Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse van human natural killer cell metabolisme

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/61466
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

In dit artikel beschrijven we een methode om glycolyse en mitochondriale ademhaling te meten in primaire menselijke Natural Killer (NK) cellen geïsoleerd van perifeer bloed, in rust of na IL15-geïnduceerde activering. Het beschreven protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid tot primaire menselijke NK-cellen die worden geactiveerd door andere cytokines of oplosbare stimuli.

Abstract

Natural Killer (NK) cellen bemiddelen voornamelijk aangeboren anti-tumor en anti-virale immuunreacties en reageren op een verscheidenheid van cytokinen en andere stimuli ter bevordering van overleving, cellulaire proliferatie, productie van cytokinen zoals interferon gamma (IFNγ) en / of cytotoxiciteit programma's. NK celactivering door cytokine stimulatie vereist een aanzienlijke remodellering van metabole trajecten ter ondersteuning van hun bio-en bio-synthetische eisen. Er is een grote hoeveelheid bewijs dat suggereert dat verminderde NK celmetabolisme wordt geassocieerd met een aantal chronische ziekten, waaronder obesitas en kanker, die het klinische belang van de beschikbaarheid van een methode om NK celmetabolisme te bepalen benadrukt. Hier beschrijven we het gebruik van een extracellulaire flux analyzer, een platform dat real-time metingen van glycolyse en mitochondriaal zuurstofverbruik mogelijk maakt, als een hulpmiddel om veranderingen in het energiemetabolisme van menselijke NK-cellen te monitoren. De hier beschreven methode maakt het ook mogelijk om metabole veranderingen te monitoren na stimulatie van NK-cellen met cytokines zoals IL-15, een systeem dat momenteel wordt onderzocht in een breed scala aan klinische studies.

Introduction

Natural Killer (NK) cellen zijn aangeboren lymfocyten die anti-tumor en anti-virale reacties bemiddelen. NK-cellen bestaan uit 5-15% van alle lymfocyten in menselijk perifeer bloed, en kunnen ook worden gevonden in milt, lever, beenmerg en lymfeklieren. NK-cellen drukken geen polymorfe clonotyp receptoren uit, zoals T-celreceptoren (TCR) of B-celreceptoren (BCR). De activering van hun cytolytische functies daarentegen wordt ingegeven door de betrokkenheid van receptoren die onveranderlijke liganden herkennen op het oppervlak van een doelcel1,2.

Rustende menselijke NK cellen geïsoleerd uit perifeer bloed kan overleven voor meerdere dagen in cultuur medium aangevuld met menselijk serum. Activering van NK-cellen door cytokinen zoals IL-15 of IL-2 drijft de cellen tot proliferatie en tot een toename van hun moordvermogen, onder andere effecten3,4,5. Verschillende studies hebben een directe correlatie aangetoond tussen NK-celactivering en veranderingen in hun metabolische activiteit6. Deze metabolische veranderingen zijn bestemd om te voldoen aan de specifieke eisen van de cellen in termen van energie en biosynthese.

Aërobe cellen en organismen verkrijgen energie door middel van een reeks chemische reacties die de katabolisme en oxidatie van koolhydraten, vet en eiwitten te betrekken. Door een combinatie van glycolyse, de tricarboxylzuurcyclus (TCA) en oxidatieve fosforylatie voldoen eukaryotische cellen aan de meerderheid van hun ATP-vraag en verkrijgen ze tussenproducten die nodig zijn als bouwstenen voor macromolecules die essentieel zijn voor celgroei en proliferatie. Het proces van glycolyse (figuur 1A) begint met de invoer van glucose in de cel. In de cytosol wordt glucose gefossyleerd en omgezet in pyruvaat (met een nettoproductie van 2 moleculen ATP per glucosemolecuul), die kunnen worden gereduceerd tot lactaat of getransporteerd naar de mitochondriën om te worden omgezet in Acetyl-CoA en de TCA-cyclus binnen te gaan. De TCA-cyclus blijft fietsen gevoed met meer moleculen van Acetyl-CoA en produceert CO2 (die uiteindelijk buiten de cel zal verspreiden en, door te reageren met H2O in het medium, zal genereren koolzuur dat zal leiden tot de verzuring van het medium) en NADH, het molecuul belast met het doneren van elektronen aan de elektronentransportketen (ETC). De elektronen reizen door verschillende eiwitcomplexen en worden uiteindelijk geaccepteerd door zuurstof. Deze complexen (I, III en IV) pompen ook H+ van de mitochondriale matrix in de intermembrane ruimte. Als gevolg van de elektrochemische gradiënt gegenereerd, zal de H+ opnieuw in de matrix via de complexe V (ATP-synthase), het investeren van de potentiële energie verzameld in de generatie van ATP.

Zowel glycolyse als mitochondriale ademhaling kunnen op verschillende punten worden geblokkeerd met behulp van remmers. De kennis en het gebruik van deze remmers was de basis voor de ontwikkeling van de extracellulaire fluxtest. Door twee eenvoudige parameters in real time te meten, zoals pH en zuurstof, leidt de extracellulaire flux analyzer de snelheid van glycolyse en mitochondriale ademhaling af in een 96-put plaat. De glycolysestresstest wordt uitgevoerd in een basaal medium zonder glucose (figuur 1B)7. De eerste metingen van de extracellulaire verzuring (ECAR) zijn indicatief voor glycolyse-onafhankelijke verzuring. Het wordt aangeduid als niet-glycolytische verzuring en correleert met CO2 geproduceerd door de TCA die, zoals eerder uitgelegd, combineert met H2O in het medium om H+ (TCA-gekoppelde ECAR) te genereren. De eerste injectie is glucose om glucosegebruik te induceren en glycolyse te stimuleren. De tweede injectie combineert zowel rotenone, een Complexe I-remmer, en antimycine A, een Complexe III-remmer samen, om de ETC. Cellen te blokkeren reageren op deze dramatische afname van mitochondriale ATP-productie door het activeren van glycolyse om cellulaire ATP-niveaus te handhaven, en dit vertegenwoordigt de hoeveelheid glycolyse die niet wordt gebruikt door de cel in de basale toestand, maar mogelijk kan worden aangeworven als reactie op de toename van de ATP-vraag (compenserende glycolyse). De derde injectie is de glucose analoge 2-Deoxyglucose (DG), die concurreert met glucose als substraat voor het enzym hexokinase. Het product van deze fosforylatie, 2-deoxyglucose-6-fosfaat kan niet worden omgezet in pyruvaat, en daarom glycolyse wordt geblokkeerd, waardoor de ECAR tot zijn minimum wordt beperkt. De op dit punt gemeten ECAR omvat andere bronnen van extracellulaire verzuring die niet worden toegeschreven aan glycolyse of ademhalingsactiviteit, evenals eventuele resterende glycolyse die niet volledig door 2-DG (post 2-DG-verzuring) wordt geremd.

