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Immunology and Infection

Analyse du métabolisme des cellules tueuses naturelles humaines

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/61466
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les cellules humaines primaires de tueur naturel (NK) isolées du sang périphérique, au repos ou après l’activation induite par l’IL15. Le protocole décrit pourrait être facilement étendu aux cellules NK humaines primaires activées par d’autres cytokines ou stimuli solubles.

Abstract

Les cellules tueurs naturels (NK) interviennent principalement des réponses immunitaires antitumorales et antivirales innées et répondent à une variété de cytokines et d’autres stimuli pour favoriser la survie, la prolifération cellulaire, la production de cytokines telles que les programmes d’interféron gamma (IFNγ) et/ou de cytotoxicité. L’activation des cellules NK par stimulation de cytokine nécessite un remodelage substantiel des voies métaboliques pour soutenir leurs besoins bioénergétiques et biosynthétiques. Il existe un grand nombre de preuves qui suggèrent que le métabolisme altéré des cellules NK est associé à un certain nombre de maladies chroniques, y compris l’obésité et le cancer, ce qui souligne l’importance clinique de la disponibilité d’une méthode pour déterminer le métabolisme cellulaire NK. Ici, nous décrivons l’utilisation d’un analyseur de flux extracellulaire, une plate-forme qui permet des mesures en temps réel de la glycolyse et de la consommation d’oxygène mitochondrial, comme un outil pour surveiller les changements dans le métabolisme énergétique des cellules humaines NK. La méthode décrite ici permet également la surveillance des changements métaboliques après la stimulation des cellules NK avec des cytokines telles que l’IL-15, un système qui est actuellement à l’étude dans un large éventail d’essais cliniques.

Introduction

Les cellules de tueur naturel (NK) sont des lymphocytes innés qui pédiment les réponses anti-tumorales et antivirales. Les cellules NK représentent 5 à 15 % de tous les lymphocytes dans le sang périphérique humain, et peuvent également être trouvées dans la rate, le foie, la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques. Les cellules NK n’expriment pas les récepteurs clonotypic polymorphes, tels que les récepteurs à cellules T (TCR) ou les récepteurs à cellules B (BCR). En revanche, l’activation de leurs fonctions cytolytiques est motivée par l’engagement de récepteurs qui reconnaissent les ligands invariables à la surface d’une cellule cible1,2.

Les cellules nk humaines au repos isolées du sang périphérique peuvent survivre pendant plusieurs jours dans le milieu de culture complété avec le sérum humain. L’activation des cellules NK par des cytokines telles que l’IL-15 ou l’IL-2 entraîne la prolifération des cellules et une augmentation de leur capacité de tuer, entre autres effets3,4,5. Plusieurs études ont montré une corrélation directe entre l’activation des cellules NK et les changements dans leur activité métabolique6. Ces changements métaboliques sont destinés à répondre aux exigences particulières des cellules en termes d’énergie et de biosynthèse.

Les cellules et les organismes aérobiques obtiennent de l’énergie grâce à une série de réactions chimiques qui impliquent le catabolisme et l’oxydation des glucides, des graisses et des protéines. Grâce à une combinaison de glycolyse, le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, les cellules eucaryotes répondent à la majorité de leur demande d’ATP et obtiennent des intermédiaires requis comme éléments constitutifs des macromolécules essentielles à la croissance et à la prolifération des cellules. Le processus de glycolyse (figure 1A) commence par l’entrée du glucose dans la cellule. Dans le cytosol, le glucose est phosphorylé et transformé en pyruvate (avec une production nette de 2 molécules d’ATP par molécule de glucose), qui peut être réduit au lactate ou transporté dans les mitochondries pour être transformé en Acétyl-CoA et entrer dans le cycle TCA. Le cycle TCA continue le cycle alimenté avec plus de molécules d’Acétyl-CoA et produit du CO2 (qui finira par se diffuser à l’extérieur de la cellule et, en réagissant avec H2O dans le milieu, générera de l’acide carbonique qui conduira à l’acidification du milieu) et NADH, la molécule en charge de donner des électrons à la chaîne de transport d’électrons (ETC). Les électrons voyagent à travers différents complexes protéiques et sont finalement acceptés par l’oxygène. Ces complexes (I, III et IV) pompent également H+ de la matrice mitochondriale dans l’espace intermembrane. En conséquence du gradient électrochimique généré, le H+ entrera à nouveau dans la matrice à travers le complexe V (ATP-synthase), en investissant l’énergie potentielle accumulée dans la génération d’ATP.

La glycolyse et la respiration mitochondriale peuvent être bloquées à différents points en utilisant des inhibiteurs. La connaissance et l’utilisation de ces inhibiteurs ont été la base pour le développement de l’essai de flux extracellulaire. En mesurant deux paramètres simples en temps réel comme le pH et l’oxygène, l’analyseur de flux extracellulaire infère le taux de glycolyse et de respiration mitochondriale dans une plaque de 96 puits. Le test de résistance à la glycolyse est effectué dans un milieu basal sans glucose (Figure 1B)7. Les premières mesures du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) sont indicatives de l’acidification indépendante de la glycolyse. Il est appelé acidification non glycolytique et est en corrélation avec le CO2 produit par le TCA qui, comme expliqué précédemment, se combine avec H2O dans le milieu pour générer H+ (ECAR lié au TCA). La première injection est le glucose pour induire l’utilisation du glucose et stimuler la glycolyse. La deuxième injection combine à la fois la roténone, un inhibiteur du complexe I, et l’antimycine A, un inhibiteur complexe III ensemble, pour bloquer l’ETC. Les cellules répondent à cette diminution spectaculaire de la production d’ATP mitochondrial en activant la glycolyse pour maintenir les niveaux d’ATP cellulaire, ce qui représente la quantité de glycolyse qui n’est pas utilisée par la cellule dans l’état basal mais pourrait être potentiellement recrutée en réponse à l’augmentation de la demande d’ATP (glycolyse compensatoiree). La troisième injection est l’analogue du glucose 2-Désoxyglucose (DG), qui rivalise avec le glucose comme substrat pour l’enzyme hexokinase. Le produit de cette phosphorylation, 2-désoxyglucose-6-phosphate ne peut pas être transformé en pyruvate, et donc la glycolyse est bloquée, ce qui abaisse l’ECAR à son minimum. L’ECAR mesurée à ce stade comprend d’autres sources d’acidification extracellulaire qui ne sont pas attribuées à la glycolyse ou à l’activité respiratoire ainsi que toute glycolyse résiduelle non totalement inhibée par 2-DG (post 2-DG-acidification).

