Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحليل استقلاب الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/61466
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

في هذه الورقة، نحن وصف طريقة لقياس تحلل التحلل والتنفس الميتوكوندريا في الإنسان الرئيسي القاتل الطبيعي (NK) الخلايا المعزولة من الدم المحيطي، في بقية أو بعد تنشيط الناجمة عن IL15. يمكن تمديد البروتوكول الموصوف بسهولة إلى خلايا NK البشرية الأولية التي يتم تنشيطها بواسطة السيتوكينات الأخرى أو المحفزات القابلة للذوبان.

Abstract

الطبيعية القاتل (NK) الخلايا التوسط أساسا الفطرية المضادة للورم والاستجابات المناعية المضادة للفيروسات والاستجابة لمجموعة متنوعة من السيتوكينات وغيرها من المحفزات لتعزيز البقاء على قيد الحياة, انتشار الخلايا, إنتاج السيتوكينات مثل انترفيرون غاما (IFNγ) و / أو برامج السمية الخلوية. NK تفعيل الخلية من قبل تنشيط السيتوكين يتطلب إعادة عرض كبيرة من المسارات الأيضية لدعم متطلباتها الحيوية والإنقاث البيولوجية. هناك مجموعة كبيرة من الأدلة التي تشير إلى أن ضعف استقلاب الخلايا NK يرتبط بعدد من الأمراض المزمنة بما في ذلك السمنة والسرطان، مما يسلط الضوء على الأهمية السريرية لتوافر طريقة لتحديد استقلاب الخلايا NK. هنا نحن وصف استخدام محلل تدفق خارج الخلية، منصة التي تسمح قياسات في الوقت الحقيقي من تحلل واستهلاك الأكسجين الميتوكوندريا، كأداة لرصد التغيرات في استقلاب الطاقة من الخلايا NK الإنسان. الطريقة المذكورة هنا يسمح أيضا لرصد التغيرات الأيضية بعد تحفيز الخلايا NK مع السيتوكينات مثل IL-15، وهو النظام الذي يجري حاليا التحقيق في مجموعة واسعة من التجارب السريرية.

Introduction

خلايا "القاتل الطبيعي" (NK) هي الخلايا اللمفاوية الفطرية التي تتوسط الاستجابات المضادة للورم والفيروسات. تشكل خلايا NK 5-15٪ من جميع الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي البشري، ويمكن العثور عليها أيضًا في الطحال والكبد ونخاع العظام والعقد الليمفاوية. لا تعبر خلايا NK عن مستقبلات clonotypic متعددة الأشكال، مثل مستقبلات الخلايا التائية (TCR) أو مستقبلات الخلايا B (BCR). في المقابل، يتم دفع تفعيل وظائفها الخلوية من خلال إشراك المستقبلات التي تعترف ligands ثابت على سطح الخلية المستهدفة1،2.

يستريح الإنسان NK الخلايا المعزولة من الدم المحيطي يمكن البقاء على قيد الحياة لعدة أيام في المتوسطة الثقافة تكملها مصل الإنسان. تفعيل خلايا NK بواسطة السيتوكينات مثل IL-15 أو IL-2 يدفع الخلايا إلى الانتشار وزيادة قدرتها على القتل، من بين تأثيرات أخرى3،4،5. وقد أظهرت العديد من الدراسات وجود علاقة مباشرة بين تنشيط الخلايا NK والتغيرات في نشاطهم الأيضي6. هذه التغييرات الأيضية متجهة لتلبية الاحتياجات الخاصة للخلايا من حيث الطاقة والإنحلال الحيوي.

الخلايا الهوائية والكائنات الحصول على الطاقة من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية التي تنطوي على تقويض وأكسدة الكربوهيدرات والدهون والبروتينات. من خلال مزيج من تحلل، وحامض ثلاثي الكربوكسيلي (TCA) دورة والفوسفورة التأسد، الخلايا eukaryotic تلبية غالبية الطلب ATP والحصول على وسيطة المطلوبة ككتل بناء للجزيئات الجزيئات الأساسية لنمو الخلايا والانتشار. تبدأ عملية تحلل الجلوكوز(الشكل 1A)بدخول الجلوكوز في الخلية. في السيتوسول، الجلوكوز هو الفوسفور وتحويلها إلى بيروفات (مع صافي إنتاج 2 جزيئات من ATP لكل جزيء الجلوكوز)، والتي يمكن تخفيضها إلى اللاكتات أو نقلها إلى الميتوكوندريا ليتم تحويلها إلى أسيتيل-CoA وتدخل دورة TCA. تستمر دورة TCA في ركوب الدراجات التي تغذيها جزيئات أكثر من أسيتيل-COA وتنتج CO2 (التي ستنتشر في نهاية المطاف خارج الخلية ، ومن خلال التفاعل مع H2O في الوسط ، سوف تولد حمض الكربونيك الذي سيؤدي إلى تحمض الوسط) و NADH ، الجزيء المسؤول عن التبرع بالإلكترونات لسلسلة نقل الإلكترونات (ETC). الإلكترونات السفر من خلال مختلف مجمعات البروتين وأخيرا قبلت من قبل الأكسجين. هذه المجمعات (I, III و IV) أيضا ضخ H+ من مصفوفة الميتوكوندريا في الفضاء intermembrane. ونتيجة للتدرج الكهروكيميائي المتولدة، فإن H+ سيدخل مرة أخرى في المصفوفة من خلال V المعقدة (ATP-synthase)، باستثمار الطاقة المحتملة المتراكمة في توليد ATP.

يمكن منع كل من تحلل التحلل والتنفس الميتوكوندريا في نقاط مختلفة باستخدام مثبطات. وكان معرفة واستخدام هذه المثبطات الأساس لتطوير مقايسة التدفق خارج الخلية. من خلال قياس اثنين من المعايير البسيطة في الوقت الحقيقي مثل الهيدروجيني والأكسجين، محلل تدفق خارج الخلية يستنتج معدل تحلل الغليك والتنفس الميتوكوندريا في لوحة 96-جيدا. يتم إجراء اختبار الإجهاد تحلل في وسط القاعدية دون الجلوكوز (الشكل 1B)7. والقياسات الأولى لمعدل التحمض خارج الخلية (ECAR) تدل على تحمض تحلل مستقل. ويشار إلى هذا التحمض غير glycolytic ويرتبط مع CO2 التي تنتجها TCA التي، كما أوضح من قبل، يجمع مع H2O في المتوسط لتوليد H+ (ECAR المرتبطة TCA). الحقنة الأولى هي الجلوكوز للحث على استخدام الجلوكوز وتعزيز تحلل الجلوكوز. الحقنة الثانية تجمع بين كل من الرتينون، مثبطات معقدة I، ومضاد مضادة للاكتئاب A، مثبط مجمع الثالث معا، لمنع الخلايا ETC تستجيب لهذا الانخفاض الكبير في إنتاج ATP الميتوكوندريا عن طريق تفعيل تحلل للحفاظ على مستويات ATP الخلوية، وهذا يمثل كمية من glycolysis التي لا تستخدمها الخلية في الحالة القاعدية ولكن يمكن أن يحتمل أن يتم تجنيدها استجابة للزيادات في ATP الطلب (تعويض الجلسانية). الحقنة الثالثة هي الجلوكوز التناظرية 2-Deoxyglucose (DG)، الذي ينافس الجلوكوز كركيزة للهكية الانزيم. لا يمكن تحويل نتاج هذا الفسفر، 2-deoxyglucose-6-الفوسفات إلى بيروفات، وبالتالي يتم حظر تحلل، مما يقلل من ECAR إلى الحد الأدنى. ويشمل قياس الـ ECAR في هذه المرحلة مصادر أخرى من التحمض خارج الخلية لا تعزى إلى تحلل التحلل أو النشاط التنفسي، وكذلك إلى أي تحلل متبقي لا يمنعه بشكل كامل 2-DG (بعد 2-DG-acidification).