De mitochondriale stresstest wordt uitgevoerd in een medium met glucose (figuur 1C)8. De eerste metingen van het zuurstofverbruik (OCR) komen overeen met de basislijn van mitochondriale ademhaling (basale ademhaling). De eerste injectie is oligomycine, die de terugkeer van protonen via de ATP-synthase (complex V) remt, de ATP-synthese blokkeert en zo snel het mitochondriale membraan hyperpolariseert, wat verdere protonpompen door ademhalingscomplexen voorkomt en leidt tot een afname van OCR. De vergelijking tussen de basisinademing en de waarde die wordt gegeven door toevoeging van oligomycine vertegenwoordigt de atp-gekoppelde ademhaling. De resterende oligomycine-ongevoeligheidsgraad van zuurstofverbruik wordt protonlek genoemd, dat de stroom van protonen door de lipidebilayer of eiwitten in het binnenste mitochondriale membraan vertegenwoordigt, zoals de adenine nucleotide translocase9. De tweede injectie is de ontkoppelaar 2,4-dinitrophenol (DNP), een ionofoër die een massale binnenkomst van H+ in de mitochondriale matrix induceert, wat leidt tot depolarisatie van het mitochondriale membraan en verstoring van mitochondriale ATP-synthese. Cellen reageren op de dissipatie van de proton-bewegingskracht door het verhogen van de snelheid van elektronentransport en zuurstofverbruik tot maximale niveaus in een vergeefse poging om membraan potentieel (maximale ademhalingscapaciteit) te herstellen. Het verschil tussen de maximale ademhalingscapaciteit en de basale ademhaling is de reserveademhalingscapaciteit van de cel, die de hoeveelheid ademhaling vertegenwoordigt die niet door de cel wordt gebruikt om ATP in de basale toestand te genereren, maar mogelijk kan worden aangeworven als reactie op een toename van de ATP-vraag of onder stressomstandigheden8. De derde injectie is een combinatie van rotenone en antimycine A. Deze injectie stopt volledig de ETC en OCR daalt tot het laagste niveau, met de resterende zuurstofverbruik wordt niet-mitochondriaal (veroorzaakt door NADPH-oxidases, enz.).

Veranderingen in metabole trajecten kunnen op de een of andere manier de werking van NK-cellen voorspellen, omdat is gesuggereerd dat continue activering van NK-cellen met cytokines in vitro kan leiden tot NK-celuitputting door de studie van verschillende metabole trajecten10,11. De correlatie tussen NK cel metabolische status en functie is zeer belangrijk vanuit het oogpunt van kanker immunotherapie. Op dit gebied is de activering van NK-cellen met infusie van IL-15, alleen of in combinatie met monoklonale therapeutische antilichamen getest om het doden van tumorcellen12,13,14te verbeteren . De kennis van de metabolische status van de NK-cellen in reactie op deze behandelingsstrategieën zou een waardevolle voorspeller zijn van de NK-celactiveringsstatus en de moordfunctie.

De studie van metabole trajecten in andere myeloïde en lymfoïde cellen zoals monocyten, T- en B-cellen is beschreven15 en geoptimaliseerde methoden zijn gepubliceerd16. In dit protocol bieden we een methode die zowel een NK isolatieprotocol combineert dat hoge aantallen zuivere en levensvatbare NK-cellen oplevert als een geoptimaliseerd protocol om metabole activiteit te meten met behulp van een extracellulaire flux analyzer. Hier tonen we aan dat dit een geldige methode is voor de studie van metabole veranderingen in rust en IL-15 geactiveerde menselijke NK cellen. Voor de extracellulaire fluxtest zijn parameters zoals celnummer en medicijnconcentraties getest en geoptimaliseerd. Vergeleken met andere respirometrische methoden, de extracellulaire flux analyzer is volledig geautomatiseerd en in staat om te testen in real time, met zeer lage hoeveelheden cellen, tot 92 monsters tegelijk, en dus maakt hoge doorvoer screenings (met meerdere monsters en repliceert) in een relatief snelle manier17.

Deze methode kan worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het beoordelen van NK celfunctie door het bestuderen van NK celmetabolisme. Het kan ook worden toegepast op cellen geactiveerd door andere cytokinen, antilichamen of oplosbare stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes van medisch onderzoek van de Verklaring van Helsinki. Perifere bloedmonsters van donoren werden verkregen van de NIH Department of Transfusion Medicine onder het 99-CC-0168 IRB goedgekeurde protocol, met schriftelijke toestemming van de patiënt.

1. Reagenspreparaat

  1. Reagentia voor de isolatie van NK cellen
    OPMERKINGEN: Bereid deze reagentia voor in een celcultuurkap.
    1. Maak NK scheidingsbuffer voor: Supplement PBS (pH 7.4) met 1 mM EDTA en 2% Foetale kalfsserum (FCS) dat eerder is geïnactiveerd (bij 56 °C gedurende 30 min).
    2. Bereid NK cultuurmedium voor: Supplement Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) met 10% Human Serum (HS). Steriel filter en op te slaan bij 2-8 °C. Verwarm het medium tot 37 °C alvorens toe te voegen aan de cellen.
    3. Resuspend Human IL-15 in PBS op 200 μg/mL.
  2. Reagentia voor extracellulaire fluxtest
    1. Bereid testmedia voor: Voeg voor mitochondriale stresstestmedium 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine en 10 mM glucose toe aan het basismedium; voeg voor glycolyse stresstestmedium 2 mM L-glutamine toe aan het basismedium.
      OPMERKING: De concentraties glucose, pyruvaat en glutamine worden geleverd zoals aanbevolen door de fabrikant van extracellulaire fluxanalysator. Echter, media samenstelling kan worden gewijzigd door onderzoekers om perfect te passen bij die van het cultuurmedium, indien gewenst.
    2. Pas de pH van beide media aan op 7,4 met 0,1 N NaOH met een benchtop pH-meter, steriel filter door een poriegrootte van 0,2 μM en op te slaan bij 2-8 °C. Verwarm de media tot 37 °C, controleer de pH en bij te passen tot 7,4 voor gebruik indien nodig.
      LET OP: Alleen omgevingsCO2 is opgenomen in de atmosfeer van de extracellulaire flux analyzer, het gebruik van media zonder bicarbonaat is van cruciaal belang.
    3. Bereid voorraadoplossingen voor reagentia voor: Oligomycine (ATP synthase inhibitor), 10 mM stock solution in DMSO; 2,4-dinitrophenol (DNP, ontkoppel), 1 M voorraadoplossing in DMSO; antimycine A (complexe III-remmer), 10 mM-voorraadoplossing in DMSO; rotenone (complex I inhibitor), 10 mM voorraadoplossing in DMSO. Maak 30 μL aliquots van alle reagentia en bewaar bij -20 °C.
      OPMERKING: Deze richtlijnen zijn bedoeld voor reagentia die individueel zijn gekocht en door de onderzoeker zijn voorbereid. Als reagentia in plaats daarvan worden gekocht bij de fabrikant van de analysator, volgt u hun richtlijnen voor de voorbereiding van reagens.