Le test de stress mitochondrial est effectué dans un milieu avec du glucose (Figure 1C)8. Les premières mesures du taux de consommation d’oxygène (OCR) correspondent à la ligne de base de la respiration mitochondriale (respiration basale). La première injection est l’oligomycine, qui inhibe le retour des protons par la synthase ATP (complexe V), bloquant la synthèse de l’ATP et donc hyperpolariser rapidement la membrane mitochondriale, ce qui empêche le pompage de protons par les complexes respiratoires, et conduit à une diminution de l’OCR. La comparaison entre la respiration de base et la valeur donnée par addition d’oligomycine représente la respiration liée à l’ATP. Le taux restant d’oligomycine insensible à la consommation d’oxygène est appelé fuite de protons, qui représente le flux de protons à travers la bicouche lipidique ou les protéines dans la membrane mitochondriale interne comme le translocale nucléotide adénine9. La deuxième injection est le uncoupler 2,4-dinitrophénol (DNP), une ionophore qui induit une entrée massive de H+ dans la matrice mitochondriale, ce qui conduit à la dépolarisation de la membrane mitochondriale et la perturbation de la synthèse mitochondriale ATP. Les cellules réagissent à la dissipation de la force proton-motrice en augmentant le taux de transport des électrons et la consommation d’oxygène à des niveaux maximums dans une tentative futile de récupérer le potentiel de la membrane (capacité respiratoire maximale). La différence entre la capacité respiratoire maximale et la respiration basale est la capacité respiratoire de rechange de la cellule, qui représente la quantité de respiration qui n’est pas utilisée par la cellule pour générer de l’ATP dans l’état basal, mais qui pourrait être potentiellement recrutée en réponse à l’augmentation de la demande d’ATP ou dans des conditions de stress8. La troisième injection est une combinaison de roténone et d’antimycine A. Cette injection arrête complètement l’ETC et l’OCR diminue à son niveau le plus bas, la consommation d’oxygène restante étant non mitochondriale (causée par les NADPH-oxydases, etc.).

Les changements dans les voies métaboliques pourraient en quelque sorte prédire le fonctionnement des cellules NK, car il a été suggéré que l’activation continue des cellules NK avec des cytokines in vitro pourrait conduire à l’épuisement cellulaire NK par l’étude des différentes voies métaboliques10,11. La corrélation entre le statut métabolique des cellules NK et la fonction est très importante du point de vue de l’immunothérapie contre le cancer. Dans ce domaine, l’activation des cellules NK avec perfusion d’IL-15, seule ou en combinaison avec des anticorps thérapeutiques monoclonaux ont été testées afin d’améliorer la cellule tumorale tuant12,13,14. La connaissance de l’état métabolique des cellules NK en réponse à ces stratégies de traitement fournirait un prédicteur précieux de l’état d’activation des cellules NK et de la fonction de mise à mort.

L’étude des voies métaboliques dans d’autres cellules myéloïdes et lymphoïdes telles que les monocytes, les cellules T et B a été décrite15 et des méthodes optimisées ont été publiées16. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode qui combine à la fois un protocole d’isolement NK qui produit un nombre élevé de cellules NK pures et viables et un protocole optimisé pour mesurer l’activité métabolique à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. Ici, nous montrons qu’il s’agit d’une méthode valable pour l’étude des changements métaboliques dans le repos et IL-15 activé cellules NK humaines. Pour l’essai de flux extracellulaire, des paramètres tels que le nombre de cellules et les concentrations de médicaments ont été testés et optimisés. Par rapport à d’autres méthodes respiratoires, l’analyseur de flux extracellulaire est entièrement automatisé et capable de tester en temps réel, avec de très faibles quantités de cellules, jusqu’à 92 échantillons simultanément, et permet ainsi des dépistages à haut débit (avec plusieurs échantillons et répliques) d’une manière relativement rapide17.

Cette méthode peut être utilisée par des chercheurs intéressés à évaluer la fonction cellulaire NK en étudiant le métabolisme des cellules NK. Il pourrait également être appliqué aux cellules activées par d’autres cytokines, anticorps ou stimuli solubles.

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Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux principes éthiques de la recherche médicale énoncés dans la Déclaration d’Helsinki. Des échantillons de sang périphériques provenant de donneurs ont été obtenus auprès du Département de médecine transfusionnelle des NIH en vertu du protocole approuvé par la CISR 99-CC-0168, avec le consentement écrit des patients.

1. Préparation de réactifs

  1. Réactifs pour l’isolement des cellules NK
    NOTES : Préparez ces réactifs dans une hotte de culture cellulaire.
    1. Préparer le tampon de séparation NK : Supplément PBS (pH 7.4) avec 1 mM EDTA et 2% Sérum de veau foetal (FCS) qui a déjà été inactivé thermiquement (à 56 °C pendant 30 min).
    2. Préparer le milieu de culture NK : Compléter le Média modifié de Dulbecco (IMDM) d’Iscove avec 10% de sérum humain (SH). Filtre stérile et conserver à 2-8 °C. Chauffer le milieu à 37 °C avant d’ajouter aux cellules.
    3. Resuspend Human IL-15 en PBS à 200 μg/mL.
  2. Réactifs pour un test de flux extracellulaire
    1. Préparer un milieu d’analyse : Pour le milieu d’essai mitochondrial, ajouter 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM L-glutamine et 10 mM de glucose au milieu de base; pour le milieu d’essai de stress de glycolyse, ajoutez 2 mM L-glutamine au milieu de base.
      REMARQUE : Les concentrations de glucose, de pyruvate et de glutamine sont fournies comme recommandé par le fabricant d’analyseur de flux extracellulaire. Cependant, la composition des médias peut être modifiée par les chercheurs pour correspondre parfaitement à celle du milieu de culture, si désiré.
    2. Ajuster le pH des deux supports à 7,4 avec 0,1 N NaOH à l’aide d’un pH mètre de banc, filtre stérile à travers une taille de pore de 0,2 μM et stocker à 2-8 °C. Chauffer le milieu à 37 °C, vérifier le pH et réajuster à 7,4 avant utilisation si nécessaire.
      REMARQUE : Seul le COambiant 2 est contenu dans l’atmosphère de l’analyseur de flux extracellulaire, l’utilisation de supports sans bicarbonate est critique.
    3. Préparer des solutions de stock pour les réactifs : Oligomycine (inhibiteur de la synthase ATP), solution de stock de 10 mM en DMSO; 2,4-dinitrophénol (DNP, uncoupler), 1 M de solution de stock dans DMSO; antimycine A (inhibiteur complexe III), solution de stock de 10 mM dans DMSO; roténone (inhibiteur complexe I), solution de stock de 10 mM dans DMSO. Faire 30 aliquots μL de tous les réactifs et stocker à -20 °C.
      REMARQUE : Ces lignes directrices sont destinées aux réactifs achetés individuellement et préparés par le chercheur. Si des réactifs sont achetés au fabricant de l’analyseur, suivez leurs directives pour la préparation du réactif.

