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Immunology and Infection

Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/61466
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Messung der Glykolyse und mitochondrialen Atmung in primären menschlichen natürlichen Killerzellen (NK), die aus peripherem Blut isoliert sind, im Ruhezustand oder nach IL15-induzierter Aktivierung. Das beschriebene Protokoll könnte leicht auf primäre menschliche NK-Zellen ausgedehnt werden, die durch andere Zytokine oder lösliche Reize aktiviert werden.

Abstract

Natural Killer (NK) Zellen vermitteln hauptsächlich angeborene Anti-Tumor- und antivirale Immunreaktionen und reagieren auf eine Vielzahl von Zytokinen und anderen Reizen, um das Überleben, die Zellproliferation, die Produktion von Zytokinen wie Interferongamma (IFN) und/oder Zytotoxizitätsprogramme zu fördern. Die Aktivierung von NK-Zellen durch Zytokinstimulation erfordert eine erhebliche Umgestaltung der Stoffwechselwege, um ihre bioenergetischen und biosynthetischen Anforderungen zu unterstützen. Es gibt eine große Menge von Beweisen, die darauf hindeuten, dass beeinträchtigter NK-Zellstoffwechsel mit einer Reihe von chronischen Krankheiten wie Fettleibigkeit und Krebs verbunden ist, was die klinische Bedeutung der Verfügbarkeit einer Methode zur Bestimmung des NK-Zellstoffwechsels unterstreicht. Hier beschreiben wir den Einsatz eines extrazellulären Flussanalysators, einer Plattform, die Echtzeitmessungen der Glykolyse und des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs ermöglicht, als Werkzeug zur Überwachung von Veränderungen im Energiestoffwechsel menschlicher NK-Zellen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht auch die Überwachung von Stoffwechselveränderungen nach der Stimulation von NK-Zellen mit Zytokinen wie IL-15, einem System, das derzeit in einer Vielzahl von klinischen Studien untersucht wird.

Introduction

Natürliche Killerzellen (NK) sind angeborene Lymphozyten, die Antitumor- und antivirale Reaktionen vermitteln. NK-Zellen machen 5-15% aller Lymphozyten im menschlichen peripheren Blut aus und können auch in Milz-, Leber-, Knochenmark- und Lymphknoten gefunden werden. NK-Zellen exprimieren keine polymorphen Clonoppic-Rezeptoren wie T-Zell-Rezeptoren (TCR) oder B-Zell-Rezeptoren (BCR). Im Gegensatz dazu wird die Aktivierung ihrer zytolytischen Funktionen durch das Eingreifen von Rezeptoren ausgelöst, die unveränderliche Liganden auf der Oberfläche einer Zielzelle1,2erkennen.

Ruhende menschliche NK-Zellen, die aus peripherem Blut isoliert sind, können mehrere Tage im Kulturmedium überleben, das mit menschlichem Serum ergänzt wird. Die Aktivierung von NK-Zellen durch Zytokine wie IL-15 oder IL-2 treibt die Zellen zur Proliferation und zu einer Erhöhung ihrer Tötungsfähigkeit, unter anderem3,4,5. Mehrere Studien haben eine direkte Korrelation zwischen NK-Zellaktivierung und Veränderungen ihrer metabolischen Aktivität gezeigt6. Diese metabolischen Veränderungen sind dazu bestimmt, die besonderen Anforderungen der Zellen in Bezug auf Energie und Biosynthese zu erfüllen.

Aerobe Zellen und Organismen erhalten Energie durch eine Reihe von chemischen Reaktionen, die den Katabolismus und die Oxidation von Kohlenhydraten, Fett und Proteinen beinhalten. Durch eine Kombination aus Glykolyse, dem Tricarbonsäurezyklus (TCA) und oxidativer Phosphorylierung erfüllen eukaryotische Zellen den Großteil ihres ATP-Bedarfs und erhalten Zwischenprodukte, die als Bausteine für Makromoleküle benötigt werden, die für das Zellwachstum und die Zellproliferation unerlässlich sind. Der Prozess der Glykolyse (Abbildung 1A) beginnt mit dem Eintrag von Glukose in der Zelle. Im Zytosol wird Glukose phosphoryliert und in Pyruvat umgewandelt (mit einer Nettoproduktion von 2 Molekülen VON ATP pro Glukosemolekül), die zu Laktat reduziert oder in die Mitochondrien transportiert werden können, um in Acetyl-CoA umgewandelt zu werden und in den TCA-Zyklus einzutreten. Der TCA-Zyklus setzt den Zyklus mit mehr Molekülen von Acetyl-CoA weiter und produziert CO2 (das schließlich außerhalb der Zelle diffundieren wird und durch Reaktion mitH2O im Medium Kohlensäure erzeugt, die zur Versauerung des Mediums führt) und NADH, dem Molekül, das für die Elektronenabgabe an die Elektronentransportkette (ETC) zuständig ist. Die Elektronen wandern durch verschiedene Proteinkomplexe und werden schließlich durch Sauerstoff akzeptiert. Diese Komplexe (I, III und IV) pumpen auch H+ aus der mitochondrialen Matrix in den Intermembranraum. Als Folge des erzeugten elektrochemischen Gradienten wird das H+ durch die komplexe V (ATP-Synthase) wieder in die Matrix eindringen und die in die ATP-Erzeugung angesammelte potentielle Energie investieren.

Sowohl die Glykolyse als auch die mitochondriale Atmung können an verschiedenen Stellen durch die Verwendung von Inhibitoren blockiert werden. Das Wissen und die Verwendung dieser Inhibitoren war die Grundlage für die Entwicklung des extrazellulären Fluss-Assays. Durch die Messung von zwei einfachen Parametern in Echtzeit wie pH und Sauerstoff leitet der extrazelluläre Flussanalysator die Rate der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung in einer 96-Well-Platte ab. Der Glykolyse-Stresstest wird in einem Basalmedium ohne Glukose durchgeführt (Abbildung 1B)7. Die ersten Messungen der extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) deuten auf eine glykolyseunabhängige Versauerung hin. Es wird als nicht-glykolytische Versauerung bezeichnet und korreliert mitCO2, das von der TCA produziert wird, die, wie bereits erläutert, mitH2O im Medium kombiniert wird, um H+ (TCA-verknüpftes ECAR) zu erzeugen. Die erste Injektion ist Glukose, um Glukose-Nutzung zu induzieren und DieGlykolyse zu steigern. Die zweite Injektion kombiniert sowohl Roton- als auch ein Complex-I-Hemmer und Antimycin A, ein Komplexer III-Hemmer zusammen, um den ETC zu blockieren. Zellen reagieren auf diese dramatische Abnahme der mitochondrialen ATP-Produktion durch Aktivierung der Glykolyse zur Aufrechterhaltung der zellulären ATP-Spiegel, und dies stellt die Menge an Glykolyse dar, die von der Zelle im Basalzustand nicht verwendet wird, sondern möglicherweise als Reaktion auf die Erhöhung der ATP-Nachfrage rekrutiert werden könnte. Die dritte Injektion ist die Glukose analog e2-Deoxyglucose (DG), die mit Glukose als Substrat für das Enzym Hexokinase konkurriert. Das Produkt dieser Phosphorylierung, 2-Deoxyglucose-6-Phosphat kann nicht in Pyruvat umgewandelt werden, und daher wird die Glykolyse blockiert, was das ECAR auf das Minimum senkt. Das an dieser Stelle gemessene ECAR umfasst andere Quellen der extrazellulären Versauerung, die nicht der Glykolyse oder Atemaktivität zugeschrieben werden, sowie jede verbleibende Glykolyse, die durch 2-DG (nach der 2-DG-Versauerung) nicht vollständig gehemmt wird.