2. NK-cellenisolatie van perifeer bloed

  1. Perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's) preparaat uit menselijk bloed
    OPMERKING: Voer deze stappen uit in een celcultuurkap. Ontsmetting van alle residuen en materiaal in contact met bloed met bleekmiddel en gooi ze in de juiste container te verbranden.
    1. Pipette 20 mL lymfocyten scheidingsmedium (LSM) in een conische buis van 50 mL.
    2. Voorzichtig, terwijl de buis in een hoek van 30°, pipet 20 mL bloed over de LSM, zeer voorzichtig en het aanraken van de wand van de buis. Vermijd het mengen van bloed met de LSM en maak een zichtbare en goed gedefinieerde interfase tussen de twee vloeistoffen.
      LET OP: Perifeer bloed of verrijkte leukaferese producten kunnen worden gebruikt.
    3. Centrifugeren de buizen gedurende 25 min, 1000 x g bij kamertemperatuur. Gebruik geen rem, omdat het beide fasen in de buis (LSM en bloed) zou kunnen laten mengen.
    4. Haal de buizen voorzichtig uit de centrifuge en leg ze in een rek. Controleer op de aanwezigheid van een opvallende laag cellen (mononucleaire cellen) die zich in de interfase tussen LSM (helder) en plasma (geel) zal vormen, terwijl rode bloedcellen aan de onderkant van de buis pellet.
    5. Draag de mononucleaire cellaag voorzichtig aan met een 10 mL plastic pipet (ongeveer 5-8 mL) en plaats deze in een nieuwe conische buis van 50 mL. De lymfocyten interfase van maximaal 2 verschillende buizen kan samen worden samengevoegd.
    6. Was de mononucleaire cellen 2x door resuspending in 45 mL PBS en centrifugeren op 800 x g gedurende 5 minuten, bij kamertemperatuur.
      LET OP: Na deze stap wordt een pellet van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) verkregen en kan de onderzoeker overgaan tot de NK isolatiestap.
  2. NK isolatie van PBMCs
    1. Tel de cellen van 2.1.6 en verstig ze opnieuw in NK Separation Buffer (1x 108 PBMCs/mL).
    2. Neem 10 mL van de cel resuspension (109 PBMCs) en plaats ze in een 50 mL buis.
    3. Voeg 500 μL (50 μL/mL buffer) van NK celisolatie antilichaam mix en 10 μL (1 μL/ mL buffer) van anti-CD3 positieve isolatie antilichaam mix aan de PBMCs en incbaat bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
    4. Draai de magnetische kralen en voeg 1 mL toe aan de mix van PBMCs met antilichamen (100 μL kralen/ml PBMCs). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met af en toe roeren.
    5. Voeg 35 mL NK isolatiebuffer (3,5 ml buffer/ml PBMCs) toe, meng en plaats op de magneet gedurende 15 min (2,2 x 107 PBMCs/mL). Na die tijd zullen de kralen en cellen positief geselecteerd (alle, behalve NK cellen) zich aan de wanden van de buis hebben gehouden.
    6. Verzamel de supernatant (met NK-cellen) voorzichtig met een 50 mL plastic pipet zonder de zijkanten of de onderkant van de buis aan te raken.
    7. Tel de cellen met behulp van een cel teller en centrifuge op 800 x g gedurende 5 min.
    8. Resuspend isoleerde NK-cellen op 5 x 106 cellen/mL in IMDM met 10% GS en plaats ze in een couveuse op 37 °C met 5% CO2 totdat het experiment wordt uitgevoerd.
      LET OP: In dit NK isolatieprotocol worden celnummers en reagensvolumes aangepast voor het gebruik van een buis van 50 mL en een grote magneet. Dit protocol kan worden opgeschaald (in het geval er meer PBMCs worden verkregen) door de isolatiestappen in verschillende buizen te herhalen of te verkleinen door het volume in de buis te verminderen. Voor de uiteindelijke volumes van 14-45 mL wordt een 50 mL polystyreenbuis gebruikt, voor volumes 4-14 wordt een 15 mL polystyreenbuis gebruikt en voor volumes 1-4 mL wordt een 5 mL polystyreenbuis gebruikt. De magneet is anders en past in elk geval op de juiste buis. De hoeveelheid antilichaammix en magnetisch kralen kan ook worden geschaald op basis van het aantal cellen en het uiteindelijke volume.
  3. NK celpopulatie kleuring voor stroomcytometrie
    1. Neem 0,25 x 106 cellen per monster uit stap 2.2.8, verwijder het medium door 800 x g gedurende 5 minuten te centreren bij kamertemperatuur en de celpellet opnieuw te openen in 500 μL PBS.
    2. Voeg levensvatbaarheidskleurstof toe volgens de aanbeveling van de fabrikant (1 μL dmso-gereconstitueerde kleurstof tot 1 mL celverzuim) en broed bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    3. Was 2x door resuspending in 5 mL PBS en centrifugeren op 800 x g gedurende 5 minuten, bij kamertemperatuur.
    4. Vlek met de overeenkomstige anti-menselijke antilichamen in 100 μL IMDM met 10% GS gedurende 30 minuten op ijs beschermd tegen licht (zie tabel 1). Alle antilichamen kunnen worden gecombineerd en gebruikt in een enkele kleuring stap.
    5. Analyseer de monsters door stroomcytometrie om de zuiverheid van de verkregen NK-celpopulatie te evalueren. Gebruik de celgating- en analysemethode die eerder is beschreven18,19.
  4. NK cellen stimulatie met oplosbare IL-15
    1. Resuspend 0,75 x 106 cellen uit stap 2.2.8 of 2.4.3 in 100 μL IMDM met 10% GS in een put van een 96 well-plate (ronde onder).
    2. Verdun menselijke IL-15 tot 1 μg/mL in IMDM met 10% GS. Voeg 100 μL van de verdunde menselijke IL-15 toe aan de cellen om een uiteindelijke concentratie van 0,5 μg/mL te bereiken.
      OPMERKING: 0,5 μg/mL is een verzadigende concentratie van IL-15. Lagere concentraties van IL-15 of andere cytokinen zoals IL-2, IL-12 of IL-18 kunnen indien gewenst door onderzoekers worden getest.
    3. Plaats de cellen in de couveuse op 37 °C en stimuleer gedurende 48 uur voordat u de extracellulaire fluxtest uitvoert. Niet-geprisuleerde (controle)cellen opnieuw opschort met dezelfde concentratie en volume in IMDM met 10% GS zonder IL-15, en plaats ze 48 uur in dezelfde incubator.