يتم تنفيذ اختبار الإجهاد الميتوكوندريا في المتوسط مع الجلوكوز (الشكل 1C)8. القياسات الأولى لمعدل استهلاك الأكسجين (OCR) تتوافق مع الخط الأساسي لتنفس الميتوكوندريا (التنفس القاعدي). الحقنة الأولى هي أولغوميسين، الذي يمنع عودة البروتونات من خلال سينثاز ATP (V المعقدة)، وحجب تركيب ATP وبالتالي بسرعة فرط القطب غشاء الميتوكوندريا، مما يمنع ضخ البروتونات من خلال مجمعات الجهاز التنفسي، ويؤدي إلى انخفاض في OCR. وتمثل المقارنة بين التنفس الأساسي والقيمة التي تُعطى عن طريق إضافة ألتغوميسين التنفس المرتبط بـ ATP. ويسمى معدل أقليجوميسين المتبقية من استهلاك الأكسجين تسرب البروتونات، والذي يمثل تدفق البروتونات من خلال ثنائي الدهون أو البروتينات في الغشاء الميتوكوندريا الداخلية مثل النيوكليوتيدات أدينينtranslocase 9. الحقنة الثانية هي uncoupler 2،4-dinitrophenol (DNP)، وهو ionophore الذي يحفز دخول ضخمة من H+ في مصفوفة الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى إزالة القطب من غشاء الميتوكوندريا وتعطيل تخليق ATP الميتوكوندريا. تستجيب الخلايا لتبديد قوة البروتون الدافعة عن طريق زيادة معدل نقل الإلكترون واستهلاك الأكسجين إلى أقصى مستويات في محاولة عقيمة لاستعادة إمكانات الغشاء (القدرة التنفسية القصوى). والفرق بين القدرة التنفسية القصوى والتنفس القاعدي هو قدرة الجهاز التنفسي الاحتياطية للخلية، والتي تمثل كمية التنفس التي لا تستخدمها الخلية لتوليد ATP في الحالة القاعدية ولكن يمكن أن يكون من المحتمل تجنيد استجابة للزيادات في الطلب ATP أو في ظل ظروف الإجهاد8. الحقنة الثالثة هي مزيج من الروتينون ومضادات الديميسينين A. هذه الحقن توقف تماما وSOCS انخفاض OCR إلى أدنى مستوى لها، مع استهلاك الأكسجين المتبقية يجري غير الميتوكوندريا (الناجمة عن NADPH-أوكسيداسيس، الخ).

يمكن أن التغيرات في المسارات الأيضية التنبؤ بطريقة أو بأخرى عمل الخلايا NK، كما اقترح أن التنشيط المستمر للخلايا NK مع السيتوكينات في المختبر يمكن أن يؤدي إلى استنفاد الخلايا NK من خلال دراسة مسارات التمثيل الغذائي المختلفة10،11. العلاقة بين NK حالة الأيضية الخلية والوظيفة مهم جدا من وجهة نظر العلاج المناعي السرطان. في هذا المجال، تم اختبار تفعيل خلايا NK مع ضخ IL-15، وحدها أو بالاشتراك مع الأجسام المضادة العلاجية أحادية النسيلة من أجل تحسين الخلايا السرطانية قتل12،13،14. من شأن معرفة الحالة الأيضية للخلايا NK استجابة لهذه الاستراتيجيات العلاجية توفير مؤشر قيمة لحالة تنشيط الخلية NK و وظيفة القتل.

وقد وصفت دراسة المسارات الأيضية في الخلايا النخاعية واللمفاوية الأخرى مثل الخلايا الأحادية، T و B الخلايا15 والطرق الأمثل قد نشرت16. في هذا البروتوكول ونحن نقدم طريقة تجمع بين كل من بروتوكول العزلة NK التي تعطي أعدادا كبيرة من الخلايا النقية والقابلة للحياة NK وبروتوكول محسن لقياس النشاط الأيضي باستخدام محلل تدفق خارج الخلية. هنا نظهر أن هذا هو وسيلة صالحة لدراسة التغيرات الأيضية في الراحة و IL-15 تنشيط الخلايا NK الإنسان. بالنسبة للفحص الخارج عن الخلية، تم اختبار المعلمات مثل عدد الخلايا وتركيزات الأدوية وتحسينها. بالمقارنة مع أساليب التنفس الأخرى ، محلل تدفق خارج الخلية مؤتمتة بالكامل وقادرة على اختبار في الوقت الحقيقي ، مع كميات منخفضة جدا من الخلايا ، تصل إلى 92 عينات في وقت واحد ، وبالتالي يسمح بالفحص عالي الإنتاجية (مع عينات متعددة ومكررات) بطريقة سريعة نسبيا17.

يمكن استخدام هذه الطريقة من قبل الباحثين المهتمين في تقييم وظيفة الخلية NK من خلال دراسة NK استقلاب الخلية. ويمكن تطبيقه كذلك على الخلايا التي تنشطها السيتوكينات الأخرى، والأجسام المضادة أو المحفزات القابلة للذوبان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب وفقا لإعلان مبادئ هلسنكي الأخلاقية للبحوث الطبية. تم الحصول على عينات الدم الطرفية من المتبرعين من إدارة طب نقل الدم في المعاهد القومية للصحة بموجب بروتوكول 99-CC-0168 الذي تمت الموافقة عليه من IRB ، بموافقة خطية من المريض.

1- إعداد الكاشفات

  1. الكواشف لعزل خلايا NK
    ملاحظات: تحضير هذه الكواشف في غطاء لثقافة الخلية.
    1. إعداد NK العازلة الفصل: برنامج تلفزيوني ملحق (درجة حرارة 7.4) مع 1 mM EDTA و 2٪ مصل العجل الجنين (FCS) التي تم سابقا تنشيط الحرارة (في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة).
    2. إعداد NK ثقافة المتوسطة: ملحق إيسكوف وسائل الإعلام Dulbecco المعدلة (IMDM) مع مصل الإنسان 10٪ (HS). مرشّح معقم ويخزن في 2-8 درجة مئوية. تدفئة المتوسطة إلى 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى الخلايا.
    3. Resuspend الإنسان IL-15 في برنامج تلفزيوني في 200 ميكروغرام / مل.
  2. الكواشف لمقايسة التدفق خارج الخلية
    1. إعداد وسائل الإعلام فحص: لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا المتوسطة، إضافة 1 mM بيروفات الصوديوم، 2 M L-الجلوتامين و 10 mM الجلوكوز إلى وسط قاعدة. لجليكوليس الإجهاد المتوسط اختبار، إضافة 2 M L-الجلوتامين إلى وسط قاعدة.
      ملاحظة: يتم توفير تركيزات الجلوكوز، بيروفات والجلوتامين على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة محلل تدفق خارج الخلية. ومع ذلك، يمكن تغيير تكوين وسائل الإعلام من قبل الباحثين لتتناسب تماما مع تلك من وسط الثقافة، إذا رغبت في ذلك.
    2. ضبط درجة PH من كل من وسائل الإعلام إلى 7.4 مع 0.1 N NaOH باستخدام مقياس درجة حرارة المقعد، مرشح معقمة من خلال حجم المسام 0.2 μM وتخزينها في 2-8 درجة مئوية. وسائل الإعلام الدافئة إلى 37 درجة مئوية، والتحقق من درجة حُكم الجوح وإعادة ضبطها إلى 7.4 قبل الاستخدام إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يتم احتواء CO2 المحيط فقط في الغلاف الجوي لمحلل تدفق خارج الخلية، واستخدام وسائل الإعلام دون بيكربونات أمر بالغ الأهمية.
    3. إعداد حلول الأسهم للكاشفات: Oligomycin (مثبطات ATP synthase)، 10 mM حل الأسهم في DMSO؛ 2،4-dinitrophenol (DNP، uncoupler)، 1 M حل الأسهم في DMSO؛ antimycin A (مثبطات الثالث المعقدة)، 10 mM حل الأسهم في DMSO؛ rotenone (مجمع مثبطات I)، 10 mM حل الأسهم في DMSO. جعل 30 ميكرولتر aliquots من جميع الكواشف وتخزينها في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه الإرشادات مخصصة للكاشف التي يتم شراؤها بشكل فردي وإعدادها من قبل الباحث. إذا تم شراء الكواشف من الشركة المصنعة محلل بدلا من ذلك، اتبع المبادئ التوجيهية لإعداد الكاشف.