Der mitochondriale Stresstest wird in einem Medium mit Glukose durchgeführt (Abbildung 1C)8. Die ersten Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) entsprechen der Grundlinie der mitochondrialen Atmung (Basalatmung). Die erste Injektion ist Oligomycin, das die Rückkehr von Protonen durch die ATP-Synthase (Komplex V) hemmt, die ATP-Synthese blockiert und damit die mitochondriale Membran schnell hyperpolarisiert, was ein weiteres Protonenpumpen durch Atemkomplexe verhindert und zu einer Abnahme der OCR führt. Der Vergleich zwischen der Basisatmung und dem durch Addition von Oligomycin angegebenen Wert stellt die ATP-verknüpfte Atmung dar. Die verbleibende Oligomycin-unempfindliche Rate des Sauerstoffverbrauchs wird Protonenleck genannt, das den Fluss von Protonen durch die Lipid-Doppelschicht oder Proteine in der inneren mitochondrialen Membran wie das Adenin-Nukleotid-Translocase9darstellt. Die zweite Injektion ist der Unkoppler 2,4-Dinitrophenol (DNP), ein Ionophor, das einen massiven Eintrag von H+ in die mitochondriale Matrix induziert, was zu einer Depolarisation der mitochondrialen Membran und einer Störung der mitochondrialen ATP-Synthese führt. Zellen reagieren auf die Ableitung der Protonen-Antriebskraft, indem sie die Rate des Elektronentransports und des Sauerstoffverbrauchs auf ein Höchstmaß erhöhen, um das Membranpotenzial (maximale Atemkapazität) wiederzuerlangen. Der Unterschied zwischen der maximalen Atemfrequenz und der Basalatmung ist die freie Atemkapazität der Zelle, die die Menge der Atmung darstellt, die nicht von der Zelle verwendet wird, um ATP im Basalzustand zu erzeugen, sondern möglicherweise als Reaktion auf die Erhöhung der ATP-Nachfrage oder unter Stressbedingungen eingestellt werden könnte8. Die dritte Injektion ist eine Kombination aus Roton und Antimycin A. Diese Injektion stoppt die ETC vollständig und OCR sinkt auf den niedrigsten Stand, wobei der verbleibende Sauerstoffverbrauch nicht mitochondrial ist (verursacht durch NADPH-Oxidasen usw.).

Veränderungen der Stoffwechselwege könnten irgendwie die Funktionsweise von NK-Zellen vorhersagen, da es vorgeschlagen wurde, dass die kontinuierliche Aktivierung von NK-Zellen mit Zytokinen in vitro zu einer Erschöpfung der NK-Zellen durch die Untersuchung verschiedener Stoffwechselwege führen könnte10,11. Die Korrelation zwischen dem metabolischen Status und der Funktion der NK-Zelle ist aus der Sicht der Krebsimmuntherapie sehr wichtig. In diesem Bereich wurde die Aktivierung von NK-Zellen mit Infusion von IL-15, allein oder in Kombination mit monoklonalen therapeutischen Antikörpern getestet, um die Tumorzelltötung12,13,14zu verbessern. Das Wissen um den metabolischen Status der NK-Zellen als Reaktion auf diese Behandlungsstrategien würde einen wertvollen Prädiktor für den Aktivierungsstatus und die Tötungsfunktion der NK-Zellen liefern.

Die Untersuchung von Stoffwechselwegen in anderen myeloischen und lymphoiden Zellen wie Monozyten, T- und B-Zellen wurde beschrieben15 und optimierte Methoden wurden veröffentlicht16. In diesem Protokoll bieten wir eine Methode, die sowohl ein NK-Isolationsprotokoll kombiniert, das eine hohe Anzahl reiner und lebensfähiger NK-Zellen liefert, als auch ein optimiertes Protokoll zur Messung der metabolischen Aktivität mit einem extrazellulären Flussanalysator. Hier zeigen wir, dass dies eine gültige Methode für die Untersuchung von metabolischen Veränderungen in ruhenden und IL-15 aktivierten menschlichen NK-Zellen ist. Für den extrazellulären Flusstest wurden Parameter wie Zellzahl und Wirkstoffkonzentrationen getestet und optimiert. Im Vergleich zu anderen respirometrischen Methoden ist der extrazelluläre Flussanalysator vollautomatisch und in der Lage, in Echtzeit zu testen, mit sehr geringen Zellmengen, bis zu 92 Proben gleichzeitig, und ermöglicht somit Hochdurchsatz-Screenings (mit mehreren Proben und Replikationen) relativ schnell17.

Diese Methode kann von Forschern verwendet werden, die an der Beurteilung der NK-Zellfunktion interessiert sind, indem sie den NK-Zellstoffwechsel untersuchen. Es könnte auch auf Zellen angewendet werden, die durch andere Zytokine, Antikörper oder lösliche Reize aktiviert werden.

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Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinkis ethischen Grundsätzen der medizinischen Forschung durchgeführt. Periphere Blutproben von Spendern wurden von der NIH-Abteilung für Transfusionsmedizin gemäß dem von der IRB zugelassenen Protokoll 99-CC-0168 mit schriftlicher Zustimmung des Patienten erhalten.

1. Reagenzzubereitung

  1. Reagenzien zur Isolierung von NK-Zellen
    HINWEISE: Bereiten Sie diese Reagenzien in einer Zellkulturhaube vor.
    1. Nk-Trennpuffer vorbereiten: Zusatz-PBS (pH 7,4) mit 1 mM EDTA und 2% Fetal Calf Serum (FCS), das zuvor wärmeinaktiviert wurde (bei 56 °C für 30 min).
    2. Vorbereiten des NK-Kulturmediums: Ergänzen Sie Iscoves modifizierte Dulbecco-Medien (IMDM) mit 10% Human Serum (HS). Sterilfilter und bei 2-8 °C lagern. Erwärmen Sie das Medium auf 37 °C, bevor Sie es den Zellen hinzufügen.
    3. Setzen Sie Human IL-15 in PBS bei 200 g/ml aus.
  2. Reagenzien für extrazellulären Flusstest
    1. Assay-Medien vorbereiten: Für das mitochondriale Stresstestmedium 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin und 10 mM Glukose in das Basismedium geben; für Glykolyse-Stresstestmedium 2 mM L-Glutamin in das Basismedium geben.
      HINWEIS: Die Konzentrationen von Glukose, Pyruvat und Glutamin werden wie vom Hersteller des extrazellulären Flussanalysators empfohlen. Die Medienzusammensetzung kann jedoch von den Forschern verändert werden, um auf Wunsch perfekt mit der des Kulturmediums übereinzupassen.
    2. Stellen Sie den pH-Wert beider Medien auf 7,4 mit 0,1 N NaOH mit einem pH-Meter an der Bank ein, steriler Filter durch eine Porengröße von 0,2 m und lagern Sie ihn bei 2-8 °C. Warmmedien auf 37 °C, pH-Wert prüfen und vor Dem Einsatz vor Gebrauch auf 7,4 umstellen.
      HINWEIS: In2 der Atmosphäre des extrazellulären Flussanalysators ist nur Umgebungs-CO2 enthalten, die Verwendung von Medien ohne Bicarbonat ist entscheidend.
    3. Bereiten Sie Lagerlösungen für Reagenzien vor: Oligomycin (ATP-Synthase-Inhibitor), 10 mM Stofflösung in DMSO; 2,4-Dinitrophenol (DNP, Entkoppler), 1 M Stammlösung in DMSO; Antimycin A (komplexer III-Hemmer), 10 mM Stofflösung in DMSO; Rotone (Komplex I-Hemmer), 10 mM Stammlösung in DMSO. Machen Sie 30 L Aliquots aller Reagenzien und lagern Sie bei -20 °C.
      HINWEIS: Diese Richtlinien sind für Reagenzien bestimmt, die einzeln gekauft und vom Forscher hergestellt werden. Wenn stattdessen Reagenzien beim Analysatorhersteller gekauft werden, befolgen Sie die Richtlinien für die Reagenzienzubereitung.