3. Hydratatie van sensorcartridge

OPMERKING: De 96 sondetips van de sensorcartridge bevatten individuele solid-state fluoroforen voor O2 en H+ die gehydrateerd moeten worden om veranderingen in O2 en pH te detecteren.

  1. Zet de analyzer aan en laat hem opwarmen tot 37 °C.
  2. Open het sensorcartridgepakket en scheid de sensorcartridge van de hulpplaat. Voeg 200 μL van de calibrantoplossing toe in elke put van de hulpplaat en zet de sensorcartridge terug op de plaat, waarbij wordt gevalideerd dat de sensoren volledig in de oplossing zijn ondergedompeld. Voor optimale resultaten ontvoed de cartridge 's nachts bij 37 °C in een CO2-vrijeincubator die goed bevochtigd is om verdamping te voorkomen. Voorkom bellenvorming onder de sensoren tijdens hydratatie.
    LET OP: De minimale hydratatietijd van de cartridge is 4 uur bij 37 °C in een CO2-vrijecouveuse. U ook 's nachts hydratatie van de sensorcartridge met 200 μL steriel water bij 37 °C in een CO2-vrijeincubator, gevolgd door een incubatie van de sensorcartridge met 200 μL voorverwarmde calibranteoplossing 45 – 60 min vóór het begin van de run, worden gebruikt.

4. Extracellulaire fluxtest

  1. Bereiding van met lijm beklede platen
    OPMERKING: Aangezien de meting van metabolische parameters plaatsvindt in een microkamer gevormd aan de onderkant van de 96-bronplaat, moeten suspensiecellen eerst aan de onderkant van de put worden vastgetrokken. Er wordt gebruik genomen van een cellijm uit de mossel Mytilus edulis. De fabrikant van de cellijm beveelt een coatingconcentratie van 1 tot 5 μg/cm2aan. De put van de analysecelkweek microplaat heeft een oppervlak van ongeveer 0,110 cm2. Voor een concentratie van 5 μg/cm2 is dus ongeveer 0,55 μg lijm nodig. Aangezien 25 μL van de lijmoplossing zal worden gebruikt om elke put te coaten, is de optimale concentratie van lijmoplossing voor de analysecelkweek microplaten ongeveer 22,4 μg/mL (22,4 μg/mL x 0,025 mL = 0,56 μg).
    1. Bereid 2,5 mL celkleefoplossing (22,4 μg/mL) voor in 0,1 M natriumbicarbonaat, pH 8.0. Bicarbonaat biedt de optimale pH voor celaanhangende prestaties die volgens de fabrikant tussen de 6,5 en 8,0 ligt.
    2. Pipette 25 μL van de celkleefoplossing voor elke put van de testplaat en incubbate bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Verwijder daarna de oplossing en was 2x met 200 μL steriel water/put. Laat de putten drogen door de plaat 15 minuten open te houden in een celkweekkap.
      LET OP: Gecoate platen mogen maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
  2. Celzaaien in platen bekleed met lijm
    1. Centrifugecellen van stap 2.4.3 bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatants en was cellen in opgewarmde mitochondriale stresstest medium (als een mitochondriale stresstest wordt uitgevoerd) of glycolyse stress test medium (als een glycolyse stress test wordt uitgevoerd). Pelletcellen opnieuw en opnieuw opsplitsen naar de voorkeurscelconcentratie in hetzelfde medium (resuspensievolume is afhankelijk van de gekozen celconcentratie; aangezien elke put 180 μL van de celsuspensie zal bevatten, bereid 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106, 2,08 x 106, 4,17 x 106 en 8,33 x 10 6 cellen/mL-celsuspensie voor10 0,047 x 106, 0,094 x 106,0,187 x 106, 0,375 x 106, 0,75 x 106 en 1. 5 x10 6 cellen per put respectievelijk).
    2. Plaat 180 μL celsuspensie per put langs de zijkant van elke put. Een meerkanaals pipet wordt aanbevolen. Gebruik putten A1, A12, H1 en H12 van de analyzer kweekplaat als controleputten voor achtergrondcorrectie. Voeg 180 μL van het testmedium toe in deze putten (geen cellen). Extra controleputten kunnen indien gewenst worden gebruikt en als er voldoende ruimte in de plaat zit.
      OPMERKING: De aanwezigheid van serum kan een slechte celbevestiging veroorzaken.
    3. Incubeer de plaat 30 min bij 37 °C in een CO2-vrijecouveuse. Bereid ondertussen 10x verbindingen voor (zie stap 4.3 hieronder).
    4. Wijzig de instellingen voor centrifugeren in nul remmen. Centrifugeren de plaat op 200 x g gedurende 5 minuten. Observeer de cellen onder de microscoop om te controleren of ze een monolaag vormen aan de onderkant van de put. Breng de platen 25 minuten terug naar de CO2-vrijecouveuse. Voor de beste resultaten mag de totale tijd na beplating niet groter zijn dan ongeveer 1 uur.
  3. Voorbereiding van 10x werkende oplossingen om in sensorcartridge te laden
    OPMERKING: Elk van de 96 sondetips van de sensorcartridge herbergt 4 poorten (A, B, C en D) die kunnen worden gebruikt om verbindingen sequentieel in afzonderlijke putten te injecteren.
    1. Om mitochondriale stresstest uit te voeren, bereidt u 2,5 mL elk van 10 μM oligomycine, 1 mM DNP en een mengsel van 10 μM rotenone en 10 μM antimycine A, in mitochondriaal stresstestmedium (gebruik de voorraadoplossingen vanaf stap 1.2.3). De uiteindelijke concentraties in de put na injectie zijn 1 μM oligomycine, 0,1 mM DNP en 1 μM antimycine A/rotenone.
    2. Om glycolyse stresstest uit te voeren, bereidt u 2,5 mL van een mengsel van 10 μM rotenone en 10 μM antimycine A in glycolyse stress testmedium (gebruik de voorraadoplossingen vanaf stap 1.2.3). Los glucose op in glycolyse stresstest medium voor een 100 mM oplossing en 2-deoxy-glucose (2-DG) in glycolyse stress test medium voor een 500 mM oplossing. De uiteindelijke concentraties in de put na injectie zijn 10 mM glucose, 1 μM antimycine A/rotenone en 50 mM 2-DG.
    3. Verwarm de oplossingen tot 37 °C, controleer de pH en bijstel indien nodig naar 7,4. Laadverbindingen bereid in stap 4.3.1. (voor een mitochondriale stresstest) of 4.3.2 (voor een glycolysestresstest) in de poorten A, B en C van de gehydrateerde sensorcartridge (vanaf stap 3.2) met behulp van een micropipettor met meerdere kanalen en de poortbeladingshulplijnen die bij de cartridge zijn voorzien, zoals aangegeven in tabel 2.
      OPMERKING: Om tijdens de test een goede injectie in alle putten te garanderen, moet elke reeks poorten die worden gebruikt (bijvoorbeeld alle poorten A) hetzelfde injectievolume bevatten over de gehele sensorcartridge. Dit geldt voor achtergrondcorrectie putten en zelfs voor die putten niet gebruikt in het experiment.
    4. Incubeer de geladen sensorcartridge bij 37 °C in een CO2-vrijeincubator tijdens het opzetten van het programma.
  4. Extracellulaire fluxtestprotocollen instellen
    1. Open de extracellulaire flux analyzer software, en met behulp van de Groep Definities en Plate Map tabbladen geven groepen van putten die vergelijkbare voorwaarden hebben (bijvoorbeeld putten met hetzelfde aantal cellen, of putten met rustende cellen of IL-15-gestimuleerd cellen). Geef ook achtergrondcorrectieputten aan (standaard A1, A12, H1 en H12 worden ingesteld, maar extra putten kunnen worden gebruikt) en lege putten.
    2. Stel het programma in dat in tabel 3 in de software wordt beschreven met behulp van het tabblad Protocol.
    3. Begin het programma met het tabblad Assay uitvoeren. Plaats de sensorcartridge (gehydrateerd en geladen met 10x verbindingen) en hulpplaat op de lade. Vervang na de kalibratiestap (15 – 20 min) desgevraagd de rembrantplaat voor de testplaat (zonder deksel) door bijgevoegde cellen. Hierna is de run volledig geautomatiseerd (de machine voert alle metingen en injecties uit).
      OPMERKING: Het is mogelijk om een mitochondriale stresstest en een glycolytische stresstest uit te voeren in dezelfde plaat, zolang de specifieke verbindingen in de juiste poorten worden geladen (oligomycine, DNP en antimycine/rotenone in havens A, B en C respectievelijk van de putten waar een mitochondriale stresstest wordt uitgevoerd; glucose, antimycine/rotenone en 2-DG in de havens A, B en C van respectievelijk de putten waar een glycolyse stresstest wordt uitgevoerd), dezelfde volumes voor injecties worden gebruikt in elke reeks poorten en putten voor elke test worden correct geïdentificeerd met behulp van de groepsdefinities en de lipjes van de kaart van de software.
    4. Na de voltooiing van de run, haal de gegevens op en analyseer ze met behulp van de software.