2. NK الخلايا العزلة من الدم المحيطي

  1. إعداد خلايا الدم الأحادية النوية الطرفية (PBMCs) من الدم البشري
    ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوات في غطاء محرك بيانات الخلية. إزالة التلوث من جميع المخلفات والمواد التي تتلامس مع الدم مع التبييض والتخلص منها في الحاوية المناسبة لحرقها.
    1. Pipette 20 مل من متوسط الفصل الليمفاوي (LSM) في أنبوب مخروطي 50 مل.
    2. بعناية، مع الحفاظ على أنبوب في زاوية 30 درجة، ماصة 20 مل من الدم على LSM، بلطف جدا ولمس جدار الأنبوب. تجنب خلط الدم مع LSM وخلق واضح ومحدد بوضوح بين السائلين.
      ملاحظة: يمكن استخدام الدم المحيطي أو منتجات leukapheresis المخصب.
    3. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 25 دقيقة، 1000 س ز في درجة حرارة الغرفة. لا تستخدم الفرامل، لأنها يمكن أن تجعل كلا المرحلتين في مزيج أنبوب (LSM والدم).
    4. إخراج الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي ووضعها في رف. تحقق من وجود طبقة واضحة من الخلايا (الخلايا أحادية النوى) التي سوف تتشكل في الطور البيني بين LSM (واضحة) والبلازما (الصفراء) ، في حين أن خلايا الدم الحمراء بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
    5. استلهم بلطف طبقة الخلية أحادية النواة مع ماصة بلاستيكية 10 مل (حوالي 5-8 مل) ووضعها في أنبوب جديد مخروطي 50 مل. يمكن تجميع الليفتيوم بين الزفير يصل إلى 2 أنابيب مختلفة معا.
    6. اغسل الخلايا أحادية النوى 2x عن طريق إعادة الإنفاق في PBS 45 مل وrrifuging في 800 × ز لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: بعد هذه الخطوة، يتم الحصول على بيليه من خلايا أحادية النوى الدموية الطرفية (PBMCs) ويمكن للباحث المتابعة إلى خطوة العزل NK.
  2. NK عزل من PBMCs
    1. عد الخلايا من 2.1.6 ثم إعادة تعليقها في NK الفصل العازلة (1x 108 PBMCs / مل).
    2. تأخذ 10 مل من resuspension الخلية (109 PBMCs ) ووضعها في أنبوب 50 مل.
    3. Add 500 μL (50 μL/mL of buffer) of NK cell isolation antibody mix and 10 μL (1 μL/ mL of buffer) of anti-CD3 positive isolation antibody mix to the PBMCs and incubate at room temperature for 10 min.
    4. دوامة الخرز المغناطيسي وإضافة 1 مل إلى مزيج من PBMCs مع الأجسام المضادة (100 ميكرولتر الخرز / مل PBMCs). احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك أحيانا.
    5. إضافة 35 مل من العازلة العازلة NK العزل (3.5 مل العازلة / مل PBMCs)، مزيج ومكان على المغناطيس لمدة 15 دقيقة (2.2 × 107 PBMCs / مل). بعد ذلك الوقت، والخرز والخلايا المحددة بشكل إيجابي (جميع الخلايا ولكن NK) سوف تلتزم جدران الأنبوب.
    6. جمع بعناية فائقة (تحتوي على خلايا NK) مع ماصات بلاستيكية 50 مل دون لمس الجانبين أو الجزء السفلي من الأنبوب.
    7. عد الخلايا باستخدام عداد الخلية والطرد المركزي في 800 س ز لمدة 5 دقائق.
    8. resuspend عزل خلايا NK في 5 × 106 خلايا / مل في IMDM تحتوي على 10٪ HS ووضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى يتم تنفيذ التجربة.
      ملاحظة: هذا البروتوكول عزل NK الدول أرقام الخلايا وأحجام الكاشف تكييفها لاستخدام أنبوب 50 مل ومغناطيس كبير. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول (في حالة الحصول على المزيد من PBMCs) عن طريق تكرار خطوات العزل في أنابيب مختلفة أو تقليصها عن طريق تقليل حجم في الأنبوب. للأحجام النهائية من 14-45 مل ويستخدم أنبوب البوليسترين 50 مل، للمجلدات 4-14، ويستخدم أنبوب البوليسترين 15 مل، وبالنسبة للمجلدات 1-4 مل، ويستخدم أنبوب البوليسترين 5 مل. المغناطيس هو مختلف وتناسب الأنبوب المناسب في كل حالة. ويمكن أيضا أن حجم كمية من مزيج الأجسام المضادة والخرز المغناطيسي وفقا لعدد الخلايا والحجم النهائي.
  3. NK عدد الخلايا تلطيخ لتدفقات cytometry
    1. اتخاذ 0.25 × 106 خلايا لكل عينة من الخطوة 2.2.8 ، وإزالة المتوسطة عن طريق الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة و resuspend بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة صبغة قابلة للحياة وفقا لتوصية الشركة المصنعة (1 ميكرولتر من صبغة DMSO المعاد تشكيلها إلى 1 مل من resuspension الخلية) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    3. غسل 2x عن طريق إعادة الإنفاق في 5 مل PBS وsuguging في 800 × ز لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
    4. وصمة عار مع الأجسام المضادة المضادة للإنسان المقابلة في 100 ميكرولتر من IMDM تحتوي على 10٪ HS لمدة 30 دقيقة على الجليد المحمية من الضوء (انظر الجدول 1). يمكن الجمع بين جميع الأجسام المضادة واستخدامها في خطوة واحدة تلطيخ.
    5. تحليل العينات بواسطة تدفق عملية استئصال الخلايا لتقييم نقاء NK الخلية التي تم الحصول عليها. استخدام الغوات الخلية وطريقة التحليل التي سبق وصفها18،19.
  4. تحفيز خلايا NK مع IL-15 قابل للذوبان
    1. Resuspend 0.75 × 106 خلايا من الخطوات 2.2.8 أو 2.4.3 في 100 ميكرولتر من IMDM تحتوي على 10٪ HS في بئر من 96 لوحة جيدة (مستديرة أسفل).
    2. تخفيف الإنسان IL-15 إلى 1 ميكروغرام/مل في IMDM التي تحتوي على HS 10%. أضف 100 ميكرولتر من IL-15 الإنسان المخفف إلى الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكروغرام/مل.
      ملاحظة: 0.5 ميكروغرام/مل هو تركيز تشبع من IL-15. قد يتم اختبار تركيزات أقل من IL-15 أو غيرها من السيتوكينات مثل IL-2 أو IL-12 أو IL-18 من قبل الباحثين إذا رغبت في ذلك.
    3. وضع الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية وتحفيز ل 48 ساعة قبل إجراء فحص تدفق خارج الخلية. resuspend غير مُنَخَذ (التحكم) الخلايا في نفس التركيز والحجم في IMDM التي تحتوي على 10٪ HS دون IL-15، ووضعها في نفس الحاضنة لمدة 48 ساعة.