2. Isolierung von NK-Zellen aus peripherem Blut

  1. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) aus menschlichem Blut
    HINWEIS: Führen Sie diese Schritte in einer Zellkulturhaube aus. Alle Rückstände und Materialien, die mit Blut in Berührung mit Bleichmittel gelangen, zu dekontaminieren und in den entsprechenden Behälter zu entsorgen, um verbrannt zu werden.
    1. Pipette 20 ml Lymphozytentrennmedium (LSM) in ein 50 ml konisches Rohr.
    2. Vorsichtig, während das Rohr in einem 30° Winkel zu halten, Pipette 20 ml Blut über dem LSM, sehr sanft und berühren die Wand des Rohres. Vermeiden Sie das Mischen von Blut mit dem LSM und schaffen Sie eine sichtbare und klar definierte Interphase zwischen den beiden Flüssigkeiten.
      HINWEIS: Peripheres Blut oder angereicherte Leukapherese-Produkte können verwendet werden.
    3. Zentrifugieren Sie die Rohre für 25 min, 1000 x g bei Raumtemperatur. Verwenden Sie keine Bremse, da sie beide Phasen in der Röhre (LSM und Blut) mischen könnte.
    4. Nehmen Sie die Rohre vorsichtig aus der Zentrifuge heraus und legen Sie sie in ein Rack. Prüfen Sie, ob eine auffällige Zellschicht (mononukleäre Zellen) vorkommt, die sich in der Interphase zwischen LSM (klar) und Plasma (gelb) bildet, während rote Blutkörperchen an der Unterseite der Röhre pellet.
    5. Die mononukleäre Zellschicht vorsichtig mit einer 10 ml Kunststoffpipette (ca. 5-8 ml) ansaugen und in ein neues 50 ml kegelförmiges Rohr legen. Die Lymphozyten-Interphase von bis zu 2 verschiedenen Röhren kann zusammengepoolt werden.
    6. Waschen Sie die mononukleären Zellen 2x, indem Sie in 45 ml PBS wieder aufsetzen und bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrieren.
      HINWEIS: Nach diesem Schritt wird ein Pellet peripherer mononukleischer Blutzellen (PBMCs) erhalten, und der Forscher kann zum NK-Isolationsschritt übergehen.
  2. NK-Isolierung von PBMCs
    1. Zählen Sie die Zellen ab 2.1.6 und setzen Sie sie im NK Separation Buffer (1x 108 PBMCs/ml) wieder aus.
    2. Nehmen Sie 10 ml der Zellresuspension (109 PBMCs ) und legen Sie sie in ein 50 ml Rohr.
    3. Fügen Sie den PBMCs 50 l/ml Puffer und 10 l (1 L/ml Puffer) Anti-CD3-positive Isolationsantikörpermischung zu den PBMCs hinzu und bei Raumtemperatur 10 min zu inkubieren.
    4. Wirbeln Sie die magnetischen Perlen und fügen Sie 1 ml in die Mischung von PBMCs mit Antikörpern (100 L Perlen/ml PBMCs). 10 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren inkubieren.
    5. 35 ml NK-Isolationspuffer (3,5 ml Puffer/ml PBMCs) hinzufügen, mischen und 15 min (2,2 x 107 PBMCs/ml) auf den Magneten legen. Danach werden die Perlen und Zellen positiv ausgewählt (alle außer NK-Zellen) an den Wänden der Röhre haften.
    6. Sammeln Sie den Überstand (mit NK-Zellen) sorgfältig mit einer 50 ml Kunststoffpipette, ohne die Seiten oder den Boden des Rohres zu berühren.
    7. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und Zentrifuge bei 800 x g für 5 min.
    8. Isolieren Sie isolierte NK-Zellen bei 5 x 106 Zellen/ml in IMDM, die 10% HS enthalten, und legen Sie sie in einen Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2, bis das Experiment durchgeführt wird.
      HINWEIS: Dieses NK-Isolationsprotokoll gibt Zellnummern und Reagenzvolumina an, die für die Verwendung eines 50 ml-Rohrs und eines großen Magneten angepasst sind. Dieses Protokoll kann skaliert werden (falls mehr PBMCs erhalten werden), indem die Isolationsschritte in verschiedenen Rohren wiederholt oder durch Reduzierung des Volumens im Rohr verkleinert werden. Für Endvolumina von 14-45 ml wird ein 50 ml Polystyrolrohr verwendet, für die Volumina 4-14 wird ein 15 ml Polystyrolrohr verwendet und für Volumen 1-4 ml wird ein 5 ml Polystyrolrohr verwendet. Der Magnet ist anders und passt jeweils auf das entsprechende Rohr. Die Menge an Antikörper-Mix und Magnetperlen kann auch entsprechend der Anzahl der Zellen und dem endgültigen Volumen skaliert werden.
  3. NK-Zellpopulationsfärbung für Durchflusszytometrie
    1. Nehmen Sie 0,25 x 106 Zellen pro Probe aus Schritt 2.2.8, entfernen Sie das Medium durch Zentrifugieren bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur und setzen Sie das Zellpellet in 500 l PBS wieder auf.
    2. Fügen Sie lebensfähigkeitsfähigkeitfarbstoff nach der Empfehlung des Herstellers hinzu (1 L DMSO-rekonstituierter Farbstoff auf 1 ml Zellresuspension) und brüten bei Raumtemperatur für 30 min.
    3. 2x waschen, indem man in 5 ml PBS wieder aufsetzt und bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert wird.
    4. Stain mit den entsprechenden antihumanen Antikörpern in 100 l IMDM, die 10% HS für 30 min auf lichtgeschütztem Eis enthalten (siehe Tabelle 1). Alle Antikörper können kombiniert und in einem einzigen Färbeschritt verwendet werden.
    5. Analysieren Sie die Proben durch Durchflusszytometrie, um die Reinheit der erhaltenen NK-Zellpopulation zu bewerten. Verwenden Sie die zuvor beschriebene Zellgating- und Analysemethode18,19.
  4. NK-Zellenstimulation mit löslichem IL-15
    1. 0,75 x 106 Zellen aus den Schritten 2.2.8 oder 2.4.3 in 100 l IMDM mit 10% HS in einem Brunnen einer 96-Well-Platte (rund unten) wieder aufsetzen.
    2. Verdünnen Sie die menschliche IL-15 bis 1 g/ml in IMDM mit 10% HS. Fügen Sie 100 l des verdünnten menschlichen IL-15 in die Zellen ein, um eine Endkonzentration von 0,5 g/ml zu erreichen.
      HINWEIS: 0,5 g/ml ist eine Sättigungskonzentration von IL-15. Niedrigere Konzentrationen von IL-15 oder anderen Zytokinen wie IL-2, IL-12 oder IL-18 können von Forschern auf Wunsch getestet werden.
    3. Legen Sie die Zellen bei 37 °C in den Inkubator und stimulieren Sie 48 h, bevor Sie den extrazellulären Flusstest durchführen. Heben Sie unstimulierte (Kontroll-)Zellen bei gleicher Konzentration und Volumen in IMDM mit 10% HS ohne IL-15 aus und legen Sie sie 48 h im selben Inkubator ab.

3. Hydration der Sensorpatrone

HINWEIS: Die 96 Sondenspitzen der Sensorpatrone enthalten einzelne Festkörperfluorophore fürO2 und H+, die hydratisiert werden müssen, um O2- und pH-Veränderungen zu erkennen.

  1. Schalten Sie den Analysator ein und lassen Sie ihn auf 37 °C erwärmen.
  2. Öffnen Sie das Sensorkassettenpaket, und trennen Sie die Sensorpatrone von der Versorgungsplatte. Fügen Sie in jedem Brunnen der Nutzplatte 200 l der Kalibrierlösung hinzu und legen Sie die Sensorpatrone wieder auf die Platte, um zu überprüfen, ob die Sensoren vollständig in die Lösung eingetaucht sind. Für optimale Ergebnisse inkubieren Sie die Patrone über Nacht bei 37 °C in einemCO2-freienInkubator, der richtig befeuchtet wird, um Verdunstung zu verhindern. Verhindern Sie Blasenbildung unter den Sensoren während der Hydratation.
    HINWEIS: Die minimale Kartuschen-Hydratationszeit beträgt 4 h bei 37 °C in einemCO2-freienInkubator. Alternativ kann eine Nachthydratation der Sensorpatrone mit 200 l sterilem Wasser bei 37 °C in einemCO2-freienInkubator, gefolgt von einer Inkubation der Sensorpatrone mit 200 l vorgewärmter Kalibrierlösung 45 – 60 min vor Laufbeginn verwendet werden.

4. Extrazellulärer Flusstest

  1. Herstellung von klebstoffbeschichteten Platten
    HINWEIS: Da die Messung der metabolischen Parameter in einer Mikrokammer stattfindet, die am unteren Rand der 96-Well-Assay-Platte gebildet wird, müssen Suspensionszellen zuerst an der Unterseite des Brunnens haften. Ein aus der Muschel Mytilus edulis gewonnener Zellklebstoff kommt zum Einsatz. Der Hersteller des Zellktons empfiehlt eine Beschichtungskonzentration von 1 bis 5 g/cm2. Der Brunnen der Analysatorzellkultur-Mikroplatte hat eine Oberfläche von ca. 0,110cm2. So sind für eine Konzentration von 5 g/cm2 ca. 0,55 g Klebstoff erforderlich. Da bei der Beschichtung jedes Brunnens 25 l der Klebstofflösung verwendet werden, liegt die optimale Klebstofflösungskonzentration für die Analysatorzellkultur-Mikroplatten bei etwa 22,4 g/ml (22,4 g/ml x 0,025 ml = 0,56 g).
    1. 2,5 ml Zellklebstofflösung (22,4 g/ml) in 0,1 m Natriumbicarbonat, pH 8,0 vorbereiten. Bicarbonat bietet den optimalen pH-Wert für die zellhafte Leistung, die laut Hersteller zwischen 6,5 und 8,0 liegt.
    2. Pipette 25 l der Zellklebelösung an jedem Brunnen der Assayplatte und bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren. Danach entfernen Sie die Lösung und waschen 2x mit 200 l sterilem Wasser/Brunnen. Lassen Sie die Brunnen trocknen, indem Sie die Platte für 15 Minuten in einer Zellkulturhaube offen halten.
      HINWEIS: Beschichtete Platten können bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
  2. Zellsaatierung in platten beschichtet mit Klebstoff
    1. Zentrifugenzellen ab Schritt 2.4.3 bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie Überstand und Waschzellen in gewärmten mitochondrialen Stresstestmedium (wenn ein mitochondrialer Stresstest durchgeführt wird) oder Glycolyse-Stresstestmedium (wenn ein Glykolyse-Stresstest durchgeführt wird). Pelletzellen wieder und wieder auf die bevorzugte Zellkonzentration im gleichen Medium (Resuspension Volumen hängt von der gewählten Zellkonzentration ab; da jeder Brunnen 180 l der Zellsuspension enthalten wird, 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106, 2,08 x 106, 4,17 x 106 und 8,33 x 106 Zellen/ml Zellsuspensionen für 0,047 x 106, 0,094 x 106, 0,187 x 106, 0,375 x 106, 0,75 x 106 bzw. 1, 5 x 106 Zellen pro Brunnen).
    2. Platte 180 l Zellsuspension pro Brunnen an der Seite jedes Brunnens. Eine Mehrkanalpipette wird empfohlen. Verwenden Sie die Bohrungen A1, A12, H1 und H12 der Analyzer-Kulturplatte als Steuerbrunnen für die Hintergrundkorrektur. Fügen Sie 180 L des Assaymediums in diese Brunnen (keine Zellen) ein. Zusätzliche Steuerbrunnen können auf Wunsch und bei ausreichender Platzin der Platte verwendet werden.
      HINWEIS: Das Vorhandensein von Serum kann zu einer schlechten Zellanhaftung führen.
    3. Inkubieren Sie die Platte 30 min bei 37 °C in einemCO2-freienInkubator. Bereiten Sie in der Zwischenzeit 10x Verbindungen vor (siehe Schritt 4.3 unten).
    4. Ändern Sie die Zentrifugeneinstellungen auf Nullbremse. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 x g für 5 min. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sie eine Monoschicht an der Unterseite des Brunnens bilden. Übertragen Sie die Platten für 25 min zurück in denCO2-freienInkubator. Für beste Ergebnisse sollte die Gesamtzeit nach der Beschichtung nicht größer als etwa 1 h sein.
  3. Vorbereitung von 10-fachen Arbeitslösungen zum Einladen in die Sensorpatrone
    HINWEIS: Jede der 96 Sondenspitzen der Sensorpatrone verfügt über 4 Anschlüsse (A, B, C und D), die verwendet werden können, um Verbindungen sequenziell in einzelne Brunnen zu injizieren.
    1. Für die Durchführung eines mitochondrialen Stresstests 2,5 ml mit je 10 M Oligomycin, 1 mM DNP und einer Mischung aus 10 M Roton und 10 M Antimycin A, in mitochondrialem Stress-Assay-Medium (verwenden Sie die Stammlösungen ab Schritt 1.2.3). Die Endkonzentrationen im Brunnen nach der Injektion betragen 1 M Oligomycin, 0,1 mM DNP und 1 M M Antimycin A/Roton.
    2. Zur Durchführung eines Glykolyse-Stresstests 2,5 ml einer Mischung aus 10 M Roton und 10 M Antimycin A im Glycolyse-Stress-Assay-Medium vorbereiten (verwenden Sie die Lagerlösungen ab Schritt 1.2.3). Glukose in Glykolyse-Stresstestmedium für eine 100 mM-Lösung und 2-Deoxy-Glucose (2-DG) im Glykolyse-Stresstestmedium für eine 500 mM-Lösung auflösen. Die Endkonzentrationen im Brunnen nach der Injektion betragen 10 mM Glukose, 1 m Antimycin A/Roton und 50 mMM 2-DG.
    3. Warmlösungen auf 37 °C, pH-Wert prüfen und bei Bedarf auf 7,4 umstellen. In Schritt 4.3.1 hergestellte Lastverbindungen. (für einen mitochondrialen Belastungstest) oder 4.3.2 (für einen Glykolyse-Stresstest) in die Anschlüsse A, B und C der hydratisierten Sensorpatrone (ab Schritt 3.2) mit einem Mehrkanal-Mikropipettor und den mit der Patrone gelieferten Port-Ladeführungen, wie in Tabelle 2dargestellt.
      HINWEIS: Um eine ordnungsgemäße Injektion in alle Brunnen während des Assays zu gewährleisten, muss jede Reihe von Ports, die verwendet werden (z. B. alle Anschlüsse A), das gleiche Injektionsvolumen für die gesamte Sensorpatrone enthalten. Dies gilt für Hintergrundkorrekturbrunnen und sogar für die Brunnen, die im Experiment nicht verwendet werden.
    4. Inkubieren Sie die geladene Sensorpatrone bei 37 °C in einemCO2-freienInkubator, während Sie das Programm einrichten.
  4. Einrichten von extrazellulären Fluss-Assay-Protokollen
    1. Öffnen Sie die software für den extrazellulären Flussanalysator, und zeigen Sie mithilfe der Registerkarten Gruppendefinitionen und Plattenkarten Gruppen von Brunnen an, die ähnliche Bedingungen aufweisen (z. B. Brunnen mit der gleichen Anzahl von Zellen oder Brunnen mit ruhenden Zellen oder IL-15-stimulierten Zellen). Geben Sie auch Hintergrundkorrekturbrunnen (standardmäßig werden A1, A12, H1 und H12 gesetzt, aber zusätzliche Brunnen können verwendet werden) und leere Brunnen an.
    2. Richten Sie das in Tabelle 3 in der Software beschriebene Programm über die Registerkarte Protokoll ein.
    3. Beginnen Sie das Programm mit der Registerkarte Ausführen von Assay. Legen Sie die Sensorpatrone (hydratisiert und mit 10x Verbindungen beladen) und die Nutzplatte auf das Tablett. Nach dem Kalibrierschritt (15 – 20 min) ersetzen Sie bei Aufforderung die Kalibrierplatte für die Assayplatte (ohne Deckel) durch angeschlossene Zellen. Danach erfolgt der Lauf vollautomatisch (die Maschine führt alle Messungen und Injektionen durch).
      ANMERKUNG: Es ist möglich, einen mitochondrialen Stresstest und einen glykolytischen Stresstest in derselben Platte durchzuführen, solange die spezifischen Verbindungen in die richtigen Ports (Oligomycin, DNP und Antimycin/Roton in den Ports A, B bzw. C der Brunnen, in denen ein mitochondrialer Stresstest durchgeführt wird; Glukose, Antimycin/Roton und 2-DG in den Ports A, B und C der Brunnen, in denen ein Glykolyse-Stresstest durchgeführt wird), werden in jeder Reihe von Ports und Brunnen für jeden Test korrekt anhand der Gruppendefinitionen und Plattenkarten-Registerkarten der Software identifiziert.
    4. Rufen Sie nach Abschluss der Ausführung die Daten ab und analysieren Sie sie mit der Software.

5. Zellzahlenbestimmung

HINWEIS: Die Ergebnisse können normalisiert werden, um mögliche Unterschiede in der Zellennummer zu berücksichtigen. Es können zwei wichtige Ansätze verwendet werden, die unten beschrieben werden.

  1. DNA-Gehaltsbestimmung
    1. Entfernen Sie das verbleibende Assaymedium mit einer Pipette aus jedem Brunnen. Achten Sie beim Anspirieren des Mediums darauf, die Zellen nicht zu stören. Die Platte kann bis zur Analyse bei -20 °C gelagert werden.
      HINWEIS: Der Gefrierschritt ist wichtig für die effiziente Zelllyse und die Bestimmung des DNA-Gehalts.
    2. Bereiten Sie eine 1x Lösung des Zellproliferations-Assay-Zelllysepuffers (20x) in destilliertem Wasser (200 l/well) vor.
    3. Fügen Sie die Zellproliferations-Assay-Farbstoff-Lösung (400x) in den 1x Zelllysepuffer ein. Für den Nachweis von 50 bis 50.000 Zellen pro Bohrkörper verwenden Sie 1x Zellproliferation Assay Farbstoff. Für höhere Zellzahlen wird die Verwendung des Zellproliferations-Assayfarbstoffs in einer Endkonzentration von mehr als 1x empfohlen. Verwenden Sie in diesem Fall den Zellproliferations-Assayfarbstoff in einer 5-fachen Endkonzentration (verdünnen Sie die Zellproliferations-Assay-Stammlösung 80-fach in 1x Zelllysepuffer).
    4. Fügen Sie jedem Brunnen 200 L des Zellproliferations-Astest-Reagenzes hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 2-5 min bei Raumtemperatur. Vor Licht schützen.
    5. Messung der Fluoreszenz der Proben bei Anregung: 480 nm; Emission: 520 nm mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser nach Herstellerempfehlungen.
  2. Proteingehaltbestimmung
    1. Vorsichtig das Assaymedium aus jedem Brunnen vollständig aspirieren, ohne die Zellen zu berühren und die Zellen bei -20 °Cfür mindestens 1 h einzufrieren. Alternativ können die Zellen länger (bis zu 1 Woche) eingefroren gehalten werden, bis die Analyse durchgeführt wird.
    2. Fügen Sie jedem Brunnen 50 L Radioimmunpräzipitations-Assay (RIPA)-Lysemedium hinzu, das mit 1x Protease-Inhibitoren (aus einer 100-fachen Stammlösung) ergänzt wird. Legen Sie die Platte auf einen Shaker für 5 min bei Raumtemperatur, und dann inkubieren Sie die Platte auf Eis für 30 min für eine vollständige Zelllyse.
    3. Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 200 x g bei Raumtemperatur. Dieser Schritt wird zellulären Ablagerungen pellet, um Störungen mit der Proteinmessung zu verhindern.
    4. Messen Sie die Proteinkonzentration durch Bicinchoninsäure (BCA) assay gemäß den Empfehlungen des Herstellers.

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Representative Results

Die Isolierung von NK-Zellen aus peripherem Blut sorgt für eine reine und lebensfähige Population

Der extrazelluläre Flusstest basiert auf der Messung der H+ undO2-Konzentration im Brunnen und unterscheidet nicht zwischen verschiedenen PopulationsvonZellen oder ihrer Lebensfähigkeit. Aus diesem Grund war die Erlangung einer sehr reinen und lebensfähigen Population der Zelle von Interesse der schlüsselfertige Schritt, um in diesen Experimenten erfolgreich zu sein.

Die Isolierung von NK-Zellen aus peripherem Blut wurde wie in Abschnitt 2 beschrieben durchgeführt. Um die Reinheit und Lebensfähigkeit der erhaltenen NK-Zellen zu beurteilen, wurden kleine Aliquots aus PMBCs und der isolierten NK-Zellpopulation gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert (Abbildung 2A). Mononukleare Zellen wurden in der Handlung mit Vorwärts (FSC-A) versus Seitenstreufläche (SSC-A) abgegrenzt. Innerhalb dieser Grundgesamtheit wurden einzelne Zellen entlang der Diagonale im Diagramm mit FSC-A versus Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) abgegrenzt. Innerhalb der Singlet-Populationen wurde die Lebensfähigkeit bewertet und ergab, dass sie sowohl bei PMBCs als auch bei NK-Zellpopulationen höher als 98 % lag. Die Reinheit der isolierten NK-Zellpopulation wurde durch doppelte Färbung gegen CD3 (in T-Zellen, der dominanten Population unter PBMCS) und CD56 oder NKp46(Abbildung 2B) nachgewiesen. NK-Zellen sind definiert als die Population negativ für CD3 und positiv für CD56 oder NKp46. Nach diesen Kriterien lag die Reinheit der NK-Zellen bei etwa 88 %, was einer 18-fachen Anreicherung von NK-Zellen im Vergleich zu denen in der PBMCs-Population entspricht.

OCR- und ECAR-Werte sind abhängig von der Zellennummer

Für den mitochondrialen Stresstest wurden die Zellen durch die Zugabe von drei verschiedenen Verbindungen metabolisch gestört: Oligomycin, DNP und Antimycin A + Roton. Für jeden Zelltyp wurde die Anzahl der Zellen pro Brunnen sorgfältig für ein extrazelluläres Fluss-Assay-Experiment optimiert. Abbildung 3A zeigt repräsentative Diagramme der mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) mit mehreren menschlichen NK-Zellnummern (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 und 0,047 x 106). Alle Messungen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Zellzahlen korrelieren linear mit der Menge an DNA oder Protein im Brunnen (Abbildung 3B). Wie erwartet zeigten hohe Zellenzahlen höhere OCR-Werte, während weniger als 0,187 x 106 Zellen pro Bohrkörper keine robusten Ergebnisse lieferten. Auf der anderen Seite waren höhere Zellzahlen (1,5 x 106) nicht optimal, da bei Zugabe von DNP die Sauerstoffkonzentration im Brunnen in jedem Zyklus völlig erschöpft war (Abbildung 3C), was die genaue Berechnung des OCR ausschließt. Die Konzentration des Entkopplers muss für jeden Zelltyp sorgfältig titriert werden, da das Nichtaddieren ausreichender DNP zu submaximaler OCR führt, während das Hinzufügen zu viel auch maximale OCR hemmen kann. In menschlichen NK-Zellen wurde festgestellt, dass 100 M DNP die optimale Dosis waren(Abbildung 3D). Andere Entkoppler wie Carbonylcyanid-4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) oder Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazin (CCCP) können anstelle von DNP verwendet werden, müssten aber auch für jeden Zelltyp titriert werden.

Für den Glykolyse-Stresstest wurden nach einer Basismessung des ECAR glukosehungrige Zellen durch folgende Verbindungen gestört: Glukose, Antimycin A + Roton und 2-DG. Abbildung 3E zeigt repräsentative ECAR-Plots mit mehreren NK-Zellennummern (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 und 0,047 x 106). Alle Messungen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Der Glykolyse-Stresstest war bei der höchsten Beschichtungsdichte am erfolgreichsten, während weniger als 0,187 x 106 Zellen pro Bohrkörper keine robusten Ergebnisse lieferten.

IL-15-Behandlung erhöht OCR- und ECAR-Basal- und Maximalwerte

Für nachfolgende Experimente wurde die optimale Saatdichte von 0,75 x 106 Zellen pro Bohrkörper verwendet. NK-Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von sättigenden Konzentrationen des Zytokins IL-15 für 48 h kultiviert, danach wurde festgestellt, dass ihre Lebensfähigkeit 93,7 x 4,8 % bzw. 85,7 x 12,0 % betrug. Abbildung 4A,B zeigt ein typisches mitochondriales Stresstestexperiment mit 0,75 x 106 NK-Zellen pro Brunnen. In diesem Test führt Oligomycin zu einem dramatischen Rückgang des Sauerstoffverbrauchs (Abbildung 4A) und zu einem Anstieg von ECAR, der einen Wechsel zur Glykolyse darstellt, um zu versuchen, die zellulären ATP-Werte aufrechtzuerhalten (Abbildung 4B). Die Aktivierung der NK-Zelle durch IL-15 führte zu einem Anstieg sowohl des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs als auch der extrazellulären Versauerung. Dieses Ergebnis war konsistent, wenn mehrere menschliche Probanden verglichen wurden (Abbildung 4C). Basal-, maximal- und ATP-verknüpfte Atmung, aber kein Protonenleck oder nicht-mitochondriale Atmung, erhöht mit IL-15 (Abbildung 4C,D). Auch die OCR/ECAR-Rate verringerte sich, was auf einen Trend hindeutet, nach der IL-15-Stimulation zu einem glykolytischen Stoffwechsel überzusteigen (Abbildung 4E).

Abbildung 4F,G zeigt ein typisches Glykolyse-Stresstestexperiment mit 0,75 x 106 NK-Zellen pro Brunnen. Die Zugabe von Glukose löste einen enormen Anstieg der ECAR aufgrund der Glykolyseaktivierung aus, während die anschließende Zugabe von Antimycin A und Roton eine kompensatorische Glykolyse verursachte und 2-DG eine Hemmung des Weges und eine Abnahme von ECAR auf das Minimum verursachte(Abbildung 4F). Parallel dazu verursachte Glukose durchweg einen leichten Rückgang des Sauerstoffverbrauchs, möglicherweise durch den Crabtree-Effekt20, während Antimycin A und Rotone die Atmung vollständig blockierten und 2-DG keine weiteren Effekte lieferte (Abbildung 4G). Die Aktivierung sowohl der extrazellulären Versauerung als auch des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs mit IL-15 konnte auch in diesem Test beobachtet werden, und dies ist wiederum konsistent, wenn Zellen von mehreren Spendern verwendet werden (Abbildung 4H).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische extrazelluläre Flusstests.
(A) Schematische Glykolyse, der Tricarbonsäurezyklus (TCA) und die Elektronentransportkette (ETC). Inhibitoren verschiedener Schritte sind rot geschrieben. Der Elektronenfluss im ETC wird in Grün mit dem NADH als Spender und dem O2 als Endakzeptor dargestellt. (B) Glycolyse-Stresstest-Schemaprofil, das die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) im Vergleich zur Zeit darstellt. (C) Mitochondriales Stresstest-Schemaprofil, das die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) im Vergleich zur Zeit darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Natürliche Killerzellen (NK) Zellen, die aus peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) gereinigt werden.
(A) Gating-Strategie zur Bewertung der Reinheit und Lebensfähigkeit von NK-Zellen (rechte Spalte) im Vergleich zur Gesamtzahl der PBMCs (linke Spalte). Aus dem Tor der mononukleären Zellen (obere Platten) wurden einzelne Zellen ausgewählt (Mittelplatten) und die Lebensfähigkeit wurde gemessen (untere Platten). (B) Live-Zellen wurden für CD3 und CD56 oder NKp46 gebeizt. Die Zahlen in den Bedienfeldern geben den Prozentsatz der Zellen in den ausgewählten Regionen an. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Optimierung der mitochondrialen und Glukose-Stresstests in aktivierten menschlichen NK-Zellen.
(A) Mitochondrialer Stresstest: OCR für jede Beschichtungsdichte (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 und 0,047 x 106) wird angezeigt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 3 Brunnen mit Standardabweichung dar. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. (B) DNA (Obere Platte) und Protein (unteres Panel) im Brunnen bei unterschiedlichen Beschichtungsdichten. Die Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 3 Brunnen mit Standardabweichung dar. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. (C) Rohsauerstoffgehalt Spuren in Brunnen ohne Zellen (schwarze Spur), 0,75 x 106 Zellen (blaue Spur) oder 1,5 x 106 Zellen (grüne Spur). In der grünen Spur nach Zugabe von DNP wird sauerstoffinter Sauerstoff in jedem Zyklus vollständig aufgebraucht. (D) Die freie Atemkapazität von 0,75 x 106 Zellen wurde in Gegenwart mehrerer DNP-Konzentrationen getestet. (E) Glykolyse-Stresstest: ECAR für jede Beschichtungsdichte (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 und 0,047 x 106) wird angezeigt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 3 Brunnen mit Standardabweichung dar. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Erkennung von Stoffwechselveränderungen nach der Aktivierung der NK-Zelle durch IL-15.
Mitochondrialer Stresstest: OCR (A) und ECAR (B) Diagramme werden für 0,75 x 106 ruhende oder IL-15 aktivierte Zellen angezeigt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 3 Brunnen mit Standardabweichung dar. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 5 unabhängige Experimente. Basale und maximale Atmungsveränderungen für einzelne menschliche Spender sind in (C) dargestellt, während ATP-verknüpfte Atmung, Protonenleck, nicht-mitochondriale Atmung (NMR) in (D) und das OCR/ECAR-Verhältnis in (E) dargestellt sind. Glykolyse-Stresstest: ECAR (F) und OCR (G) Diagramme werden für 0,75 x 106 ruhende oder IL-15 aktivierte Zellen angezeigt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 3 Brunnen mit Standardabweichung dar. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 5 unabhängige Experimente. Basale und maximale extrazelluläre Versauerungsänderungen für einzelne menschliche Spender sind in (H) dargestellt. ns: nicht signifikant; * p . 0,05; ** p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p - 0.001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Beitrag des TCA und der Glykolyse an ECAR.
Die ersten Messungen von ECAR entsprechen weitgehend der Versauerung aufgrund des im TCA-Zyklus produziertenCO2. Nach Zugabe von Glukose zur Brennstoffglykolyse nimmt der Beitrag der TCA-abgeleiteten Versauerung zu ECAR ab. Die Injektion von Antimycin A und Rotenone blockiert die TCA, und die Glykolyse kompensiert den Anstieg der ATP-Nachfrage, indem sie auf ihr maximales Niveau (kompensatorische Glykolyse) ansteigt. Die Blockade der Glykolyse durch 2-DG verringert ECAR auf ein Minimum, was einer Versauerung entspricht, die nicht der Glykolyse oder Atemaktivität zugeschrieben wird, sowie einer Restglykolyse, die durch 2-DG nicht vollständig gehemmt wird (nach 2-DG-Versauerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Reagenz Arbeitskonzentration Klonen (für Antikörper) Endgültiges Färbevolumen
Maus Anti-Mensch CD3 BV711 50 ng/ml UCHT1 100 l
Maus Anti-Mensch CD56 PE 1/50 Verdünnung B159 100 l
Maus anti-human NkP46 PE 1/50 Verdünnung 9/E2 100 l
Viability Dye 1/1000 Verdünnung 500 l

Tabelle 1: Reagenzien und Antikörper, die für die Durchflusszytometrie verwendet werden.

Mitochondrialer Stresstest
Hafen Volumen Verbindung 10x Lager Endgültige Konzentration im Assay
Eine 20 l Oligomycin 10 m 1 M
B 22 l Dnp 1 mM 0,1 mM
C 25 l Antimycin A + Rotone je 10 M je 1 M
Glykolyse-Stresstest
Hafen Volumen Verbindung 10x Lager Endgültige Konzentration im Assay
Eine 20 l Glukose 100 mM 10 mM
B 22 l Antimycin A + Rotone je 10 M je 1 M
C 25 l 2-DG 500 mM 50 mM

Tabelle 2: Compound-Beladung.

Schritt Schleife Wiederholen (Zeiten)
Mix Warte Messen
Kalibrierung ––
Gleichgewicht ––
Basiswerte 3 Minuten 0 Minuten 3 Minuten 3
Endschleife ––
Injizieren von Port A ––
Messungen 3 Minuten 0 Minuten 3 Minuten 3
Endschleife ––
Injizieren Von Port B ––
Messungen 3 Minuten 0 Minuten 3 Minuten 3
Endschleife ––
Injizieren Von Port C ––
Messungen 3 Minuten 0 Minuten 3 Minuten 3
Endschleife ––
Endprogramm ––

Tabelle 3: Programmlayout.

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Discussion

In diesem Beitrag haben wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultivierung reiner und lebensfähiger primärer menschlicher NK-Zellen aus peripherem Blut erstellt. Wir haben auch die Bedingungen für die Messung der Metabolischen Aktivität dieser NK-Zellen optimiert, die durch Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Versauerungsrate mit Hilfe eines extrazellulären Flussanalysators beurteilt werden. Im Vergleich zu anderen respirometrischen Methoden ist der extrazelluläre Flussanalysator schnell, erfordert eine geringe Anzahl von Zellen und ermöglicht Screenings mit hohem Durchsatz. Jedoch, seine Reagenzien sind teuer, und Injektionen von Verbindungen sind auf nur vier begrenzt. Metabolische Remodellierung und Aktivierung der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung durch Zytokine in NK-Zellen ist wichtig für robuste NK-Zellreaktionen21, und die hier beschriebenen Techniken ermöglichen die Untersuchung des metabolischen Profils von NK-Zellen in Echtzeit. Dieses Protokoll könnte auf Zellen erweitert werden, die von anderen Zytokinen aktiviert werden, wie IL-2, IL-12 und IL-18, oder Antikörper, die an aktivierende Rezeptoren binden. Wir haben mehrere wichtige Schritte angesprochen, die oft übersehen werden, wie z. B. die Beschichtung der Zellen am optimalen Zusammenfluss oder die optimale Konzentration des Entkopplers, um den maximalen Sauerstoffverbrauch zu stimulieren. Dennoch empfehlen wir, die2 tatsächlichen O 2-Pegelkurven (Abbildung 3C) zu überprüfen, wenn den Zellen andere Als-IL-15-Werte gegeben werden, um sicherzustellen, dassO2 nicht in den Brunnen erschöpft ist. Wenn dies der Fall ist, sollte die Zellzahl verringert werden, bis ein linearerO2-Verbrauch beobachtet wird, um eine Unterschätzung der realen OCR zu verhindern.

Die Basale Atmung spiegelt den basalen Stoffwechselzustand der Zelle wider, der weitgehend durch die Aktivität der mitochondrialen ATP-Synthase8gesteuert wird und ein Hinweis auf den basalen ATP-Bedarf ist (für Proteinsynthese, Zytoskelettdynamik, ATPases wie na+/K+-ATPase, etc.). Typischerweise erhöht sich dieser Parameter in Gegenwart ausreichender Substrate bei metabolisch aktiven oder gestressten Zellen. Die Zugabe von Oligomycin, das die ATP-Synthase blockiert, zeigt ATP-verknüpfte Atmung und das Protonenleck, das über die Lipid-Bilayer oder Proteine der inneren mitochondrialen Membran auftreten kann, aber auch durch Proteine wie die Uncoupling Proteins (UCPs)9induzierbar sein kann, die an der Regulierung der adaptiven Thermogenese beteiligt sind und somit das mitochondriale Energiepotenzial in die Wärme umwandeln. Die maximale Atmung wird durch Faktoren wie die Verfügbarkeit von Substraten für die mitochondriale Atemkette und die Menge und Aktivität von Atemkomplexen bestimmt. Mitochondriale Atemkomplexe und ihre Aktivität können auch durch posttranslationale Modifikationen wie Acetylierung oder Phosphorylierung22,23verändert werden. Dieser Parameter kann auch die Gesundheit der Zellen und ihre Fähigkeit angeben, auf akute Beleidigungen zu reagieren. In Situationen der mitochondrialen Dysfunktion nimmt die maximale Atmung ab, und dies begrenzt die Fähigkeit der Zelle, auf Veränderungen der ATP-Nachfrage zu reagieren, und führt zum Zelltod24.

Es ist sehr wichtig zu beachten, dass, für jeden Zeitpunkt der mitochondrialen und Glykolyse-Stresstests ist ECAR die Summe der glykolyseabgeleiteten Versauerung (über die Erzeugung von Laktat + H+) und der respiratorischen Versauerung (über die Erzeugung vonCO2, das sich inH2O auflöst, um HCO3- und H+zu erzeugen), und vor allem kann die von der Atmung abgeleitete Versauerung einen wesentlichen Teil der gesamten ECAR in einigenZelltypenausmachen. Für interessierte Forscher gibt es veröffentlichte Protokolle zur Berechnung der tatsächlichen glykolytischen Raten. Zu diesem Zweck können die Sauerstoffverbrauchsraten während des glykolytischen Stresstests (Abbildung 4G) verwendet werden, um die Protonenproduktionsrate durch Atmung zu jedem Zeitpunkt zu berechnen, und dieser Wert kann von der Gesamten protonenproduktionsrate subtrahiert werden, die mit ECAR-Werten und der Pufferleistung des Mediums7,,25,26ermittelt wird.

Eine wichtige Änderung dieses Protokolls gegenüber der Empfehlung des Herstellers ist die zweite Injektion des Glykolyse-Stresstests. Antimycin A und Roton werden Oligomycin vorgezogen, aus mehreren Gründen, die bereits beschrieben wurden7: 1) einige Zellen zeigen eine hohe glykolytische Kapazität, die den basalen ATP-Bedarf der Zelle vollständig erfüllen kann, auch ohne oxidative Phosphorylierung; 2) Die Blockierung des ETC mit Antimycin A und Roton erhöht künstlich den ATP-Bedarf der Zelle, da es ATP-Hydrolyse durch die ATP-Synthase verursacht (die Mitochondrien werden zu einer ATP-Senke), die sich umkehrt, um Protonen zu pumpen, um das mitochondriale Membranpotenzial wiederherzustellen, das nach der Atemhemmung zusammenbricht; 3) Blockierung des ETC verhindert die Atmungssacidifizierung des Mediums (AtemCO2 erzeugt im TCA-Zyklus, der in HCO3- und H+umgewandelt wird), was die ECAR-Ergebnisse verwirren kann.2 So ist die beobachtete maximale ECAR mit Antimycin A und Roton nur auf Glykolyse zurückzuführen. Interessanterweise wurde berichtet, dass das eCAR, das mit Ateminhibitoren allein beobachtet wurde, noch submaximal7sein kann, und ein zusätzlicher Mechanismus zur Erhöhung der zellulären ATP-Nachfrage (und damit maximaler ECAR) wurde beschrieben: die Zugabe des Ionophormonensins, die den Import von Na+ in die Zelle27 erhöht und die Rate der ATP-Hydrolyse durch die Plasmamembran Na+/K+-ATPase, auf die Mischung aus Antimycin A und Roton7stimuliert.

Ein zweites wichtiges Konzept ist, dass wir die Subtraktion der nicht-glykolytischen Versauerung, die wahrscheinlich entspricht AtemCO2, die in HCO3umgewandelt wird- und H+, aus der gesamten Spur, um glykolytische Parameter zu berechnen, wie vom Hersteller empfohlen, da diese Menge in jeder Phase des Glycolysis-Stresstests erheblich ändert (es ist am höchsten im Basalzustand, verringert sich nach Zugabe von Glukose durch den Crabtree-Effekt20, und wird praktisch mit Antimycin A und Rotone abgeschafft) (Abbildung 5).

Zusammenfassend zeigt dieses Protokoll ein einfaches und effizientes Werkzeug, um die metabolische Aktivität menschlicher natürlicher Killerzellen mit einem extrazellulären Flussanalysator zu testen. Diese Methode kann verwendet werden, um den metabolischen Zustand in diesen Zellen zu behören, die bekannt ist, mit Zellaktivierung durch Zytokinstimulation oder unter bestimmten pathologischen Bedingungen zu ändern, einschließlich Fettleibigkeit, Krebs oder Virusinfektionen28.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) für die Unterstützung und Diskussion. Diese Studie wurde von den Intramural Research Programs der National Institutes of Health, national Cancer Institute und National Heart, Lung, and Blood Institute unterstützt. JT wird durch das Ramon y Cajal-Programm (Grant RYC2018-026050-I) von MICINN (Spanien) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 160 Natürliche Killerzellen Stoffwechsel extrazellulärer Fluss Glykolyse Mitochondrien Atmung Elektronentransportkette Durchflusszytometrie
Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels
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Traba, J., Waldmann, T. A., Anton,… More

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

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