5. Bepaling van het celnummer

OPMERKING: De resultaten kunnen worden genormaliseerd om rekening te houden met mogelijke verschillen in celnummer. Twee belangrijke benaderingen die hieronder worden beschreven, kunnen worden gebruikt.

  1. DNA-inhoud bepaling
    1. Verwijder het resterende testmedium met een pipet uit elke put. Let er bij het oppirerend medium op dat de cellen niet storen. De plaat kan worden opgeslagen bij -20 °C tot analyse.
      LET OP: De vriesstap is belangrijk voor de efficiënte cellyse en DNA-inhoudsbepaling.
    2. Bereid een 1x oplossing voor van celproliferatietestcellysebuffer (20x) in gedestilleerd water (200 μL/well).
    3. Voeg de cel proliferatie test kleurstof voorraad oplossing (400x) in de 1x cel-lyse buffer. Voor de detectie van 50 tot 50.000 cellen per put, gebruik 1x cel proliferatie testkleurstof. Voor hogere celnummers wordt het gebruik van de celproliferatieteststof bij een uiteindelijke concentratie hoger dan 1x aanbevolen. Gebruik in dit geval de celproliferatieteststof bij een 5x eindconcentratie (verdun de celproliferatietestvoorraadoplossing 80-voudig in 1x cellysebuffer).
    4. Voeg 200 μL van de celproliferatietestreage aan elke put toe. Incubeer de monsters gedurende 2-5 min bij kamertemperatuur. Bescherm tegen licht.
    5. Meet de fluorescentie van de monsters bij excitatie: 480 nm; emissie: 520 nm met behulp van een fluorescentie microplate lezer volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  2. Bepaling van het eiwitgehalte
    1. Voorzichtig, aspirate volledig de test medium van elke put zonder het aanraken van de cellen en bevriezen van de cellen op -20 °C voor ten minste 1 uur. Als alternatief kunnen de cellen langer (tot 1 week) bevroren worden bewaard totdat de analyse wordt uitgevoerd.
    2. Voeg 50 μL radioimmunoprecipitatietest (RIPA) lyse medium toe aangevuld met 1x proteaseremmers (van een 100x voorraadoplossing) aan elke put. Plaats de plaat 5 minuten op een shaker bij kamertemperatuur en broed de plaat vervolgens 30 minuten op ijs voor een volledige cellyse.
    3. Centrifugeren de plaat gedurende 5 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur. Deze stap zal pellet cellulaire puin om interferentie met de eiwitmeting te voorkomen.
    4. Meet de eiwitconcentratie door bicinchoninic acid (BCA) test volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolatie van NK-cellen uit perifeer bloed zorgt voor een zuivere en levensvatbare populatie

De extracellulaire fluxtest is gebaseerd op de meting van de H+ en O2-concentratie in de put en zal geen onderscheid maken tussen verschillende populaties cellen of hun levensvatbaarheid. Om deze reden was het verkrijgen van een zeer zuivere en levensvatbare populatie van de cel van belang de belangrijkste stap om te slagen in deze experimenten.