3. ترطيب خرطوشة الاستشعار

ملاحظة: تحتوي نصائح المسبار 96 لخراطيش الاستشعار على فلوفورات فردية ذات حالة صلبة لـ O2 و H+ التي تحتاج إلى ترطيب من أجل اكتشاف التغيرات في O2 و الرقم الـ PH.

  1. بدوره على محلل والسماح لها الاحماء تصل إلى 37 درجة مئوية.
  2. افتح حزمة خرطوشة المستشعرات وافصل خرطوشة المستشعر عن لوحة الأدوات المساعدة. إضافة 200 μL من حل الفرجان في كل بئر من لوحة فائدة ووضع مرة أخرى خرطوشة الاستشعار على لوحة، والتحقق من أن أجهزة الاستشعار مغمورة تماما في الحل. للحصول على أفضل النتائج احتضان خرطوشة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2خالية من أن يتم ترطيب بشكل صحيح لمنع التبخر. منع تشكيل فقاعة تحت أجهزة الاستشعار أثناء الترطيب.
    ملاحظة: الحد الأدنى من وقت ترطيب الخراطيش هو 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة خالية من CO2. بدلا من ذلك، ترطيب بين عشية وضحاها من خرطوشة الاستشعار مع 200 ميكرولتر من الماء المعقم في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2-الحرة،تليها حضانة خرطوشة الاستشعار مع 200 ميكرولتر من محلول الكاليبرانت قبل الدافئة 45 – 60 دقيقة قبل بدء التشغيل، ويمكن استخدامها.

4. فحص تدفق خارج الخلية

  1. إعداد لوحات لاصقة مغلفة
    ملاحظة: منذ قياس المعلمات الأيضية يحدث في غرفة نوم تتكون في الجزء السفلي من لوحة 96-جيدا، يجب أولا أن تلتزم خلايا التعليق إلى الجزء السفلي من البئر. يتم استخدام لاصقة خلية المستخرجة من بلح البحر Mytilus edulis. توصي الشركة المصنعة للصق الخلية بتركيز الطلاء من 1 إلى 5 ميكروغرام / سم2. بئر من الخلية محلل ثقافة microplate لديه سطح من 0.110 سم تقريبا2. وهكذا، فإن تركيز 5 ميكروغرام/سم2، يتطلب حوالي 0.55 ميكروغرام من المادة اللاصقة. كما سيتم استخدام 25 ميكرولتر من محلول لاصقة لمعطف كل بئر، والتركيز الحل لاصق الأمثل لصغر حجم الخلايا محلل هو حوالي 22.4 ميكروغرام / مل (22.4 ميكروغرام / مل x 0.025 مل = 0.56 ميكروغرام).
    1. إعداد 2.5 مل من محلول لاصق الخلية (22.4 ميكروغرام / مل) في 0.1 م بيكربونات الصوديوم، وhh 8.0. يوفر بيكربونات درجة الH الأمثل لأداء الخلية التي، وفقا للشركة المصنعة، هو بين 6.5 و 8.0.
    2. ماصة 25 μL من حل لاصق الخلية إلى كل بئر من لوحة المقايسة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، إزالة الحل وغسل 2x مع 200 ميكرولتر من الماء المعقم / جيدا. دع الآبار تجف من خلال الحفاظ على اللوحة مفتوحة لمدة 15 دقيقة داخل غطاء ثقافة الخلية.
      ملاحظة: قد يتم تخزين الألواح المغلفة لمدة تصل إلى أسبوع في 4 درجة مئوية.
  2. بذر الخلية في لوحات المغلفة مع لاصقة
    1. خلايا الطرد المركزي من الخطوة 2.4.3 في 200 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatants وغسل الخلايا في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا الدافئة المتوسطة (إذا كان يجري إجراء اختبار الإجهاد الميتوكوندريا) أو اختبار الإجهاد glycolysis المتوسطة (إذا كان يجري إجراء اختبار الإجهاد glycolysis). خلايا بيليه مرة أخرى، و resuspend إلى تركيز الخلية المفضلة في نفس المتوسطة (سوف يعتمد حجم resuspension على تركيز الخلية المختارة؛ لأن كل بئر سوف تحتوي على 180 ميكرولتر من تعليق الخلية، إعداد 0.26 × 106، 0.52 × 106، 1.04 × 106، 2.08 × 106، 4.17 × 106 و 8.33 × 106 خلايا / mL تعليق الخلايا لـ 1 0.047 x 106، 0.094 x 106، 0.187 x 106، 0.375 x 106، 0.75 x 106 و 1. 5 × 106 خلايا في كل بئر).
    2. لوحة 180 μL من تعليق الخلية في كل بئر على طول الجانب من كل بئر. ويوصى الماصات متعددة القنوات. استخدم الآبار A1 و A12 و H1 و H12 من لوحة ثقافة المحلل كآبار تحكم لتصحيح الخلفية. إضافة 180 ميكرولتر من الوسيط المقايسة في هذه الآبار (لا توجد خلايا). ويمكن استخدام آبار التحكم الإضافية إذا رغبت في ذلك وإذا كان هناك مساحة كافية في لوحة.
      ملاحظة: وجود المصل قد يسبب مرفق خلية رديئة.
    3. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في CO2-حاضنة الحرة. إعداد 10x مركبات في هذه الأثناء (انظر الخطوة 4.3 أدناه).
    4. تغيير إعدادات الطرد المركزي إلى صفر الكبح. الطرد المركزي لوحة في 200 × ز لمدة 5 دقائق. مراقبة الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنها تشكل أحادية الطبقة في الجزء السفلي من البئر. نقل لوحات العودة إلى CO2حاضنة الحرة لمدة 25 دقيقة. للحصول على أفضل النتائج، يجب أن لا يكون إجمالي الوقت بعد الطلاء أكبر من حوالي ساعة 1.
  3. إعداد حلول العمل 10x لتحميل في خرطوشة الاستشعار
    ملاحظة: كل من النصائح 96 مسبار من خرطوشة الاستشعار الموانئ 4 (A، B، C و D) التي يمكن استخدامها لحقن المركبات بالتتابع في الآبار الفردية.
    1. لإجراء اختبار الإجهاد الميتوكوندريا, إعداد 2.5 مل كل من 10 ميكرومتر oligomycin, 1 M DNP, وخليط من 10 ميكرومتر الروتينون و 10 ميكرومتر antimycin A, في التحاليل الإجهادية الميتوكوندريا المتوسطة (استخدام حلول الأسهم من الخطوة 1.2.3). وستكون التركيزات النهائية في البئر بعد الحقن 1 ميكرومتر أوليغوميسين، 0.1 mM DNP و 1 ميكرومتر أنتيميسين A/rotenone.
    2. لإجراء اختبار الإجهاد تحلل, إعداد 2.5 مل من خليط من 10 ميكرومتر روفينون و 10 ميكرومتر antimycin A في التحلل الإجهاد التحلل التحاليل المتوسطة (استخدام حلول الأسهم من الخطوة 1.2.3). قم بذوبان الجلوكوز في اختبار الإجهاد التحلل المتوسط لمحلول 100 mM و 2-deoxy-glucose (2-DG) في اختبار الإجهاد الجليكوليس الوسيط لمحلول 500 mM. وستكون التركيزات النهائية في البئر بعد الحقن 10 mM الجلوكوز، 1 μM antimycin A/rotenone و 50 mM 2-DG.
    3. حلول دافئة إلى 37 درجة مئوية، والتحقق من درجة حِسّه وإعادة ضبطه إلى 7.4 إذا لزم الأمر. تحميل المركبات المعدة في الخطوة 4.3.1. (لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا) أو 4.3.2 (لاختبار الإجهاد تحلل الجلوكوز) في الموانئ A و B و C من خرطوشة الاستشعار المائية (من الخطوة 3.2) باستخدام micropipettor متعددة القنوات وأدلة تحميل الميناء المقدمة مع خرطوشة، كما هو مبين في الجدول 2.
      ملاحظة: لضمان الحقن السليم في جميع الآبار أثناء الفحص، يجب أن تحتوي كل سلسلة من المنافذ المستخدمة (مثل جميع المنافذ A) على نفس حجم الحقن عبر خرطوشة الاستشعار بأكملها. وهذا ينطبق على آبار تصحيح الخلفية وحتى على تلك الآبار غير المستخدمة في التجربة.
    4. احتضان خرطوشة الاستشعار المحملة في 37 درجة مئوية في الحاضنة CO2-free أثناء إعداد البرنامج.
  4. إعداد بروتوكولات فحص تدفق خارج الخلية
    1. فتح برنامج محلل تدفق خارج الخلية، وباستخدام تعريفات المجموعة وطبقة خريطة علامات التبويب تشير إلى مجموعات من الآبار التي لديها ظروف مماثلة (على سبيل المثال، الآبار مع نفس العدد من الخلايا، أو الآبار مع خلايا يستريح أو خلايا محفّزة IL-15). كما سيتم تعيين آبار تصحيح الخلفية (افتراضياً A1 و A12 و H1 و H12، ولكن يمكن استخدام آبار إضافية) وآبار فارغة.
    2. إعداد البرنامج الموضح في الجدول 3 في البرنامج باستخدام علامة التبويب Protocol .
    3. ابدأ البرنامج باستخدام علامة التبويب "تشغيل الفحص". ضع خرطوشة المستشعر (رطبة ومحملة بمركبات 10x) ولوحة الأدوات المساعدة على الدرج. بعد خطوة المعايرة (15 - 20 دقيقة)، عند المطالبة، استبدل لوحة الفرجار لصفيحة المقايسة (بدون غطاء) بالخلايا المرفقة. بعد ذلك، يتم تشغيل الآلي بالكامل (الجهاز سوف تؤدي جميع القياسات والحقن).
      ملاحظة: من الممكن إجراء اختبار إجهاد الميتوكوندريا واختبار الإجهاد الغليكوليكي في نفس اللوحة، طالما يتم تحميل مركبات محددة في الموانئ المناسبة (oligomycin، DNP ومضادات الميميسين / الروتينون في الموانئ A، B و C على التوالي من الآبار حيث يتم إجراء اختبار الإجهاد الميتوكوندريا; الجلوكوز, antimycin/rotenone و 2-DG في الموانئ A, B و C على التوالي من الآبار حيث يتم إجراء اختبار الإجهاد glycolysis), يتم تحديد نفس وحدات التخزين للحقن في كل سلسلة من الموانئ والآبار لكل اختبار يتم تحديدها بشكل صحيح باستخدام تعريفات المجموعة ولوحة علامات التبويب خريطة البرنامج.
    4. بعد الانتهاء من تشغيل، واسترداد البيانات وتحليلها باستخدام البرنامج.

5- تحديد رقم الخلية

ملاحظة: يمكن تسوية النتائج لحساب الاختلافات المحتملة في رقم الخلية. ويمكن استخدام نهجين رئيسيين يرد وصفهما أدناه.

  1. تحديد محتوى الحمض النووي
    1. إزالة المتوسطة ما تبقى من الفحص مع ماصة من كل بئر. عندما التعرق المتوسطة، والحرص على عدم تعكير صفو الخلايا. يمكن تخزين اللوحة في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
      ملاحظة: خطوة التجميد مهمة لتحديد محتوى الخلية الفعالة والحمض النووي.
    2. إعداد حل 1x من الخلايا انتشار التحليل الخلية- تحلل العازلة (20x) في الماء المقطر (200 ميكرولتر / بئر).
    3. إضافة الخلية انتشار صبغة الأسهم الحل (400x) في 1x الخلية- تحلل العازلة. للكشف عن 50 إلى 50.000 الخلايا في بئر، استخدم 1x خلية انتشار صبغة الفحص. بالنسبة لأرقام الخلايا الأعلى، يوصى باستخدام صبغة فحص انتشار الخلايا بتركيز نهائي أعلى من 1x. في هذه الحالة، استخدم صبغة التحليل انتشار الخلية في تركيز نهائي 5x (تمييع الخلية انتشار الأسهم التحليل الحل 80 أضعاف في 1x الخلية- تحلل العازلة).
    4. إضافة 200 μL من الخلية الكاشف انتشار إلى كل بئر. احتضان العينات لمدة 2-5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حماية من الضوء.
    5. قياس الفلورية للعينات عند الإثارة: 480 نانومتر؛ 480 نانومتر؛ 200 متر؛ 200 متر؛ 200 متر؛ 200 متر؛ 200 متر؛ 200 متر؛ 200 متر الانبعاث: 520 نانومتر باستخدام قارئ الفلورسينت microplate وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
  2. تحديد محتوى البروتين
    1. بعناية، وpirate تماما وسيطة من كل بئر دون لمس الخلايا وتجميد الخلايا في -20 درجة مئويةلمدة 1 ساعة على الأقل. بدلا من ذلك، يمكن أن تبقى الخلايا المجمدة لأوقات أطول (تصل إلى 1 أسبوع) حتى يتم إجراء التحليل.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من اختبار المناعة المشعة (RIPA) تحلل المتوسطة تكملها مثبطات البروتياز 1x (من محلول الأسهم 100x) إلى كل بئر. ضع الطبق على شاكر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتضن الطبق على الجليد لمدة 30 دقيقة لتحلل الخلية الكاملة.
    3. الطرد المركزي لوحة لمدة 5 دقائق في 200 × ز في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة سوف بيليه الحطام الخلوي لمنع التداخل مع قياس البروتين.
    4. قياس تركيز البروتين عن طريق حمض bicinchoninic (BCA) اختبار وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إن عزل خلايا NK من الدم المحيطي يوفر مجموعة نقية وقابلة للحياة

ويستند المقايسة تدفق خارج الخلية على قياس H+ و2 التركيز في البئر، وسوف لا تميز بين مجموعات مختلفة من الخلايا أو قدرتها على البقاء. ولهذا السبب، كان الحصول على مجموعة سكانية نقية للغاية وقابلة للحياة من خلية الاهتمام هو الخطوة الرئيسية للنجاح في هذه التجارب.

تم عزل خلايا NK من الدم المحيطي كما هو مذكور في القسم 2. من أجل تقييم نقاء وديمومة الخلايا NK التي تم الحصول عليها ، تم تلطيخ وتحللها aliquots الصغيرة من PMBCs والخلايا NK المعزولة بواسطة قياس الخلايا التدفقي (الشكل 2A). تم اِسَرَر الخلايا أحادية النوى في المؤامرة التي تظهر إلى الأمام (FSC-A) مقابل منطقة التشتت الجانبي (SSC-A). داخل هذه الالسّكان, كان يسور خلايا وحيد على طول القطر في الالمؤامرة يبدي [فسك-أ] مقابل إرتفاع تشتت أماميّة ([فسك-ه]). وفي داخل مجموعات السكان المنفردة، تم تقييم قابلية البقاء، وتبين أنها أعلى من 98 في المائة في كل من مجموعات الخلايا ذات القيمة المُنَوِّجة لـ PMB وNK. وقد أنشئت نقاء السكان معزولة خلية NK عن طريق تلطيخ مزدوج ضد CD3 (موجودة في الخلايا التائية، والسكان المهيمنة بين PBMCS) و CD56 أو NKp46 (الشكل 2B). يتم تعريف خلايا NK كـ السكان سالبة لـ CD3 و إيجابية لـ CD56 أو NKp46. ووفقا لهذه المعايير، كان نقاء خلايا NK حوالي 88٪، وهو ما يمثل إثراء 18 ضعفا على خلايا ناغورني كاراباخ مقارنة بتلك الموجودة في السكان PBMCs.

التعرف الضوئي على الحروف و ECAR القيم تعتمد على رقم الخلية

لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا, كانت الخلايا مضطربة الأيضية بإضافة ثلاثة مركبات مختلفة: oligomycin, DNP و antimycin A + rotenone. لكل نوع خلية، تم تحسين عدد الخلايا في البئر بعناية لتجربة فحص تدفق خارج الخلية. ويبين الشكل 3A المؤامرات التمثيلية لمعدل استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا (OCR) باستخدام عدة أرقام خلايا NK بشرية (0.75 x 106و0.375 x 106و0.187 x 106و0.094 x 106 ). وقد أجريت جميع القياسات في ثلاث ية. وترتبط أرقام الخلايا خطياً بكمية الحمض النووي أو البروتين في البئر(الشكل 3B). وكما هو متوقع، فإن أرقام الخلايا العالية تعرض قيماً أعلى لل OCR، في حين أن أقل من 0.187 x 106 خلايا في البئر لم تقدم نتائج قوية. من ناحية أخرى، لم تكن أرقام الخلايا الأعلى (1.5 × 106)مثالية، حيث أنه عند إضافة DNP، تم استنفاد تركيز الأكسجين في البئر تمامًا في كل دورة(الشكل 3C) ، مما يحول دون الحساب الدقيق لـ OCR. يجب أن يكون تركيز uncoupler titrated بعناية لكل نوع خلية، كما لا إضافة نتائج كافية DNP في OCR دون الحد الأقصى، في حين أن إضافة الكثير قد تمنع أقصى OCR كذلك. في خلايا NK الإنسان، تم العثور على 100 ميكرومتر DNP لتكون الجرعة المثلى(الشكل 3D). يمكن استخدام uncouplers الأخرى مثل سيانيد الكربونيل-4-(trifluoromethoxy) فينيلهيدازون (FCCP) أو سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl هيدرازين (CCCP) بدلا من DNP ولكن سوف تحتاج إلى أن يكون المعاير لكل نوع الخلية كذلك.

لاختبار الإجهاد تحلل, بعد قياس خط الأساس من ECAR, كانت الخلايا الجائعة الجلوكوز مضطربة من قبل المركبات التالية: الجلوكوز, antimycin A + rotenone و 2-DG. ويبين الشكل 3E المؤامرات التمثيلية لـ ECAR باستخدام عدة أرقام خلايا NK (0.75 x 106و0.375 x 106و0.187 x 106و0.094 x 106 و0.047 x 106). وقد أجريت جميع القياسات في ثلاث ية. وكان اختبار الإجهاد تحلل أنجح في أعلى كثافة الطلاء، في حين أن أقل من 0.187 x 106 الخلايا في بئر لم تقدم نتائج قوية.

العلاج IL-15 يزيد التعرف الضوئي على الحروف والقيم الأساسية و ECAR القصوى

وقد استخدمت كثافة البذر المثلى التي تبلغ 0.75 × 106 خلايا لكل بئر لإجراء تجارب لاحقة. تم استزراع خلايا NK في وجود أو عدم وجود تركيزات تشبع من السيتوكين IL-15 ل 48 ساعة ، وبعد ذلك تم العثور على قدرتها على البقاء 93.7 ± 4.8 ٪ و 85.7 ± 12.0 ٪ على التوالي. الشكل 4A، B يظهر نموذجي اختبار الإجهاد الميتوكوندريا تجربة مع 0.75 × 106 NK الخلايا في بئر. في هذا الاختبار، oligomycin يؤدي إلى انخفاض كبير في استهلاك الأكسجين (الشكل 4A) وزيادة في ECAR التي تمثل التحول إلى تحلل في محاولة للحفاظ على مستويات ATP الخلوية (الشكل 4B). تسبب تنشيط الخلية NK بواسطة IL-15 في زيادة استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا والتحمض خارج الخلية. وكانت هذه النتيجة متسقة عندما تم مقارنة العديد من البشر(الشكل 4C). القاعدية، القصوى والتنفس ATP المرتبطة، ولكن ليس تسرب البروتون أو التنفس غير الميتوكوندريا، زادت مع IL-15(الشكل 4C، D). أيضا، انخفض معدل OCR /ECAR، مما يشير إلى اتجاه التحول إلى التمثيل الغذائي جليكوليك بعد التحفيز IL-15(الشكل 4E).

الشكل 4F, G يظهر تجربة اختبار الإجهاد الجليكوليس نموذجي مع 0.75 × 106 NK الخلايا في بئر. إضافة الجلوكوز triggerrred زيادة كبيرة في ECAR بسبب تنشيط تحلل، في حين أن إضافة لاحقة من مضادات الداء A والروتينون قاد تحلل تعويضي، و 2-DG تسبب في تثبيط المسار وانخفاض ECAR إلى الحد الأدنى(الشكل 4F). في موازاة ذلك، الجلوكوز تسبب باستمرار انخفاض طفيف في استهلاك الأكسجين، وربما من قبل تأثير كرابتري20، في حين أن antimycin A و rotenone منعت تماما التنفس و 2-DG لا توفر أي آثار أخرى(الشكل 4G). ويمكن ملاحظة تفعيل كل من التحمض خارج الخلية واستهلاك الأكسجين الميتوكوندريا مع IL-15 وكذلك في هذا الاختبار، ومرة أخرى هذا هو ثابت عند استخدام الخلايا من عدة مانحين(الشكل 4H).

Figure 1
الشكل 1: تخطيطي من مقايسات تدفق خارج الخلية.
(A) التخطيطي للتحلل ، ودورة حمض التراكربوكسيلي (TCA) وسلسلة نقل الإلكترون (ETC). مثبطات من خطوات مختلفة مكتوبة باللون الأحمر. يتم تمثيل تدفق الإلكترون في ETC باللون الأخضر مع NADH كمتبرع و O2 كمقبل نهائي. (B) تحليل اختبار الإجهاد التحلل الملف التخطيطي الذي يمثل معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) مقابل الوقت. (C) اختبار الإجهاد الميتوكوندريا التشكيل الجانبي التخطيطي الذي يمثل معدل استهلاك الأكسجين (OCR) مقابل الوقت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: خلايا القاتل الطبيعي (NK) المنقاة من الخلايا أحادية النوى الطرفية (PBMCs).
(أ)يتبع استراتيجية جاتينغ لتقييم نقاء وديمومة خلايا NK (العمود الأيمن) مقابل إجمالي PBMCs (العمود الأيسر). من بوابة الخلايا أحادية النوى (الألواح العلوية)، تم اختيار الخلايا المفردة (الألواح الوسطى) وتم قياس قابلية البقاء (الألواح السفلية). (ب) كانت الخلايا الحية ملطخة لـ CD3 و CD56 أو NKp46. تشير الأرقام في اللوحات إلى النسبة المئوية للخلايا في المناطق المحددة. والنتائج تمثل ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحسين اختبارات الإجهاد الميتوكوندريا والجلوكوز في خلايا NK البشرية المنشطة.
(A) اختبار الإجهاد الميتوكوندريا: OCR لكل كثافة الطلاء (0.75 × 106، 0.375 × 106، 0.187 × 106، 0.094 × 106 و 0.047 x 106). وتمثل كل نقطة بيانات متوسط 3 آبار مع انحراف معياري. النتائج تمثل 3 تجارب مستقلة. (B) الحمض النووي (اللوحة العلوية) والبروتين (لوحة السفلي) مستويات في البئر في مختلف الكثافات الطلاء. تمثل النتائج ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. وتمثل كل نقطة بيانات متوسط 3 آبار مع انحراف معياري. النتائج تمثل 3 تجارب مستقلة. (C) آثار مستوى الأكسجين الخام في الآبار التي لا تحتوي على خلايا (تتبع أسود) ، 0.75 × 106 خلايا (التتبع الأزرق) أو 1.5 × 106 خلايا (تتبع أخضر). في التتبع الأخضر بعد إضافة DNP ، ينضب الأكسجين تمامًا في كل دورة. (D)تم اختبار قدرة الجهاز التنفسي الاحتياطية من 0.75 ×10 6 الخلايا في وجود تركيز DNP عدة. (E) اختبار الإجهاد تحلل: ECAR لكل كثافة الطلاء (0.75 × 106، 0.375 × 106، 0.187 × 106، 0.094 x 106 و 0.047 x 106). وتمثل كل نقطة بيانات متوسط 3 آبار مع انحراف معياري. النتائج تمثل 3 تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الكشف عن التغيرات الأيضية بعد تنشيط خلية NK بواسطة IL-15.
اختبار الإجهاد الميتوكوندريا: OCR (A) و ECAR (B) يتم عرض المؤامرات ل0.75 × 106 يستريح أو خلايا تنشيط IL-15. وتمثل كل نقطة بيانات متوسط 3 آبار مع انحراف معياري. النتائج تمثل 5 تجارب مستقلة. تظهر تغيرات التنفس القاعدي والمكسيم للمتبرع البشري الفردي في (C) ، بينما تظهر نسبة التنفس المرتبطة بـ ATP ، وتسرب البروتون ، والتنفس غير الميتوكوندريا (NMR) في (D) وتظهر نسبة OCR / ECAR في (E). اختبار الإجهاد تحلل: ECAR (F) و OCR (G) يتم عرض المؤامرات ل0.75 × 106 يستريح أو خلايا تنشيط IL-15. وتمثل كل نقطة بيانات متوسط 3 آبار مع انحراف معياري. النتائج تمثل 5 تجارب مستقلة. تظهر تغييرات التحمض خارج الخلية القاعدية والمكسيم للمتبرع البشري الفردي في (H). ns: ليست كبيرة؛ * ص ˂ 0.05؛ ** p ˂ 0.01; p ˂ 0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مساهمة من TCA وتحلل على ECAR.
وتتوافق القياسات الأولى لـ ECAR إلى حد كبير مع التحمض بسبب ثاني أكسيد الكربون2 المنتج في دورة TCA. بعد إضافة الجلوكوز إلى تحلل الوقود مساهمة التحميض المشتقة من TCA في انخفاض ECAR. حقن أنتيميسين A و Rotenone كتل TCA، وتحلل يعوض الزيادة في الطلب ATP عن طريق زيادة إلى مستواه الأقصى (glycolysis تعويضي). يُقلل حصار تحلل الجلوكوز من قبل 2-DG من ECAR إلى أدنى مستويات، بما يتوافق مع التحمض الذي لا يعزى إلى تحلل الجلوكوز أو النشاط التنفسي، وكذلك أي تحلل متبقي لا يمنعه بشكل كامل 2-DG (بعد 2-DG-acidification). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكاشف التركيز العامل استنساخ (للأجسام المضادة) حجم التلطيخ النهائي
الماوس المضادة للإنسان CD3 BV711 50 نانوغرام /مل UCHT1 100 ميكرولتر
الماوس المضادة للإنسان CD56 PE 1/50 تخفيف B159 100 ميكرولتر
NkP46 PE ماوس مضاد للإنسان 1/50 تخفيف 9/E2 100 ميكرولتر
صبغة القدرة على البقاء 1/1000 تخفيف 500 ميكرولتر

الجدول 1: الكواشف والأجسام المضادة المستخدمة في عملية استئصال الانسياب.

اختبار الإجهاد الميتوكوندريا
منفذ حجم مجمع 10x الأسهم التركيز النهائي في الفحص
ألف 20 ميكرولتر أوليجوميسين 10 ميكرومتر 1 ميكرومتر
ب 22 ميكرولتر DNP 1 mM 0.1 مليون م.م
ج 25 ميكرولتر أنتيوميسين A + سترينون 10 ميكرومتر لكل من 1 ميكرومتر لكل من
اختبار الإجهاد تحلل
منفذ حجم مجمع 10x الأسهم التركيز النهائي في الفحص
ألف 20 ميكرولتر الجلوكوز 100 mM 10 mM
ب 22 ميكرولتر أنتيوميسين A + سترينون 10 ميكرومتر لكل من 1 ميكرومتر لكل من
ج 25 ميكرولتر 2-DG 500 mM 50 mM

الجدول 2: تحميل مركب.

خطوه حلقه تكرار (مرات)
ميكس انتظري قياس
المعايره ––
التوازن ––
قراءات خط الأساس 3 دقائق 0 دقيقة 3 دقائق 3
حلقة النهاية ––
إدخال المنفذ A ––
القياسات 3 دقائق 0 دقيقة 3 دقائق 3
حلقة النهاية ––
إدخال المنفذ B ––
القياسات 3 دقائق 0 دقيقة 3 دقائق 3
حلقة النهاية ––
حقن ميناء C ––
القياسات 3 دقائق 0 دقيقة 3 دقائق 3
حلقة النهاية ––
إنهاء البرنامج ––

الجدول 3: تخطيط البرنامج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الورقة، أنشأنا بروتوكولاً لعزل واستزراع الخلايا النقية النقية والأساسية NK البشرية من الدم المحيطي. كما قمنا بتحسين ظروف قياس النشاط الأيضي لهذه الخلايا NK التي تم تقييمها من قبل معدل استهلاك الأكسجين ومعدل التحمض خارج الخلية باستخدام محلل تدفق خارج الخلية. بالمقارنة مع أساليب التنفس الأخرى ، محلل التدفق خارج الخلية سريع ، يتطلب أعدادًا صغيرة من الخلايا ، ويسمح بإجراء فحوصات عالية الإنتاجية. ومع ذلك ، فإن الكواشف مكلفة ، وحقن المركبات تقتصر على أربعة فقط. إعادة عرض الأيض وتنشيط تحلل وفسفورية الأكسدة من قبل السيتوكينات في الخلية NK أمر ضروري لاستجابات قوية خلية NK21، والتقنيات الموصوفة هنا تسمح بدراسة الملف الأيضي للخلايا NK في الوقت الحقيقي. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول إلى الخلايا التي تنشطها السيتوكينات الأخرى، مثل IL-2، IL-12 و IL-18، أو الأجسام المضادة التي ترتبط بتنشيط المستقبلات. لقد تناولنا العديد من الخطوات الرئيسية التي غالبا ما يتم تجاهلها، مثل طلاء الخلايا عند الالتقاء الأمثل أو استخدام التركيز الأمثل من uncoupler لتحفيز استهلاك الأكسجين الأقصى. ومع ذلك، نوصي بالتحقق من منحنيات مستوى O2 الفعلية(الشكل 3C)،إذا أعطيت محفزات أخرى مختلفة عن IL-15 للخلايا، للتأكد من أن O2 لا يتم استنفادها في الآبار. إذا كان هذا هو الحال، ينبغي أن ينخفض عدد الخلية حتى يتم ملاحظة استهلاك O2 خطي لمنع التقليل من قيمة OCR الحقيقي.

التنفس القاعدي يعكس الحالة الأيضية القاعدية من الخلية, التي تسيطر إلى حد كبير من قبل نشاط الميتوكوندريا ATP synthase8, وهو مؤشر على الطلب ATP القاعدية (لتوليف البروتين, ديناميات الهيكل الخلوي, ATPases مثل Na+/ K+-ATPase, إلخ). عادة، في وجود ركائز كافية هذه المعلمة يزيد في الخلايا النشطة أو وشدد الأيضية. إضافة أريغوميسين، الذي يمنع SYNTHASE ATP، ويكشف عن التنفس المرتبطة ATP وتسرب البروتون، والتي يمكن أن يحدث عبر ثنائي الدهون أو البروتينات من غشاء الميتوكوندريا الداخلية، ولكن يمكن أيضا أن تكون غير قابلة للانسجام من خلال البروتينات مثل البروتينات فك (UCPs)9، متورطة في تنظيم توليد الحرارة التكيفية وبالتالي تحويل إمكانات الميتوكوندريا للحرارة في الخلايا الدهنية البني. يتم تحديد التنفس الأقصى بعوامل تشمل توافر ركائز سلسلة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا وكمية ونشاط المجمعات التنفسية. ويمكن أيضا أن تكون مجمعات الجهاز التنفسي الميتوكوندريا ونشاطها تعديل عن طريق تعديلات ما بعد التحويلات مثل أسيتيل أو الفوسفور22،23. ويمكن أن تشير هذه المعلمة أيضا إلى صحة الخلايا وقدرتها على الاستجابة للإهانات الحادة. في ظل حالات الخلل في الميتوكوندريا، ينخفض التنفس الأقصى، وهذا يحد من قدرة الخلية على الاستجابة للتغيرات في الطلب ATP ويؤدي إلى موت الخلية24.

من المهم جدا أن يلاحظ أنه، في كل نقطة من الوقت من اختبارات الإجهاد الميتوكوندريا وجليكوليس، ECAR هو مجموع التحمض المشتق من الجليكليس (عن طريق توليد اللاكتات + H+) والتحمض المستمد من الجهاز التنفسي (عن طريق توليد CO2، الذي يذوب في H2O لتوليد HCO3- وH+) ، والأهم من ذلك ، قد يمثل التحمض المستمد من الجهاز التنفسي نسبة كبيرة من إجمالي ECAR في بعض أنواع الخلايا25. بالنسبة للباحثين المهتمين ، هناك بروتوكولات منشورة لحساب معدلات الغليكوليك الفعلية. ولهذا الغرض، يمكن استخدام معدلات استهلاك الأكسجين أثناء اختبار الإجهاد الجليكوليك(الشكل 4G)لحساب معدل إنتاج البروتون عن طريق التنفس في كل نقطة زمنية، ويمكن طرح هذه القيمة من إجمالي معدل إنتاج البروتون، الذي يتم الحصول عليه باستخدام قيم ECAR وقوة التخزين المؤقت للوسط7و25,,و26.

تعديل مهم لهذا البروتوكول بالمقارنة مع توصية الشركة المصنعة هو الحقن الثاني لاختبار الإجهاد تحلل. ويفضل مضادات الأثنية A و rotenone ل oligomycin, لعدة أسباب التي سبق وصفها7: 1) بعض الخلايا عرض قدرة عالية جليكوليك التي قد تلبي تماما الطلب ATP القاعدية من الخلية, حتى في غياب الفوسفور التأكسي; 2) حجب ETC مع antimycin A والروتينون بشكل مصطنع يزيد من الطلب ATP من الخلية، كما أنه يسبب التحلل المائي ATP بواسطة SYNTHASe ATP (الميتوكوندريا تصبح بالوعة ATP)، الذي يعكس لضخ البروتونات في محاولة لاستعادة احتمال غشاء الميتوكوندريا التي تنهار بعد تثبيط الجهاز التنفسي؛ 3) منع حاضونة من قبل ETC يمنع تحمض الجهاز التنفسي للوسيلة (CO2 الجهاز التنفسي ولدت في دورة TCA التي يتم تحويلها إلى HCO3- وH+) التي يمكن أن تربك نتائج ECAR. وهكذا، لوحظ ECAR القصوى مع مضاداتيميسين A والروتينون يعزى فقط إلى تحلل. ومن المثير للاهتمام، وقد أفيد أن ECAR لوحظ مع مثبطات الجهاز التنفسي وحدها قد لا تزال submaximal7، وآلية إضافية لزيادة الطلب ATP الخلوية (وبالتالي ECAR القصوى) وقد وصفت: إضافة من مونينسين ionophore، مما يزيد من استيراد نا+ في الخلية27 ويحفز معدل التحلل المائي ATP بواسطة غشاء البلازما نا+/ K+-ATPase، إلى خليط من مضاداتيميسين A و rotenone7.

المفهوم الثاني المهم هو أننا لا نوصي بطرح التحمض غير glycolytic، الذي ربما يتوافق مع CO2 الجهاز التنفسي الذي يتم تحويله إلى HCO3- وH+، من التتبع بأكمله لحساب المعلمات glycolytic كما أوصت الشركة المصنعة، كما يتغير هذا المبلغ إلى حد كبير خلال كل مرحلة من اختبار الإجهاد Glycolysis (وهو أعلى في الحالة القاعدية، وينخفض بعد إضافة الجلوكوز بسبب تأثير كرابتري20، ويتم إلغاء تقريبا مع مضاداتيميسين A و rotenone) (الشكل 5).

لتلخيص, هذا البروتوكول يظهر أداة بسيطة وفعالة لاختبار النشاط الأيضي للخلايا البشرية القاتلة الطبيعية مع محلل تدفق خارج الخلية. يمكن استخدام هذه الطريقة لاستجواب الحالة الأيضية في هذه الخلايا ، والتي من المعروف أن تتغير مع تنشيط الخلايا عن طريق تحفيز السيتوكين أو في ظل ظروف مرضية معينة ، بما في ذلك السمنة أو السرطان أو العدوى الفيروسية28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور مايكل ن. ساك (المعهد الوطني للقلب والرئة والدم) على الدعم والمناقشة. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل برامج البحوث داخل الأمعاء من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم. ويدعم JT من قبل برنامج رامون y Cajal (منحة RYC2018-026050-I) من MICINN (إسبانيا).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 160، الخلايا القاتلة الطبيعية، التمثيل الغذائي، تدفق خارج الخلية، تحلل، الميتوكوندريا، التنفس، سلسلة نقل الإلكترون، تدفق الخلايا
تحليل استقلاب الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton,… More

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter