In dit artikel beschrijven we een methode om glycolyse en mitochondriale ademhaling te meten in primaire menselijke Natural Killer (NK) cellen geïsoleerd van perifeer bloed, in rust of na IL15-geïnduceerde activering. Het beschreven protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid tot primaire menselijke NK-cellen die worden geactiveerd door andere cytokines of oplosbare stimuli.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van human natural killer cell metabolisme
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Natural Killer (NK) cellen bemiddelen voornamelijk aangeboren anti-tumor en anti-virale immuunreacties en reageren op een verscheidenheid van cytokinen en andere stimuli ter bevordering van overleving, cellulaire proliferatie, productie van cytokinen zoals interferon gamma (IFNγ) en / of cytotoxiciteit programma's. NK celactivering door cytokine stimulatie vereist een aanzienlijke remodellering van metabole trajecten ter ondersteuning van hun bio-en bio-synthetische eisen. Er is een grote hoeveelheid bewijs dat suggereert dat verminderde NK celmetabolisme wordt geassocieerd met een aantal chronische ziekten, waaronder obesitas en kanker, die het klinische belang van de beschikbaarheid van een methode om NK celmetabolisme te bepalen benadrukt. Hier beschrijven we het gebruik van een extracellulaire flux analyzer, een platform dat real-time metingen van glycolyse en mitochondriaal zuurstofverbruik mogelijk maakt, als een hulpmiddel om veranderingen in het energiemetabolisme van menselijke NK-cellen te monitoren. De hier beschreven methode maakt het ook mogelijk om metabole veranderingen te monitoren na stimulatie van NK-cellen met cytokines zoals IL-15, een systeem dat momenteel wordt onderzocht in een breed scala aan klinische studies.
Inleiding
Natural Killer (NK) cellen zijn aangeboren lymfocyten die anti-tumor en anti-virale reacties bemiddelen. NK-cellen bestaan uit 5-15% van alle lymfocyten in menselijk perifeer bloed, en kunnen ook worden gevonden in milt, lever, beenmerg en lymfeklieren. NK-cellen drukken geen polymorfe clonotyp receptoren uit, zoals T-celreceptoren (TCR) of B-celreceptoren (BCR). De activering van hun cytolytische functies daarentegen wordt ingegeven door de betrokkenheid van receptoren die onveranderlijke liganden herkennen op het oppervlak van een doelcel1,2.
Rustende menselijke NK cellen geïsolee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes van medisch onderzoek van de Verklaring van Helsinki. Perifere bloedmonsters van donoren werden verkregen van de NIH Department of Transfusion Medicine onder het 99-CC-0168 IRB goedgekeurde protocol, met schriftelijke toestemming van de patiënt.
1. Reagenspreparaat
-
Reagentia voor de isolatie van NK cellen
OPMERKINGEN: Bereid deze reagentia voor in een celcultuurkap.- Maak NK scheidingsbuffer voor: Supplement PBS (pH 7.4) met 1 mM EDTA en 2% Foetale kalfsserum (FCS) dat eerder is geïnactiveerd (bij 56 °C gedurende 30 min).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Isolatie van NK-cellen uit perifeer bloed zorgt voor een zuivere en levensvatbare populatie
De extracellulaire fluxtest is gebaseerd op de meting van de H+ en O2-concentratie in de put en zal geen onderscheid maken tussen verschillende populaties cellen of hun levensvatbaarheid. Om deze reden was het verkrijgen van een zeer zuivere en levensvatbare populatie van de cel van belang de belangrijkste stap om te slagen in deze experimenten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit document hebben we een protocol opgesteld voor het efficiënt isoleren en kweken van zuivere en levensvatbare primaire menselijke NK-cellen uit perifeer bloed. We hebben ook de voorwaarden geoptimaliseerd voor de meting van de metabolische activiteit van deze NK cellen beoordeeld door zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring met behulp van een extracellulaire flux analyzer. In vergelijking met andere respirometrische methoden, de extracellulaire flux analyzer is snel, vereist kleine aantallen cellen, en maakt .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) voor steun en discussie. Deze studie werd ondersteund door de intramurale onderzoeksprogramma's van de National Institutes of Health, National Cancer Institute en National Heart, Lung, and Blood Institute. JT wordt ondersteund door het Ramon y Cajal programma (grant RYC2018-026050-I) van MICINN (Spanje).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
| 96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
| Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
| CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay voor DNA kwantificering. Bevat cell-lysis buffer en CyQUANT GR kleurstof |
| EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolatie uit PBMC's |
| EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolatie uit PBMC's |
| EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolatie uit PBMC's |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK cell scheidingsbuffer |
| FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
| Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell scheiding |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell scheidingsbuffer |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analyse | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component van mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Gebruik in RIPA lysis buffer |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulatie |
| Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell cultuurmedium supplement |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell cultuurmedium |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component van stress test media |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viabiliteitskleurstof voor flow cytometry staining |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMC's scheiding uit menselijk bloed |
| Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
| Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
| Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
| Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell scheidingsbuffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Voor bepaling van eiwitconcentratie |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cel lysis |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller voor de Seahorse XFe96 Analyzer | |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | Voor data analyse | |
| Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay basismedium |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Bevat 20 XF96 celcultuurplaten, 18 XFe96 sensor cartridges, belastingsgidsen voor het overbrengen van verbindingen naar de testcartridge en 1 fles calibratieoplossing (500 ml). |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | Voor de bereiding van de Cell-Tak oplossing |
| Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component van mitochondrial stress test medium |
Referenties
- Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