De isolatie van NK-cellen uit perifeer bloed werd uitgevoerd zoals vermeld in sectie 2. Om de zuiverheid en levensvatbaarheid van de verkregen NK-cellen te beoordelen, werden kleine aliquots van PMBC's en de geïsoleerde NK-celpopulatie gekleurd en geanalyseerd door stromingscytometrie (figuur 2A). Mononucleaire cellen werden gated in de plot met voorwaartse (FSC-A) versus zijverstrooiingsgebied (SSC-A). Binnen deze populatie werden enkele cellen afgesloten langs de diagonaal in het perceel met FSC-A versus voorwaartse spreidingshoogte (FSC-H). Binnen de singlet populaties werd de levensvatbaarheid beoordeeld en bleek deze hoger te zijn dan 98% in zowel PMBC's als NK-celpopulaties. De zuiverheid van de geïsoleerde NK-celpopulatie werd vastgesteld door dubbele kleuring tegen CD3 (aanwezig in T-cellen, de dominante populatie onder PBMCS) en CD56 of NKp46 (figuur 2B). NK-cellen worden gedefinieerd als de populatie negatief voor CD3 en positief voor CD56 of NKp46. Volgens deze criteria was de zuiverheid van de NK-cellen ongeveer 88%, wat neerkomt op een 18-voudige verrijking op NK-cellen in vergelijking met die in de PBMCs-populatie.

OCR- en ECAR-waarden zijn afhankelijk van celnummer

Voor de mitochondriale stresstest werden cellen metabolisch verstoord door de toevoeging van drie verschillende verbindingen: oligomycine, DNP en antimycine A + rotenone. Voor elk celtype werd het aantal cellen per put zorgvuldig geoptimaliseerd voor een extracellulair fluxtestexperiment. Figuur 3A toont representatieve percelen van mitochondriaal zuurstofverbruik (OCR) met behulp van verschillende menselijke NK-celnummers (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 en 0,047 x 106). Alle metingen werden gedaan in drievoud. Celnummers correleren lineair met de hoeveelheid DNA of eiwit in de put(figuur 3B). Zoals verwacht vertoonden hoge celnummers hogere OCR-waarden, terwijl minder dan 0,187 x 106 cellen per put geen robuuste resultaten leverden. Aan de andere kant waren hogere celnummers (1,5 x 106) niet optimaal, omdat bij toevoeging van DNP de zuurstofconcentratie in de put in elke cyclus volledig was uitgeput (figuur 3C), wat de nauwkeurige berekening van de OCR uitsluit. De concentratie van ontkoppeld moet zorgvuldig worden getitreerd voor elk celtype, omdat het niet toevoegen van voldoende DNP-resultaten in submaximale OCR, terwijl het toevoegen van te veel kan remmen maximale OCR ook. In menselijke NK-cellen bleek 100 μM DNP de optimale dosis te zijn (figuur 3D). Andere ontkoppelaars zoals carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazone (FCCP) of carbonylcyanide m-chlorofenyl hydrazine (CCCP) mogen worden gebruikt in plaats van DNP, maar zouden ook voor elk celtype moeten worden getitreerd.

Voor de glycolyse stresstest werden na een nulmeting van de ECAR glucose-uitgehongerde cellen verstoord door de volgende verbindingen: glucose, antimycine A + rotenone en 2-DG. Figuur 3E toont representatieve percelen van ECAR met behulp van verschillende NK-cellennummers (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 en 0,047 x 106). Alle metingen werden gedaan in drievoud. De glycolyse stresstest was het meest succesvol bij de hoogste beplatingsdichtheid, terwijl minder dan 0,187 x 106 cellen per put geen robuuste resultaten leverden.

IL-15 behandeling verhoogt OCR en ECAR basale en maximale waarden

De optimale zaaidichtheid van 0,75 x 106 cellen per put werd gebruikt voor latere experimenten. NK-cellen werden gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van verzadigende concentraties van de cytokine IL-15 gedurende 48 uur, waarna hun levensvatbaarheid respectievelijk 93,7 ± 4,8% en 85,7 ± 12,0% bleek te zijn. Figuur 4A,B toont een typisch mitochondriaal stresstestexperiment met 0,75 x 106 NK cellen per put. In deze test leidt oligomycine tot een dramatische afname van het zuurstofverbruik(figuur 4A) en tot een toename van het ECAR dat een overstap naar glycolyse vertegenwoordigt om te proberen cellulaire ATP-niveaus te handhaven (figuur 4B). Activering van de NK-cel door IL-15 veroorzaakte een toename van zowel het mitochondriale zuurstofverbruik als de extracellulaire verzuring. Dit resultaat was consistent toen verschillende proefpersonen werden vergeleken(figuur 4C). Basale, maximale en ATP-gekoppelde ademhaling, maar geen protonlek of niet-mitochondriale ademhaling, verhoogd met IL-15 (Figuur 4C, D). Ook daalde het OCR/ECAR-percentage, wat duidt op een trend om na IL-15 stimulatie over te schakelen naar een glycolytisch metabolisme(figuur 4E).

Figuur 4F,G toont een typisch glycolyse stresstest experiment met 0,75 x 106 NK cellen per put. Toevoeging van glucose veroorzaakte een enorme toename van ECAR als gevolg van glycolyse activering, terwijl de daaropvolgende toevoeging van antimycine A en rotenone compenserende glycolyse veroorzaakte, en 2-DG een remming van het traject en een afname van ECAR tot het minimum veroorzaakte (figuur 4F). Tegelijkertijd veroorzaakte glucose consequent een lichte daling van het zuurstofverbruik, mogelijk door het Crabtree-effect20, terwijl antimycine A en rotenone de ademhaling volledig blokkeerden en 2-DG geen verdere effecten biedt (figuur 4G). Activering van zowel extracellulaire verzuring als mitochondriaal zuurstofverbruik met IL-15 kan ook in deze test worden waargenomen, en ook dit is consistent bij het gebruik van cellen van verschillende donoren(figuur 4H).

Figure 1
Figuur 1: Schematisch van extracellulaire fluxtesten.
aA) Schematisch glycolyse, de tricarboxylzuurcyclus (TCA) en de elektronentransportketen (ETC). Remmers van verschillende stappen zijn geschreven in het rood. De elektronenflux in ETC wordt vertegenwoordigd in groen met NADH als donor en O2 als definitieve acceptor. (B) Glycolyse stresstest schematisch profiel dat de extracellulaire verzuring (ECAR) versus tijd vertegenwoordigt. (C) Mitochondriale stresstest schematisch profiel dat het zuurstofverbruik (OCR) versus tijd vertegenwoordigt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Natural Killer (NK) cellen gezuiverd uit perifere mononucleaire cellen (PBMC's).
aA) De Gating-strategie volgde om de zuiverheid en levensvatbaarheid van NK-cellen (rechterkolom) te beoordelen ten opzichte van het totaal van PBMCs (linkerkolom). Uit de poort van mononucleaire cellen (bovenste panelen) werden enkele cellen geselecteerd (middelste panelen) en werd de levensvatbaarheid gemeten (onderste panelen). (B) Levende cellen werden gekleurd voor CD3 en CD56 of NKp46. De getallen in de deelvensters geven het percentage cellen in de geselecteerde gebieden aan. De resultaten zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Optimalisatie van de mitochondriale en glucosestresstests in geactiveerde menselijke NK-cellen.
(A) Mitochondriale stresstest: OCR voor elke beplatingsdichtheid (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 en 0,047 x 106) wordt weergegeven. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde van 3 putten met standaarddeviatie. De resultaten zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. (B) DNA (bovenste paneel) en eiwit (lager paneel) niveaus in de put bij verschillende beplating dichtheden. De resultaten zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde van 3 putten met standaarddeviatie. De resultaten zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. (C) Ruwe zuurstofgehaltesporen in putten die geen cellen (zwart spoor), 0,75 x 106 cellen (blauw spoor) of 1,5 x 106 cellen (groen spoor) bevatten. In het groene spoor na toevoeging van DNP is zuurstof in elke cyclus volledig uitgeput. (D) De reserveademhalingscapaciteit van 0,75 x 106 cellen werd getest in aanwezigheid van verschillende DNP-concentratie. (E) Glycolyse Stress Test: ECAR voor elke beplatingsdichtheid (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 en 0,047 x 106) wordt weergegeven. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde van 3 putten met standaarddeviatie. De resultaten zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Detectie van metabolische veranderingen na NK-celactivering door IL-15.
Mitochondriale stresstest: OCR (A) en ECAR(B)percelen worden getoond voor 0,75 x 106 rustende of IL-15 geactiveerde cellen. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde van 3 putten met standaarddeviatie. De resultaten zijn representatief voor 5 onafhankelijke experimenten. Basale en maximale ademhalingsveranderingen voor individuele menselijke donor worden weergegeven in (C),terwijl ATP-gekoppelde ademhaling, protonlek, niet-mitochondriale ademhaling (NMR) worden weergegeven in (D)en de OCR/ECAR-verhouding wordt weergegeven in (E). Glycolyse Stress test: ECAR (F) en OCR (G) percelen worden getoond voor 0,75 x 106 rusten of IL-15 geactiveerde cellen. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde van 3 putten met standaarddeviatie. De resultaten zijn representatief voor 5 onafhankelijke experimenten. Basale en maximale extracellulaire verzuring veranderingen voor individuele menselijke donor worden weergegeven in (H). ns: niet significant; * p ˂ 0,05; ** p ˂ 0,01; p ˂ 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Bijdrage van de TCA en glycolyse op ECAR.
De eerste metingen van ECAR komen grotendeels overeen met verzuring als gevolg van de CO2 die in de TCA-cyclus wordt geproduceerd. Na toevoeging van glucose aan brandstofglycolyse vermindert de bijdrage van TCA-afgeleide verzuring aan ECAR. Injectie van Antimycine A en Rotenone blokkeert de TCA, en glycolyse compenseert de toename van de ATP-vraag door te stijgen tot het maximale niveau (compenserende glycolyse). De blokkade van glycolyse door 2-DG vermindert ECAR tot een minimumniveau, wat overeenkomt met verzuring die niet wordt toegeschreven aan glycolyse of ademhalingsactiviteit, evenals eventuele resterende glycolyse die niet volledig door 2-DG (post 2-DG-verzuring) wordt geremd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Reagens Werkconcentratie Kloon (voor antilichamen) Uiteindelijk kleurvolume
Muis anti-mens CD3 BV711 50 ng/ml UCHT1 100 μl
Muis anti-menselijke CD56 PE 1/50 verdunning B159 B159 100 μl
Muis anti-mens NkP46 PE 1/50 verdunning 9/E2 100 μl
Levensvatbaarheid Kleurstof 1/1000 verdunning 500 μl

Tabel 1: Reagentia en antilichamen die worden gebruikt voor stromingscytometrie.

Mitochondriale stresstest
Poort Volume Samengestelde 10x voorraad Definitieve concentratie in de test
A 20 μl oligomycine 10 μM 1 μM
B 22 μl DNP (DNP) 1 mM 0,1 mM
C 25 μl antimycine A + rotenone 10 μM per stuk 1 μM per stuk
Glycolyse Stress Test
Poort Volume Samengestelde 10x voorraad Definitieve concentratie in de test
A 20 μl Glucose 100 mM 10 mM
B 22 μl antimycine A + rotenone 10 μM per stuk 1 μM per stuk
C 25 μl 2-DG 500 mM 50 mM

Tabel 2: Samengestelde belasting.

Stap Lus Herhaling (tijden)
Mix Wachten Maatregel
Kalibratie ––
Evenwicht ––
Basislijnwaarden 3 minuten 0 minuten 3 minuten 3
Eindlus ––
Poort A injecteren ––
Metingen 3 minuten 0 minuten 3 minuten 3
Eindlus ––
Injecteer poort B ––
Metingen 3 minuten 0 minuten 3 minuten 3
Eindlus ––
Injecteer poort C ––
Metingen 3 minuten 0 minuten 3 minuten 3
Eindlus ––
Programma beëindigen ––

Tabel 3: Programma-indeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit document hebben we een protocol opgesteld voor het efficiënt isoleren en kweken van zuivere en levensvatbare primaire menselijke NK-cellen uit perifeer bloed. We hebben ook de voorwaarden geoptimaliseerd voor de meting van de metabolische activiteit van deze NK cellen beoordeeld door zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring met behulp van een extracellulaire flux analyzer. In vergelijking met andere respirometrische methoden, de extracellulaire flux analyzer is snel, vereist kleine aantallen cellen, en maakt een hoge doorvoer screenings. Echter, de reagentia zijn duur, en injecties van verbindingen zijn beperkt tot slechts vier. Metabolische remodellering en activering van glycolyse en oxidatieve fosforylatie door cytokinen in NK-cel is essentieel voor robuuste NK-celreacties21, en de hier beschreven technieken maken de studie van het metabolische profiel van NK-cellen in real time mogelijk. Dit protocol kan worden uitgebreid tot cellen die worden geactiveerd door andere cytokinen, zoals IL-2, IL-12 en IL-18, of antilichamen die zich binden aan activerende receptoren. We hebben een aantal belangrijke stappen aangepakt die vaak over het hoofd worden gezien, zoals het platleggen van de cellen bij de optimale samenvloeiing of het gebruik van de optimale concentratie van ontkoppeling om het maximale zuurstofverbruik te stimuleren. Toch raden we aan om de werkelijke O2-niveaucurven (figuur 3C)te controleren, als andere stimuli die verschillen van IL-15 aan de cellen worden gegeven, om ervoor te zorgen dat O2 niet wordt uitgeput in de putten. Als dat het geval was, moet het celnummer worden verlaagd totdat een lineair O2-verbruik wordt waargenomen om een onderschatting van de echte OCR te voorkomen.

Basale ademhaling weerspiegelt de basale metabolische toestand van de cel, die grotendeels wordt gecontroleerd door de activiteit van de mitochondriale ATP synthase8, en is een indicatie van de basale ATP-vraag (voor eiwitsynthese, cytoskeletdynamica, ATPases zoals de Na+/K+-ATPase, enz.). Typisch, in aanwezigheid van voldoende substraten deze parameter toeneemt in metabolisch actieve of gestreste cellen. Toevoeging van oligomycine, die de ATP synthase blokkeert, ontluikt ATP-gekoppelde ademhaling en het protonlek, dat kan gebeuren over de lipide bilayer of eiwitten van het binnenste mitochondriale membraan, maar kan ook onducteerbaar zijn door eiwitten zoals de Uncoupling Proteins (UCPs)9, betrokken bij de regulering van adaptieve thermogenese en dus het omzetten van mitochondriale energie potentieel om te verwarmen in bruine adipocyten. Maximale ademhaling wordt bepaald door factoren zoals de beschikbaarheid van substraten voor de mitochondriale ademhalingsketen en de hoeveelheid en activiteit van ademhalingscomplexen. Mitochondriale ademhalingscomplexen en hun activiteit kunnen ook worden gewijzigd door posttranslationele wijzigingen zoals acetylatie of fosforylatie22,23. Deze parameter kan ook wijzen op de gezondheid van de cellen en hun vermogen om te reageren op acute beledigingen. Onder situaties van mitochondriale disfunctie neemt de maximale ademhaling af, en dit beperkt de capaciteit van de cel om te reageren op veranderingen in de ATP-vraag en leidt tot celdood24.

Het is zeer belangrijk op te merken dat, voor elk keer punt van de mitochondriale en glycolyse stress tests, ECAR is de som van glycolyse-afgeleide verzuring (via generatie van lactaat + H+) en verzuring van de luchtwegen (via de productie van CO2, die oplost in H2O om HCO3- en H+) te genereren , en belangrijker nog, ademhalingsverzuring kan een aanzienlijk deel van de totale ECAR in sommige celtypen25vertegenwoordigen. Voor geïnteresseerde onderzoekers zijn er gepubliceerde protocollen om de werkelijke glycolytische tarieven te berekenen. Daartoe kan het zuurstofverbruik tijdens de glycolytische stresstest(figuur 4G) worden gebruikt om de protonproductiesnelheid op elk tijdstip te berekenen door middel van ademhaling , en die waarde kan worden afgetrokken van de totale protonproductiesnelheid, die wordt verkregen met behulp van ECAR-waarden en het buffervermogen van het medium7,25,26.

Een belangrijke wijziging van dit protocol ten opzichte van de aanbeveling van de fabrikant is de tweede injectie van de glycolyse stresstest. Antimycine A en rotenone hebben de voorkeur boven oligomycine, om verschillende redenen die reeds zijn beschreven7: 1) sommige cellen vertonen een hoge glycolytische capaciteit die volledig kan voldoen aan de basale ATP-vraag van de cel, zelfs bij afwezigheid van oxidatieve fosforylatie; 2) het blokkeren van de ETC met antimycine A en rotenone verhoogt kunstmatig de ATP-vraag van de cel, omdat het veroorzaakt ATP hydrolyse door de ATP synthase (de mitochondriën uitgegroeid tot een ATP gootsteen), die keert om protonen pomp in een poging om de mitochondriale membraan potentieel dat instort na de ademhaling remming terug te vorderen; 3) het blokkeren van de ETC voorkomt ademhalingsverzuring van het medium (respiratoire CO2 gegenereerd in de TCA-cyclus die wordt omgezet in HCO3- en H+) die de ECAR-resultaten kunnen verwarren. Zo is waargenomen maximale ECAR met antimycine A en rotenone alleen toe te schrijven aan glycolyse. Interessant is dat er is gemeld dat de ECAR waargenomen met respiratoire remmers alleen kan nog steeds submaximal7, en een extra mechanisme om cellulaire ATP vraag te verhogen (en dus maximale ECAR) is beschreven: de toevoeging van de ionofoër monensine, die de invoer van Na+ in cel27 verhoogt en de snelheid van ATP hydrolyse door het plasmamembraan Na+/K+-ATPase, aan het mengsel van antimycine A en rotenone7stimuleert.

Een tweede belangrijk concept is dat we niet aanbevelen de aftrekking van de niet-glycolytische verzuring, die waarschijnlijk overeenkomt met de co2 van de luchtwegen die wordt omgezet in HCO3- en H+, van het gehele spoor om glycolytische parameters te berekenen zoals aanbevolen door de fabrikant, omdat dit bedrag aanzienlijk verandert tijdens elke fase van de Glycolyse Stress Test (het is het hoogst in de basale toestand, afneemt na toevoeging van glucose als gevolg van het Crabtree-effect20, en wordt vrijwel afgeschaft met antimycine A en rotenone) (Figuur 5).

Samenvattend, dit protocol toont een eenvoudige en efficiënte tool om de metabole activiteit van menselijke natuurlijke killer cellen te testen met een extracellulaire flux analyzer. Deze methode kan worden gebruikt om de metabole toestand in deze cellen te ondervragen, waarvan bekend is dat deze veranderen met celactivering door cytokinestimulatie of onder bepaalde pathologische omstandigheden, waaronder obesitas, kanker of virale infecties28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) voor steun en discussie. Deze studie werd ondersteund door de intramurale onderzoeksprogramma's van de National Institutes of Health, National Cancer Institute en National Heart, Lung, and Blood Institute. JT wordt ondersteund door het Ramon y Cajal programma (grant RYC2018-026050-I) van MICINN (Spanje).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Tags

Immunologie en infectie Probleem 160 Natural Killer cellen metabolisme extracellulaire flux glycolyse mitochondriën ademhaling elektronentransportketen stroomcytometrie
Analyse van human natural killer cell metabolisme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton,… More

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter