogenitet.
Denna metod gör det möjligt för användaren att skörda stora populationer av maskar med alla livscykelstadier närvarande. Med nuvarande metoder tillgängliga kräver insamling av storskaliga prover av C. elegans blekmedelssynkronisering för att få det antal maskar som önskas för nedströmsarbete. Med tanke på detta tillvägagångssätt kan man nu odla så många maskar som tidigare möjligt i fermentorer eller storskaliga flytande kulturer utan svårigheter i samband med blekmedelssynkronisering och flera hanteringssteg. Vårt protokoll gör det möjligt att rikta in sig på stammar av intresse effektivt, använda minimal hanteringstid för att odla själva provet och isolera stadier av maskar eller befolkningen efter behov i nedströmsledningar.
En LPFC användes som ett verktyg för att dokumentera befolkningsfördelningen och storleken i en viss LSCP. LPFC som används är ett kontinuerligt flödessystem som analyserar, sorterar och dispenserar maskar baserat på deras storlek (TOF) och optisk densitet. När en given mask passerar genom flödescellen fångar den axiella ljusförlustdetektorn mängden signalljus som blockeras av en 488 nm-solid state-laser under den tid det tar en mask att passera igenom, vilket ger användaren TOF och maskens optiska densitet. Fluorescens insamlingsoptik och detektorer kan också användas för att maximera fluorescenskänsligheten och insamlingen på varje prov. LPFC-insamlingsparametrarna varierar beroende på instrument. Användare kan använda en mängd olika plattformar för att fånga maskstorlek och är inte begränsade till att använda det här protokollet om en LPFC inte är tillgänglig.
Författarna använder prover som odlas i den metod som beskrivs här för att identifiera okända metaboliter i olika stammar av C. elegans via flytande kromatografi – Masspektrometri, NMR-spektroskopi och RNA-sekvensering. Författarna planerar att fortsätta att använda denna metod för tillväxt av prover i denna pipeline med en mängd olika C. elegans stammar som nya stammar av intresse kan enkelt bearbetas med denna pipeline.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar i Edison Lab för hjälpsamma diskussioner och feedback om detta manuskript; I synnerhet B.M. Garcia. Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) och CeNDR, som finansieras av NSF Living Collections CSBR 1930382. Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (U2CES030167).
10 mL Sterile Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
10 ul pipette tips | VWR | 89079-438 | |
100 ul pipette tips | VWR | 89079-442 | |
1000 mL Graduated Cylinder | VWR | 10124-380 | |
1000 ul pipette tips | VWR | 89079-488 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-668 | |
190 Proof Ethanol | VWR | 89125-166 | |
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask | VWR | 75804-654 | |
50 mL conical tubes | VWR | 75874-294 | |
Agar | Sigma | 05040-100G | |
Agarose | Sigma | A9539-500G | |
BVC Control G Fluid Aspiration System | Vacuubrand | ||
Calcium Chloride | Sigma | 449709-10G | |
Cholesterol | Sigma | C3045-25G | |
Clorox Bleach | VWR | 89414-502 | |
Conviron Control Temperature Room | Conviron | https://www.conviron.com/environmental-rooms | |
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate | VWR | 89089-866 | |
Fisher Scientific Accuspin 3R | Fisher | ||
Flat-Bottom 24-Well Plate | VWR | 29443-952 | |
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. | Home Depot | 204390560 | |
HT115 E. coli (DE3) | CGC | HT115(DE3) | https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3) |
Kimwipes | VWR | 470224-038 | |
Large Scale Culture Plate (LSCP) | Pyrex | 1090948 | Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid |
Magnesium Sulfate | Sigma | C86677-25G | |
MgSO4 | VWR | 97062-998 | |
Microscope Plain Slides | VWR | 16004-422 | |
Millipore Filter | Millipore | 1.11727.2500 | |
Molecular Devices ImageXpress | Molecular Devices | Model Number:IXMConfocal | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532 |
Nystatin (10mg/mL) | Sigma | N6261-25MU | |
Peptone | Sigma | P7750-100G | |
Petri Dishes (6 cm) | VWR | 25384-092 | |
Pipette Controller | VWR | 613-4180 | |
Potassium Chloride | Fisher | P217-3 | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR | 0781-500G | |
Potasssium Hydroxide | Fisher | P250-500 | |
Red Fluroscent Microspheres | Polysciences | 19507-5 | |
Sodium Chloride | Sigma | 746398-500G | |
Sodium Hydroxide | Fisher | 111357 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher | BP332-500 | |
Standard Gilson Pipette Set | Gilson | FA10002M, FA10004M, FA10006M | |
Streptomycin (100mg/mL) | Sigma | S6501-25G | |
Union Biometrica COPAS BioSorter | Union Biometrica | https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3. |