2. Les cellules NK s’isolent du sang périphérique

  1. Préparation des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à partir du sang humain
    REMARQUE : Effectuez ces étapes dans un capot de culture cellulaire. Décontaminer tous les résidus et matériaux en contact avec le sang avec de l’eau de Javel et les jeter dans le récipient approprié à incinérer.
    1. Pipette 20 ml de lymphocytes Separation Medium (LSM) dans un tube conique de 50 mL.
    2. Soigneusement, tout en gardant le tube à un angle de 30°, pipette 20 ml de sang sur le LSM, très doucement et en touchant le mur du tube. Évitez le mélange de sang avec le LSM et créez une interphase visible et bien définie entre les deux fluides.
      REMARQUE : On peut utiliser du sang périphérique ou des produits enrichis de leukaphérèse.
    3. Centrifugez les tubes pendant 25 min, 1000 x g à température ambiante. N’utilisez pas de frein, car il pourrait faire les deux phases dans le tube (LSM et sang) mélange.
    4. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse et placez-les dans un rack. Vérifiez la présence d’une couche visible de cellules (cellules mononucléaires) qui se formeront à l’interphase entre le LSM (clair) et le plasma (jaune), tandis que les globules rouges se granulent au fond du tube.
    5. Aspirate doucement la couche de cellules mononucléaires à l’aide d’une pipette en plastique de 10 ml (environ 5-8 ml) et placez-la dans un nouveau tube conique de 50 mL. L’interphase des lymphocytes de jusqu’à 2 tubes différents peut être mis en commun.
    6. Laver les cellules mononucléaires 2x en résuspendant dans 45 mL PBS et centrifugez à 800 x g pendant 5 min, à température ambiante.
      REMARQUE : Après cette étape, une pastille de cellules monnucléaires périphériques de sang (PBMC) est obtenue et le chercheur peut passer à l’étape d’isolement de NK.
  2. NK isolement des PBMC
    1. Comptez les cellules à partir de 2.1.6 et resuspendez-les dans le tampon de séparation NK (1x10 8 PBMC/mL).
    2. Prenez 10 ml de la resuspension cellulaire (109 PBMC) et placez-les dans un tube de 50 ml.
    3. Ajouter 500 μL (50 μL/mL de tampon) du mélange d’anticorps d’isolement cellulaire NK et 10 μL (1 μL/mL de tampon) du mélange d’anticorps d’isolement positif anti-CD3 aux PBMC et incuber à température ambiante pendant 10 min.
    4. Vortex les perles magnétiques et ajouter 1 ml au mélange de PBMC avec des anticorps (100 perles μL/ml PBMC). Incuber pendant 10 min à température ambiante en remuant de temps en temps.
    5. Ajouter 35 ml de tampon d’isolement NK (3,5 ml de tampon/ml pbmcs), mélanger et placer sur l’aimant pendant 15 min (2,2 x 107 PBMC/mL). Après ce temps, les perles et les cellules positivement sélectionnées (toutes les cellules sauf NK) auront adhéré aux parois du tube.
    6. Recueillir soigneusement le supernatant (contenant des cellules NK) avec une pipette en plastique de 50 mL sans toucher les côtés ou le fond du tube.
    7. Compter les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire et d’une centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min.
    8. Resuspend les cellules NK isolées à 5 x 106 cellules/mL dans IMDM contenant 10% de SH et placez-les dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 jusqu’à ce que l’expérience soit réalisée.
      REMARQUE : Ce protocole d’isolement NK indique les nombres cellulaires et les volumes de réactifs adaptés à l’utilisation d’un tube de 50 ml et d’un grand aimant. Ce protocole peut être mis à l’échelle (au cas où d’autres PBMC sont obtenus) en répétant les étapes d’isolement dans différents tubes ou réduits en réduisant le volume dans le tube. Pour les volumes finaux de 14-45 mL un tube de polystyrène de 50 mL est utilisé, pour les volumes 4-14, un tube de polystyrène de 15 mL est utilisé et pour les volumes 1-4 mL, un tube de polystyrène de 5 mL est utilisé. L’aimant est différent et s’adapte au tube approprié dans chaque cas. La quantité de mélange d’anticorps et de perles magnétiques peut également être mise à l’échelle en fonction du nombre de cellules et du volume final.
  3. Coloration de la population de cellules NK pour la cytométrie de flux
    1. Prendre 0,25 x 106 cellules par échantillon à partir de l’étape 2.2.8, retirer le milieu par centrifuge à 800 x g pendant 5 min à température ambiante et resuspender le granulé cellulaire dans 500 μL de PBS.
    2. Ajouter le colorant de viabilité conformément à la recommandation du fabricant (1 μL de colorant reconstitué par DMSO à 1 mL de resuspension cellulaire) et incuber à température ambiante pendant 30 min.
    3. Laver 2x en resuspendant en PBS de 5 mL et en centrifuge à 800 x g pendant 5 min, à température ambiante.
    4. Tacher avec les anticorps antihumaines correspondants dans 100 μL d’IMDM contenant 10 % de SH pendant 30 min sur de la glace protégée de la lumière (voir le tableau 1). Tous les anticorps peuvent être combinés et utilisés en une seule étape de coloration.
    5. Analyser les échantillons par cytométrie de flux pour évaluer la pureté de la population de cellules NK obtenue. Utilisez la méthode de gating et d’analyse de cellules qui ont été précédemmentdécrites 18,19.
  4. Stimulation des cellules NK avec l’IL-15 soluble
    1. Resuspend 0,75 x 106 cellules à partir des étapes 2.2.8 ou 2.4.3 dans 100 μL d’IMDM contenant 10% HS dans un puits de 96 bien-plaque (fond rond).
    2. Diluer l’il-15 à 1 μg/mL humain dans l’IMDM contenant 10 % de SH. Ajouter 100 μL de l’IL-15 humain dilué aux cellules pour atteindre une concentration finale de 0,5 μg/mL.
      REMARQUE : 0,5 μg/mL est une concentration saturante d’IL-15. Des concentrations plus faibles d’IL-15 ou d’autres cytokines comme l’IL-2, l’IL-12 ou l’IL-18 peuvent être testées par les chercheurs si désiré.
    3. Placez les cellules dans l’incubateur à 37 °C et stimulez pendant 48 h avant d’effectuer l’essai de flux extracellulaire. Resuspend les cellules non stimulées (témoins) à la même concentration et volume dans IMDM contenant 10% HS sans IL-15, et placez-les dans le même incubateur pendant 48 h.

3. Hydratation de la cartouche de capteur

REMARQUE : Les 96 extrémités de la sonde de la cartouche de capteur contiennent des fluorophores à état solide individuels pour O2 et H+ qui doivent être hydratés afin de détecter les changements o2 et pH.

  1. Allumez l’analyseur et laissez-le se réchauffer jusqu’à 37 °C.
  2. Ouvrez le paquet de cartouche de capteur et séparez la cartouche de capteur de la plaque d’utilité. Ajouter 200 μL de la solution de calibrant dans chaque puits de la plaque d’utilité et remettre la cartouche du capteur sur la plaque, validant que les capteurs sont complètement immergés dans la solution. Pour obtenir des résultats optimaux, incuber la cartouche pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur sans CO2qui est correctement humidifié pour prévenir l’évaporation. Prévenir la formation de bulles sous les capteurs pendant l’hydratation.
    REMARQUE : Le temps minimum d’hydratation de la cartouche est de 4 h à 37 °C dans un incubateur sans CO2. Alternativement, l’hydratation de nuit de la cartouche de capteur avec 200 μL d’eau stérile à 37 °C dans un incubateur sans CO2,suivie d’une incubation de la cartouche de capteur avec 200 μL de solution de calibrant préchauffé 45 – 60 min avant le début de la course, peut être utilisée.

4. Essai de flux extracellulaire

  1. Préparation de plaques adhésives
    NOTE : Puisque la mesure des paramètres métaboliques a lieu dans une microchamber formée au bas de la plaque d’analyse de 96 puits, les cellules de suspension doivent d’abord être collées au fond du puits. Un adhésif cellulaire extrait de la moule Mytilus edulis est utilisé. Le fabricant de l’adhésif cellulaire recommande une concentration de revêtement de 1 à 5 μg/cm2. Le puits de la microplaque de culture cellulaire de l’analyseur a une surface d’environ 0,110 cm2. Ainsi, pour une concentration de 5 μg/cm2, environ 0,55 μg d’adhésif sont nécessaires. Comme 25 μL de la solution adhésive seront utilisés pour enrober chaque puits, la concentration optimale de solution adhésive pour les microplaques de culture cellulaire analyseuse est d’environ 22,4 μg/mL (22,4 μg/mL x 0,025 mL = 0,56 μg).
    1. Préparer 2,5 mL de solution adhésive cellulaire (22,4 μg/mL) en bicarbonate de sodium de 0,1 M, pH 8,0. Le bicarbonate fournit le pH optimal pour les performances des adhérents cellulaires qui, selon le fabricant, se situe entre 6,5 et 8,0.
    2. Pipette 25 μL de la solution adhésive cellulaire à chaque puits de la plaque d’essai et incuber à température ambiante pendant 20 min. Après cela, retirer la solution et laver 2x avec 200 μL d’eau stérile / puits. Laissez sécher les puits en gardant la plaque ouverte pendant 15 minutes à l’intérieur d’un capot de culture cellulaire.
      REMARQUE : Les plaques enduites peuvent être conservées jusqu’à 1 semaine à 4 °C.
  2. Ensemencement cellulaire dans des plaques recouvertes d’adhésif
    1. Cellules de centrifugeuse de l’étape 2.4.3 à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Enlever les supernatants et laver les cellules dans le milieu de test de stress mitochondrial réchauffé (si un test de stress mitochondrial est effectué) ou le milieu de test de stress de glycolyse (si un test de résistance à la glycolyse est effectué). Les cellules de granulés à nouveau et resuspendent à la concentration de cellules préférée dans le même milieu (le volume de resuspension dépendra de la concentration cellulaire choisie; puisque chaque puits contiendra 180 μL de la suspension cellulaire, préparer 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106, 2,08 x 106, 4,17 x 106 et 8,33 x 10 suspensions cellulairesde 6 cellules/mL pour 0,047 x 106, 0,094 x 106, 0,187 x 106, 0,375 x 106, 0,75 x 106 et 1, 5 x 106 cellules par puits respectivement).
    2. Plaque 180 μL de suspension cellulaire par puits le long du côté de chaque puits. Une pipette multicanal est recommandée. Utilisez les puits A1, A12, H1 et H12 de la plaque de culture de l’analyseur comme puits de contrôle pour la correction de fond. Ajouter 180 μL du milieu d’essai dans ces puits (pas de cellules). Des puits de contrôle supplémentaires peuvent être utilisés si désiré et s’il y a suffisamment d’espace dans la plaque.
      REMARQUE : La présence de sérum peut causer une mauvaise fixation cellulaire.
    3. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 °C dans un incubateur sans CO2. Préparer 10x composés entre-temps (voir étape 4.3 ci-dessous).
    4. Modifiez les réglages de la centrifugeuse en zéro freinage. Centrifuge la plaque à 200 x g pendant 5 min. Observez les cellules au microscope pour vérifier qu’elles forment une monocouche au fond du puits. Transférer les plaques à l’incubateur CO2-freependant 25 min. Pour de meilleurs résultats, le temps total après le placage ne doit pas être supérieur à environ 1 h.
  3. Préparation de solutions de travail 10x pour charger dans la cartouche de capteur
    REMARQUE : Chacun des 96 extrémités de la sonde de la cartouche de capteur abrite 4 ports (A, B, C et D) qui peuvent être utilisés pour injecter des composés séquentiellement dans des puits individuels.
    1. Pour effectuer un test de stress mitochondrial, préparez 2,5 mL chacun de 10 oligomycine de μM, 1 mM DNP et un mélange de roténone de 10 μM et 10 μM d’antimycine A, dans le milieu d’essai de stress mitochondrial (utiliser les solutions de stock à partir de l’étape 1.2.3). Les concentrations finales dans le puits après l’injection seront de 1 μM d’oligomycine, de 0,1 mM DNP et de 1 μM d’antimycine A/roténone.
    2. Pour effectuer un test de résistance à la glycolyse, préparer 2,5 mL d’un mélange de roténone de 10 μM et 10 μM d’antimycine A dans le milieu d’essai de stress de la glycolyse (utiliser les solutions de stock à partir de l’étape 1.2.3). Dissoudre le glucose dans le milieu d’essai de stress de glycolyse pour une solution de 100 mM et 2-désoxy-glucose (2-DG) dans le milieu d’essai de stress de glycolyse pour une solution de 500 mM. Les concentrations finales dans le puits après l’injection seront de 10 mM de glucose, 1 μM d’antimycine A/roténone et 50 mM 2-DG.
    3. Solutions chaudes à 37 °C, vérifier le pH et réajuster à 7,4 si nécessaire. Composés de charge préparés à l’étape 4.3.1. (pour un test de résistance mitochondrial) ou 4.3.2 (pour un test de résistance à la glycolyse) dans les ports A, B et C de la cartouche de capteur hydraté (à partir de l’étape 3.2) à l’aide d’un micropippers multicanal et des guides de chargement de port fournis avec la cartouche, comme le montre le tableau 2.
      REMARQUE : Pour assurer une injection adéquate dans tous les puits pendant l’essai, chaque série de ports utilisés (p. ex., tous les ports A) doit contenir le même volume d’injection sur l’ensemble de la cartouche du capteur. Cela s’applique aux puits de correction de fond et même aux puits qui ne sont pas utilisés dans l’expérience.
    4. Incuber la cartouche de capteur chargée à 37 °C dans un incubateur sans CO2lors de la mise en place du programme.
  4. Configuration des protocoles d’analyse de flux extracellulaires
    1. Ouvrez le logiciel d’analyseur de flux extracellulaire et à l’aide des onglets Définitions de groupe et plane carte indiquent des groupes de puits qui ont des conditions similaires (p. ex., des puits avec le même nombre de cellules, ou des puits avec des cellules au repos ou des cellules stimulées par l’IL-15). Indiquez également que les puits de correction de fond (par défaut A1, A12, H1 et H12 seront réglés, mais d’autres puits peuvent être utilisés) et des puits vides.
    2. Définissez le programme décrit dans le tableau 3 dans le logiciel à l’aide de l’onglet Protocole.
    3. Commencez le programme à l’aide de l’onglet Exécuter les tests. Placez la cartouche du capteur (hydratée et chargée de composés 10x) et la plaque d’utilité sur le plateau. Après l’étape d’étalonnage (15 – 20 min), lorsqu’il est invité, remplacer la plaque de calibrant pour la plaque d’essai (sans couvercle) par des cellules attachées. Après cela, la course est entièrement automatisée (la machine effectuera toutes les mesures et injections).
      REMARQUE : Il est possible d’effectuer un test de résistance mitochondrial et un test de stress glycolytique dans la même plaque, tant que les composés spécifiques sont chargés dans les ports appropriés (oligomycine, DNP et antimycine/roténone respectivement dans les ports A, B et C des puits où un test de résistance mitochondrial est effectué; glucose, antimycine/roténone et 2-DG dans les ports A, B et C respectivement des puits où un test de résistance à la glycolyse est effectué), les mêmes volumes pour les injections sont utilisés dans chaque série de ports et de puits pour chaque test sont correctement identifiés à l’aide des onglets de définitions de groupe et de plaque du logiciel.
    4. Après la fin de l’exécution, récupérer les données et les analyser à l’aide du logiciel.

5. Détermination du numéro de cellule

REMARQUE : Les résultats peuvent être normalisés pour tenir compte des différences possibles dans le nombre de cellules. Deux approches principales décrites ci-dessous peuvent être utilisées.

  1. Détermination du contenu de l’ADN
    1. Retirer le milieu d’essai restant à l’aide d’une pipette de chaque puits. Lorsque vous aspirez à un milieu, veillez à ne pas déranger les cellules. La plaque peut être stockée à -20 °C jusqu’à l’analyse.
      REMARQUE : L’étape de congélation est importante pour la lyse cellulaire efficace et la détermination du contenu de l’ADN.
    2. Préparer une solution 1x de tampon de analyse cellulaire (20x) dans de l’eau distillée (200 μL/puits).
    3. Ajoutez la solution de stock de colorant de test de prolifération cellulaire (400x) dans le tampon 1x de cellule-lyse. Pour la détection de 50 à 50.000 cellules par puits, utilisez 1x colorant d’analyse de prolifération cellulaire. Pour des nombres cellulaires plus élevés, il est recommandé d’utiliser le colorant d’essai de prolifération cellulaire à une concentration finale supérieure à 1 x. Dans ce cas, utilisez le colorant d’analyse de prolifération cellulaire à une concentration finale de 5x (diluer la solution de stock d’analyse de prolifération cellulaire 80 fois en tampon 1x cellule-lyse).
    4. Ajouter 200 μL du réactif d’essai de prolifération cellulaire à chaque puits. Incuber les échantillons pendant 2 à 5 min à température ambiante. Protégez-vous de la lumière.
    5. Mesurer la fluorescence des échantillons à l’excitation : 480 nm; émission : 520 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence selon les recommandations du fabricant.
  2. Détermination de la teneur en protéines
    1. Soigneusement, aspiratre complètement le milieu d’essai de chaque puits sans toucher les cellules et congeler les cellules à -20 °C pendant au moins 1 h. Alternativement, les cellules peuvent être conservées congelées pendant plus longtemps (jusqu’à 1 semaine) jusqu’à ce que l’analyse soit effectuée.
    2. Ajouter 50 μL de milieu de lyse par radioimmunoprécipitation (RIPA) complétés par des inhibiteurs de protéase 1x (à partir d’une solution de stock de 100x) à chaque puits. Placer la plaque sur un shaker pendant 5 min à température ambiante, puis incuber la plaque sur la glace pendant 30 min pour une lyse cellulaire complète.
    3. Centrifugez la plaque pendant 5 min à 200 x g à température ambiante. Cette étape va granuler les débris cellulaires pour prévenir les interférences avec la mesure des protéines.
    4. Mesurer la concentration de protéines par test d’acide bicinchoninique (BCA) selon les recommandations du fabricant.

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Representative Results

L’isolement des cellules NK du sang périphérique fournit une population pure et viable

L’essai de flux extracellulaire est basé sur la mesure de la concentration de H+ et O2 dans le puits et ne distinguera pas entre les différentes populations de cellules ou leur viabilité. Pour cette raison, l’obtention d’une population très pure et viable de la cellule d’intérêt a été l’étape clé pour réussir dans ces expériences.

L’isolement des cellules de NK du sang périphérique a été exécuté comme indiqué dans la section 2. Afin d’évaluer la pureté et la viabilité des cellules NK obtenues, de petits aquots provenant des PMBC et de la population isolée de cellules NK ont été tachés et analysés par cytométrie de débit (figure 2A). Les cellules mononucléaires ont été fermées dans l’intrigue montrant vers l’avant (FSC-A) par rapport à la zone de dispersion latérale (SSC-A). Dans cette population, des cellules individuelles ont été fermées le long de la diagonale de l’intrigue montrant FSC-A par rapport à la hauteur de dispersion vers l’avant (FSC-H). Dans les populations de singlet, la viabilité a été évaluée, et s’est avérée supérieure à 98 % dans les deux populations de PMBCs et de cellules NK. La pureté de la population de cellules NK isolée a été établie par double coloration contre cd3 (présent dans les lymphocytes T, la population dominante parmi PBMCS) et CD56 ou NKp46 (Figure 2B). Les cellules NK sont définies comme négatives pour la population pour cd3 et positives pour CD56 ou NKp46. Selon ces critères, la pureté des cellules NK était d’environ 88%, ce qui représente un enrichissement 18 fois sur les cellules NK par rapport à ceux présents dans la population de PBMC.

Les valeurs OCR et ECAR dépendent du numéro de cellule

Pour le test de stress mitochondrial, les cellules ont été métaboliquement perturbées par l’ajout de trois composés différents : oligomycine, DNP et antimycine A + roténone. Pour chaque type de cellule, le nombre de cellules par puits a été soigneusement optimisé pour une expérience d’analyse de flux extracellulaire. La figure 3A montre des parcelles représentatives du taux de consommation d’oxygène mitochondrial (OCR) utilisant plusieurs numéros de cellules NK humaines (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 et 0,047 x 106). Toutes les mesures ont été effectuées en triple. Les nombres cellulaires sont en corrélation linéaire avec la quantité d’ADN ou de protéines dans le puits (figure 3B). Comme prévu, les nombres élevés de cellules ont affiché des valeurs d’OCR plus élevées, alors que moins de 0,187 x 106 cellules par puits n’ont pas fourni de résultats robustes. D’autre part, les nombres de cellules plus élevés (1,5 x 106) n’étaient pas optimaux, car lors de l’ajout de DNP, la concentration d’oxygène dans le puits était totalement épuisée dans chaque cycle (figure 3C), ce qui exclut le calcul précis de l’OCR. La concentration de uncoupler doit être titrée soigneusement pour chaque type de cellule, car ne pas ajouter suffisamment de résultats DNP dans l’OCR submaximal, tandis que l’ajout de trop peut inhiber le COR maximal ainsi. Dans les cellules humaines NK, 100 μM DNP s’est avéré être la dose optimale (Figure 3D). D’autres uncouplers tels que le cyanure de carbonyle-4-(trifluorométhoxy) la phénylhydrazone (FCCP) ou le cyanure de carbonyle m-chlorophényl hydrazine (CCCP) peuvent être utilisés au lieu de DNP, mais devraient être titrés pour chaque type de cellule ainsi.

Pour le test de résistance à la glycolyse, après une mesure de base de l’ECAR, les cellules affamées de glucose ont été perturbées par les composés suivants : glucose, antimycine A + roténone et 2-DG. La figure 3E montre des parcelles représentatives d’ECAR utilisant plusieurs numéros de cellules NK (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 et 0,047 x 106). Toutes les mesures ont été effectuées en triple. L’analyse de stress de glycolyse a été la plus réussie à la densité de placage la plus élevée, tandis que moins de 0.187 x 106 cellules par puits n’a pas fourni de résultats robustes.

Le traitement IL-15 augmente les valeurs basales et maximales de l’OCR et de l’ECAR

La densité d’ensemencement optimale de 0,75 x 106 cellules par puits a été utilisée pour des expériences ultérieures. Les cellules NK ont été cultivées en présence ou en absence de concentrations saturantes de la cytokine IL-15 pendant 48 h, après quoi leur viabilité s’est avérée être de 93,7 ± 4,8 % et 85,7 ± 12,0 %, respectivement. La figure 4A,B montre une expérience typique de test de stress mitochondrial avec 0,75 x 106 cellules NK par puits. Dans ce test, l’oligomycine conduit à une diminution spectaculaire de la consommation d’oxygène (figure 4A) et à une augmentation de l’ECAR qui représente un passage à la glycolyse pour essayer de maintenir les niveaux d’ATP cellulaire (Figure 4B). L’activation de la cellule NK par IL-15 a causé une augmentation de la consommation d’oxygène mitochondrial et de l’acidification extracellulaire. Ce résultat a été cohérent lorsque plusieurs sujets humains ont été comparés (Figure 4C). Respiration basale, maximale et liée à l’ATP, mais pas fuite de protons ou respiration non mitochondriale, a augmenté avec IL-15 (Figure 4C,D). En outre, le taux d’OCR/ECAR a diminué, ce qui indique une tendance à passer à un métabolisme glycolytique après la stimulation IL-15 (Figure 4E).

La figure 4F,G montre une expérience typique de test de stress de glycolyse avec 0,75 x 106 cellules NK par puits. L’ajout de glucose a déclenché une augmentation énorme de l’ECAR en raison de l’activation de la glycolyse, tandis que l’ajout ultérieur de l’antimycine A et de la roténone a entraîné une glycolyse compensatoire, et 2-DG a causé une inhibition de la voie et une diminution de l’ECAR au minimum (Figure 4F). Parallèlement, le glucose a systématiquement provoqué une légère diminution de la consommation d’oxygène, peut-être par l’effet Crabtree20, tandis que l’antimycine A et la roténone ont complètement bloqué la respiration et 2-DG ne fournit pas d’autres effets (Figure 4G). L’activation de l’acidification extracellulaire et de la consommation d’oxygène mitochondrial avec IL-15 pourrait être observée aussi bien dans ce test, et encore une fois cela est cohérent lors de l’utilisation de cellules de plusieurs donneurs (Figure 4H).

Figure 1
Figure 1 : Schéma des essais de flux extracellulaires.
(A) Schéma de glycolyse, cycle d’acide tricarboxylique (TCA) et chaîne de transport d’électrons (ETC). Les inhibiteurs de différentes étapes sont écrits en rouge. Le flux d’électrons dans l’ETC est représenté en vert avec le NADH en tant que donneur et l’O2 comme accepteur final. (B) Profil schématique des tests de stress de glycolyse représentant le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) par rapport au temps. (C) Profil schématique d’essai de contrainte mitochondrial représentant le taux de consommation d’oxygène (OCR) par rapport au temps. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Cellules tueurs naturels (NK) purifiées à partir de cellules mononucléaires périphériques (PBMC).
(A) Stratégie de gating suivie pour évaluer la pureté et la viabilité des cellules NK (colonne de droite) par rapport au total des PBMC (colonne de gauche). De la porte des cellules mononucléaires (panneaux supérieurs), des cellules uniques ont été sélectionnées (panneaux moyens) et la viabilité a été mesurée (panneaux inférieurs). (B) Les cellules vivantes ont été tachées pour CD3 et CD56 ou NKp46. Les chiffres des panels indiquent le pourcentage de cellules dans les régions sélectionnées. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Optimisation des tests de stress mitochondrial et de glucose dans les cellules NK humaines activées.
(A) Test de stress mitochondrial : OCR pour chaque densité de placage (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 et 0,047 x 106) est indiqué. Chaque point de données représente la moyenne de 3 puits avec écart type. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. (B) Niveaux d’ADN (panneau supérieur) et de protéines (panneau inférieur) dans le puits à différentes densités de placage. Les résultats sont représentatifs d’au moins trois expériences indépendantes. Chaque point de données représente la moyenne de 3 puits avec écart type. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. (C) Traces brutes de niveau d’oxygène dans les puits ne contenant aucune cellule (trace noire), 0,75 x10 6 cellules (trace bleue) ou 1,5 x 106 cellules (trace verte). Dans la trace verte après addition de DNP, l’oxygène est complètement épuisé dans chaque cycle. (D) La capacité respiratoire de réserve de 0,75 x 106 cellules a été testée en présence de plusieurs concentrations de DNP. EE) Test de stress de la glycolyse : ECAR pour chaque densité de placage (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 et 0,047 x 106) est indiqué. Chaque point de données représente la moyenne de 3 puits avec écart type. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Détection des changements métaboliques après l’activation des cellules NK par IL-15.
Test de stress mitochondrial : les parcelles OCR (A) et ECAR (B) sont indiquées pour 0,75 x 106 cellules au repos ou IL-15 activées. Chaque point de données représente la moyenne de 3 puits avec écart type. Les résultats sont représentatifs de 5 expériences indépendantes. Les changements de respiration basale et maximal pour le donneur humain individuel sont indiqués dans (C), tandis que la respiration liée à l’ATP, la fuite de protons, la respiration non mitochondriale (RMN) sont indiquées dans (D) et le rapport OCR/ECAR est indiqué dans (E). Glycolyse Test de stress : Les parcelles ECAR (F) et OCR (G) sont indiquées pour 0,75 x 106 cellules au repos ou IL-15 activées. Chaque point de données représente la moyenne de 3 puits avec écart type. Les résultats sont représentatifs de 5 expériences indépendantes. Les changements d’acidification extracellulaire basal et maximal pour chaque donneur humain sont indiqués dans (H). ns: non significatif; * p 0,05; ** p 0,01; p 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Contribution de l’ACT et de la glycolyse sur l’ECAR.
Les premières mesures de l’ECAR correspondent en grande partie à l’acidification due au CO2 produit dans le cycle TCA. Après l’ajout de glucose pour alimenter la glycolyse, la contribution de l’acidification dérivée du TCA à l’ECAR diminue. L’injection d’antimycine A et de Rotenone bloque le TCA, et la glycolyse compense l’augmentation de la demande d’ATP en augmentant à son niveau maximal (glycolyse compensatoire). Le blocage de la glycolyse par 2-DG diminue l’ECAR à des niveaux minimes, correspondant à l’acidification qui n’est pas attribuée à la glycolyse ou à l’activité respiratoire ainsi qu’à toute glycolyse résiduelle non entièrement inhibée par 2-DG (post 2-DG-acidification). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Réactif Concentration de travail Clone (pour anticorps) Volume final de coloration
Souris anti-humain CD3 BV711 50 ng/ml UCHT1 100 μl
Souris anti-humain CD56 PE 1/50 dilution B159 100 μl
Souris anti-humaine NkP46 PE 1/50 dilution 9/E2 100 μl
Teinture de viabilité 1/1000 dilution 500 μl

Tableau 1 : Réactifs et anticorps utilisés pour la cytométrie du débit.

Mitochondrial Stress Test
Port Volume Composé 10x Stock Concentration finale dans l’essai
Un 20 μl oligomycine 10 μM 1 μM
B 22 μl Dnp 1 mM 0,1 mM
C 25 μl antimycine A + roténone 10 μM chacun 1 μM chacun
Test de stress de glycolyse
Port Volume Composé 10x Stock Concentration finale dans l’essai
Un 20 μl Glucose 100 mM 10 mM
B 22 μl antimycine A + roténone 10 μM chacun 1 μM chacun
C 25 μl 2-DG 500 mM 50 mM

Tableau 2 : Chargement composé.

Étape Boucle Répéter (fois)
Mélange Attendre Mesure
Étalonnage ––
Équilibrage ––
Lectures de base 3 minutes 0 minutes 3 minutes 3
Boucle de fin ––
Injecter le port A ––
Mesures 3 minutes 0 minutes 3 minutes 3
Boucle de fin ––
Injecter le port B ––
Mesures 3 minutes 0 minutes 3 minutes 3
Boucle de fin ––
Injecter le port C ––
Mesures 3 minutes 0 minutes 3 minutes 3
Boucle de fin ––
Programme de fin ––

Tableau 3 : Disposition du programme.

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Discussion

Dans cet article, nous avons établi un protocole pour isoler et cultiver efficacement les cellules NK primaires primaires pures et viables du sang périphérique. Nous avons également optimisé les conditions pour la mesure de l’activité métabolique de ces cellules NK évaluées par le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire en utilisant un analyseur de flux extracellulaire. Par rapport à d’autres méthodes respiratoires, l’analyseur de flux extracellulaire est rapide, nécessite un petit nombre de cellules et permet des dépistages à haut débit. Cependant, ses réactifs sont coûteux, et les injections de composés sont limitées à seulement quatre. Le remodelage métabolique et l’activation de la glycolyse et de la phosphorylation oxydative par cytokines dans la cellule NK est essentiel pour les réponses robustes de cellules de NK21, et les techniques décrites ici permettent l’étude du profil métabolique des cellules NK en temps réel. Ce protocole pourrait être étendu aux cellules activées par d’autres cytokines, telles que l’IL-2, l’IL-12 et l’IL-18, ou aux anticorps qui se lient aux récepteurs d’activation. Nous avons abordé plusieurs étapes clés qui sont souvent négligées, telles que le placage des cellules à la confluence optimale ou l’utilisation de la concentration optimale de découpleur pour stimuler la consommation maximale d’oxygène. Néanmoins, nous recommandons de vérifier les courbes réelles de niveau O2 (Figure 3C), si d’autres stimuli différents de l’IL-15 sont donnés aux cellules, pour s’assurer que O2 n’est pas épuisé dans les puits. Si tel était le cas, le nombre de cellules devrait être diminué jusqu’à ce qu’une consommation linéaire d’O2 soit observée pour empêcher une sous-estimation de l’OCR réel.

La respiration basale reflète l’état métabolique basal de la cellule, qui est largement contrôlée par l’activité de la synthase ATP mitochondrial8, et est une indication de la demande basale d’ATP (pour la synthèse de protéine, la dynamique de cytosquelette, les ATPases telles que le Na+/K+-ATPase, etc.). Typiquement, en présence de substrats suffisants, ce paramètre augmente dans les cellules métaboliquement actives ou stressées. L’ajout d’oligomycine, qui bloque la synthase ATP, révèle la respiration liée à l’ATP et la fuite de protons, qui peut se produire à travers la bicouche lipidique ou les protéines de la membrane mitochondriale interne, mais peut également être inductible par des protéines telles que les protéines uncoupling (UCP)9, impliqués dans la régulation de la thermogenèse adaptative et convertissant ainsi le potentiel d’énergie mitochondriale à la chaleur dans les adipocytes bruns. La respiration maximale est déterminée par des facteurs tels que la disponibilité de substrats pour la chaîne respiratoire mitochondriale et la quantité et l’activité des complexes respiratoires. Les complexes respiratoires mitochondriaux et leur activité peuvent également être modifiés par des modifications posttranslationnelles telles que l’acétylation ou la phosphorylation22,23. Ce paramètre peut également indiquer la santé des cellules et leur capacité à répondre aux insultes aiguës. Dans les situations de dysfonctionnement mitochondrial, la respiration maximale diminue, ce qui limite la capacité de la cellule à répondre aux changements de la demande d’ATP et conduit à la mort cellulaire24.

Il est très important de noter que, pour chaque point de temps des tests de stress mitochondrial et glycolyse, ECAR est la somme de l’acidification dérivée de la glycolyse (via la génération de lactate + H+) et l’acidification dérivée des voies respiratoires (via la génération de CO2, qui se dissout en H2O pour générer HCO3- et H+), et surtout, l’acidification dérivée des voies respiratoires peut représenter une proportion substantielle de l’ECAR total dans certains types de cellules25. Pour les chercheurs intéressés, il existe des protocoles publiés pour calculer les taux glycolytiques réels. À cette fin, les taux de consommation d’oxygène pendant le test de résistance glycolytique (figure 4G) peuvent être utilisés pour calculer le taux de production de protons par respiration à chaque moment, et cette valeur peut être soustraite du taux total de production de protons, qui est obtenu en utilisant les valeurs ECAR et la puissance tampon du milieu7,25,26.

Une modification importante de ce protocole par rapport à la recommandation du fabricant est la deuxième injection du test de stress de glycolyse. L’antimycine A et la roténone sont préférées à l’oligomycine, pour plusieurs raisons qui ont déjà été décrites7: 1) certaines cellules présentent une capacité glycolytique élevée qui peut répondre pleinement à la demande basale d’ATP de la cellule, même en l’absence de phosphorylation oxydative; 2) le blocage de l’ETC avec l’antimycine A et la roténone augmente artificiellement la demande d’ATP de la cellule, car il provoque l’hydrolyse ATP par la synthase ATP (les mitochondries deviennent un évier ATP), qui s’inverse pour pomper les protons dans une tentative de récupérer le potentiel de membrane mitochondriale qui s’effondre après inhibition respiratoire; 3) le blocage de l’ETC empêche l’acidification respiratoire du milieu (COrespiratoire 2 généré dans le cycle TCA qui est converti en HCO3- et H+) qui peut confondre les résultats de l’ECAR. Ainsi, l’ECAR maximal observé avec l’antimycine A et la roténone n’est attribuable qu’à la glycolyse. Fait intéressant, il a été rapporté que l’ECAR observé avec les inhibiteurs respiratoires seuls peut encore être submaximal7, et un mécanisme supplémentaire pour augmenter la demande d’ATP cellulaire (et donc maximal ECAR) a été décrit: l’ajout de la monensine ionophore, qui augmente l’importation de Na+ dans la cellule27 et stimule le taux d’hydrolyse ATP par la membrane plasmatique Na+/K+-ATPase, au mélange d’antimycine A et de roténone7.

Un deuxième concept important est que nous ne recommandons pas la soustraction de l’acidification non glycolytique, qui correspond probablement au CO2 respiratoire qui est converti en HCO3- et H+, de la trace entière pour calculer les paramètres glycolytiques recommandés par le fabricant, comme cette quantité change considérablement au cours de chaque étape de l’essai de stress glycolyse (il est le plus élevé dans l’état basal, diminue après addition de glucose en raison de l’effet Crabtree20, et est pratiquement aboli avec l’antimycine A et roténone) (Figure 5).

Pour résumer, ce protocole montre un outil simple et efficace pour tester l’activité métabolique des cellules tueuses naturelles humaines avec un analyseur de flux extracellulaire. Cette méthode peut être utilisée pour interroger l’état métabolique dans ces cellules, qui est connu pour changer avec l’activation cellulaire par stimulation de cytokine ou dans certaines conditions pathologiques, y compris l’obésité, le cancer ou les infections virales28.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Dr Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) pour leur soutien et leur discussion. Cette étude a été soutenue par les programmes de recherche intra-muros des National Institutes of Health, de l’Institut national du cancer et du National Heart, Lung, and Blood Institute. JT est soutenu par le programme Ramon y Cajal (subvention RYC2018-026050-I) de MICINN (Espagne).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

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References

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Immunologie et infection Numéro 160 Cellules tueuses naturelles métabolisme flux extracellulaire glycolyse mitochondries respiration chaîne de transport d’électrons cytométrie de flux
Analyse du métabolisme des cellules tueuses naturelles humaines
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Traba, J., Waldmann, T. A., Anton,… More

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

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