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Immunology and Infection

मानव प्राकृतिक हत्यारा सेल मेटाबोलिज्म का विश्लेषण

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/61466
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

इस पेपर में, हम प्राथमिक मानव प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं में ग्लाइकोलिसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, जो परिधीय रक्त से अलग होता है, आराम से या आईएल15-प्रेरित सक्रियण का पालन करता है। वर्णित प्रोटोकॉल को अन्य साइटोकिन्स या घुलनशील उत्तेजनाओं द्वारा सक्रिय प्राथमिक मानव एनके कोशिकाओं तक आसानी से बढ़ाया जा सकता है।

Abstract

प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं मुख्य रूप से जन्मजात एंटी-ट्यूमर और एंटी-वायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में मध्यस्थता करती हैं और जीवित रहने, सेलुलर प्रसार, इंटरफेरॉन गामा (IFNγ) और/या साइटोटॉक्सिटी कार्यक्रमों जैसे साइटोकिन्स के उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए विभिन्न प्रकार की साइटोकिन्स और अन्य उत्तेजनाओं का जवाब देती हैं । साइटोकिन उत्तेजना द्वारा एनके सेल एक्टिवेशन को उनकी बायोएनर्जेटिक और बायोसिंथेटिक आवश्यकताओं का समर्थन करने के लिए मेटाबोलिक रास्तों की पर्याप्त पुनर्मॉडलिंग की आवश्यकता होती है। सबूत का एक बड़ा शरीर है जो बताता है कि बिगड़ा एनके सेल चयापचय मोटापे और कैंसर सहित कई पुराने रोगों से जुड़ा हुआ है, जो एनके सेल मेटाबॉलिज्म को निर्धारित करने के लिए एक विधि की उपलब्धता के नैदानिक महत्व पर प्रकाश डालता है। यहां हम एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक के उपयोग का वर्णन करते हैं, एक मंच जो मानव एनके कोशिकाओं के ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन की निगरानी के लिए एक उपकरण के रूप में ग्लाइकोलिसिस और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत के वास्तविक समय माप की अनुमति देता है। यहां वर्णित विधि आईएल-15 जैसे साइटोकिन्स के साथ एनके कोशिकाओं की उत्तेजना के बाद मेटाबोलिक परिवर्तनों की निगरानी के लिए भी अनुमति देती है, एक ऐसी प्रणाली जिसकी वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला में जांच की जा रही है।

Introduction

प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं सहज लिम्फोसाइट्स कि विरोधी ट्यूमर और विरोधी वायरल प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता कर रहे हैं । एनके कोशिकाओं में मानव परिधीय रक्त में सभी लिम्फोसाइट्स का 5-15% शामिल है, और तिल्ली, जिगर, बोन मैरो और लिम्फ नोड्स में भी पाया जा सकता है। एनके कोशिकाएं बहुरूपिक क्लोनोटिपिक रिसेप्टर्स को व्यक्त नहीं करती हैं, जैसे टी-सेल रिसेप्टर्स (टीसीआर) या बी-सेल रिसेप्टर्स (बीसीआर)। इसके विपरीत, उनके साइटोलिटिक कार्यों की सक्रियता रिसेप्टर्स की सगाई से प्रेरित होती है जो लक्ष्य कोशिका1,2की सतह पर अपरिवर्तनीय लिगामेंट्स को पहचानते हैं।

परिधीय रक्त से अलग मानव एनके कोशिकाओं को आराम मानव सीरम के साथ पूरक संस्कृति माध्यम में कई दिनों के लिए जीवित रह सकते हैं । आईएल-15 या आईएल-2 जैसे साइटोकिन्स द्वारा एनके कोशिकाओं की सक्रियता कोशिकाओं को प्रसार और उनकी हत्या की क्षमता में वृद्धि करने के लिए प्रेरित करती है, अन्य प्रभावों के बीच3,4,,5।, एनके सेल सक्रियण और उनकी मेटाबॉलिकगतिविधिमें परिवर्तन के बीच कई अध्ययनों से सीधा संबंध दिखाया गया है । ये मेटाबोलिक परिवर्तन ऊर्जा और बायोसिंथेसिस के मामले में कोशिकाओं की विशेष आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए किस्मत में हैं।

एरोबिक कोशिकाएं और जीव रासायनिक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से ऊर्जा प्राप्त करते हैं जिसमें कार्बोहाइड्रेट, वसा और प्रोटीन का कैटाबोलिज्म और ऑक्सीकरण शामिल होता है। ग्लाइकोलिस, ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड (टीसीए) चक्र और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन के संयोजन के माध्यम से, यूकेरियोटिक कोशिकाएं अपनी एटीपी मांग के बहुमत को पूरा करती हैं और कोशिका विकास और प्रसार के लिए आवश्यक मैक्रोमॉलिक्यूल्स के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में आवश्यक मध्यवर्ती प्राप्त करती हैं। ग्लाइटोलिसिस(चित्रा 1 ए)की प्रक्रिया कोशिका में ग्लूकोज के प्रवेश के साथ शुरू होती है। साइटोसोल में, ग्लूकोज फॉस्फोरिलेटेड होता है और पाइरुवेट (प्रति ग्लूकोज अणु एटीपी के 2 अणुओं के शुद्ध उत्पादन के साथ) में बदल जाता है, जिसे लैक्टेट में कम किया जा सकता है या माइटोकॉन्ड्रिया में ले जाया जा सकता है ताकि एसीटाइल-सीओए में तब्दील किया जा सके और टीसीए चक्र में प्रवेश किया जा सके। टीसीए चक्र एसीटाइल-सीओए के अधिक अणुओं के साथ ईंधन साइकिल चलाना जारी रखता है और सीओ2 का उत्पादन करता है (जो अंततः कोशिका के बाहर फैलाना होगा और, माध्यम में एच2ओ के साथ प्रतिक्रिया करके, कार्बोनिक एसिड उत्पन्न करेगा जो मध्यम के अम्लीकरण का कारण बनेगा) और NADH, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) में इलेक्ट्रॉनों को दान करने के आरोप में अणु। इलेक्ट्रॉन विभिन्न प्रोटीन परिसरों के माध्यम से यात्रा करते हैं और अंत में ऑक्सीजन द्वारा स्वीकार किए जाते हैं। ये कॉम्प्लेक्स (I, III और IV) माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स से एच+ को इंटरमेम्ब्रान स्पेस में भी पंप करते हैं। इलेक्ट्रोकेमिकल ढाल उत्पन्न के परिणामस्वरूप, एच+ जटिल वी (एटीपी-सिंथेस) के माध्यम से मैट्रिक्स में फिर से प्रवेश करेगा, जो एटीपी की पीढ़ी में संचित संभावित ऊर्जा का निवेश करेगा।

ग्लाइकोलिसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दोनों को अवरोधकों का उपयोग करके विभिन्न बिंदुओं पर अवरुद्ध किया जा सकता है। इन अवरोधकों का ज्ञान और उपयोग बाहुलर प्रवाह परख के विकास का आधार था। पीएच और ऑक्सीजन जैसे वास्तविक समय में दो सरल मापदंडों को मापकर, एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर 96-अच्छी प्लेट में ग्लाइकोन्ड्राइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की दर का अनुमान लगाता है। ग्लायलालिसिस स्ट्रेस टेस्ट ग्लूकोज के बिना बेसल माध्यम में किया जाता है (चित्रा 1B)7. एक्सट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन रेट (आईसीएआर) का पहला माप ग्लाइकोलिस-इंडिपेंडेंट एसिडिफिकेशन का संकेत है। इसे गैर-ग्लाइकोलिटिक एसिडिफिकेशन के रूप में जाना जाता है और टीसीए द्वारा उत्पादित सीओ2 के साथ सहसंबंधित है, जैसा कि पहले समझाया गया है, एच+ (टीसीए से जुड़े ईसीए) उत्पन्न करने के लिए माध्यम में एच2ओ के साथ जोड़ती है। पहला इंजेक्शन ग्लूकोज उपयोग को प्रेरित करने और ग्लाइटोलिसिस को बढ़ावा देने के लिए ग्लूकोज है। दूसरा इंजेक्शन दोनों रोटेनोन को जोड़ती है, एक जटिल मैं अवरोधक, और एंटीमाइसिन ए, एक जटिल III अवरोधक एक साथ, आदि को ब्लॉक करने के लिए कोशिकाओं को सेलुलर एटीपी स्तर को बनाए रखने के लिए ग्लाइकोलिसिस को सक्रिय करके माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन में इस नाटकीय कमी का जवाब है, और यह ग्लाइकोलिसिस की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है जो बेसल राज्य में सेल द्वारा उपयोग नहीं किया जाता है लेकिन एटीपी मांग (प्रतिपूरक ग्लाइसीलिसी) में वृद्धि के जवाब में संभावित रूप से भर्ती किया जा सकता है। तीसरा इंजेक्शन ग्लूकोज एनालॉग 2-डेऑक्सिग्लुकोज (डीजी) है, जो एंजाइम हेक्सोकिनेस के लिए सब्सट्रेट के रूप में ग्लूकोज के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। इस फॉस्फोरिलेशन, 2-डिऑक्सीग्लुकोस-6-फॉस्फेट के उत्पाद को पाइरुवेट में नहीं बदला जा सकता है, और इसलिए ग्लाइकोलिसिस अवरुद्ध है, जो आईसीएआर को अपने न्यूनतम तक कम करता है। इस बिंदु पर मापा गया ईआर में एक्सट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन के अन्य स्रोत शामिल हैं जिन्हें ग्लाइकोलिसिस या श्वसन गतिविधि के साथ-साथ किसी भी अवशिष्ट ग्लाइकोलिसिस को 2-डीजी (पोस्ट 2-डीजी-एसिडिफिकेशन) द्वारा पूरी तरह से बाधित नहीं किया जाता है।

माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट ग्लूकोज(चित्र 1सी) 8के माध्यम से कियाजाताहै । ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) का पहला माप माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन (बेसल श्वसन) की आधार रेखा के अनुरूप है। पहला इंजेक्शन ओलिगोमाइसिन है, जो एटीपी सिंथेस (जटिल वी) के माध्यम से प्रोटॉन की वापसी को रोकता है, एटीपी संश्लेषण को अवरुद्ध करता है और इस प्रकार माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को तेजी से हाइपरपोलेराइज करता है, जो श्वसन परिसरों के माध्यम से आगे प्रोटोन पंपिंग को रोकता है, और ओसीआर में कमी की ओर जाता है। बेसलाइन श्वसन और ओलिगोमाइसिन के अलावा द्वारा दिए गए मूल्य के बीच तुलना एटीपी से जुड़े श्वसन का प्रतिनिधित्व करती है। ऑक्सीजन की खपत की शेष ओलिगोमाइसिन-असंवेदनशील दर को प्रोटोन रिसाव कहा जाता है, जो आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली जैसे एडेनिन न्यूक्लियोटाइड ट्रांसलोसेस9में लिपिड बाइलेयर या प्रोटीन के माध्यम से प्रोटॉन के प्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है। दूसरा इंजेक्शन अनकूपलर 2,4-डिनिट्रोफेनोल (डीएनपी) है, जो एक आयनोफोर है जो माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में एच+ के बड़े पैमाने पर प्रवेश को प्रेरित करता है, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली का अपध्रीकरण होता है और माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी संश्लेषण में व्यवधान होता है। कोशिकाएं झिल्ली क्षमता (अधिकतम श्वसन क्षमता) को ठीक करने के व्यर्थ प्रयास में इलेक्ट्रॉन परिवहन और ऑक्सीजन की खपत की दर को अधिकतम स्तर तक बढ़ाकर प्रोटोन-मोटिव बल के अपव्यय का जवाब देती हैं। अधिकतम श्वसन क्षमता और बेसल श्वसन के बीच अंतर कोशिका की अतिरिक्त श्वसन क्षमता है, जो श्वसन की मात्रा का प्रतिनिधित्व करती है जिसका उपयोग सेल द्वारा बेसल राज्य में एटीपी उत्पन्न करने के लिए नहीं किया जाता है, लेकिन एटीपी मांग में वृद्धि या तनाव8की स्थितियों के जवाब में संभावित रूप से भर्ती किया जा सकता है। तीसरा इंजेक्शन रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए का कॉम्बिनेशन है। यह इंजेक्शन पूरी तरह से ईटीसी बंद हो जाता है और ओसीआर अपने निम्नतम स्तर तक कम हो जाता है, शेष ऑक्सीजन की खपत गैर-माइटोकॉन्ड्रियल (एनएडीएचएच-ऑक्सीदास आदि के कारण) होने के साथ।

मेटाबोलिक रास्तों में परिवर्तन किसी भी तरह एनके कोशिकाओं के कामकाज की भविष्यवाणी कर सकता है, क्योंकि यह सुझाव दिया गया है कि विट्रो में साइटोकिन्स के साथ एनके कोशिकाओं की निरंतर सक्रियता विभिन्न मेटाबोलिक रास्तों10, 11,11के अध्ययन से एनके सेल थकावट का कारण बन सकती है। एनके सेल मेटाबोलिक स्थिति और कार्य के बीच संबंध कैंसर इम्यूनोथेरेपी की दृष्टि से बहुत महत्वपूर्ण है। इस क्षेत्र में, आईएल-15 के जलसेक के साथ एनके कोशिकाओं की सक्रियता, अकेले या मोनोक्लोनल चिकित्सीय एंटीबॉडी के संयोजन,में12, 13,,14की हत्या को बेहतर बनाने के लिए परीक्षण किया गया है।14 इन उपचार रणनीतियों के जवाब में एनके कोशिकाओं की मेटाबॉलिक स्थिति का ज्ञान एनके सेल सक्रियण स्थिति और हत्या समारोह का एक मूल्यवान कारक प्रदान करेगा।

मोनोसाइट्स, टी और बी कोशिकाओं जैसे अन्य माइलॉयड और लिम्फोइड कोशिकाओं में मेटाबॉलिक रास्तों के अध्ययन को15 वर्णित किया गया है और अनुकूलित तरीके16प्रकाशित किए गए हैं। इस प्रोटोकॉल में हम एक विधि प्रदान करते हैं जो एनके आइसोलेशन प्रोटोकॉल दोनों को जोड़ती है जो एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके मेटाबोलिक गतिविधि को मापने के लिए शुद्ध और व्यवहार्य एनके कोशिकाओं की उच्च संख्या और एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करती है। यहां हम बताते हैं कि यह आराम और आईएल-15 सक्रिय मानव एनके कोशिकाओं में मेटाबोलिक परिवर्तनों के अध्ययन के लिए एक वैध तरीका है। बाहुलर फ्लक्स परख के लिए, सेल नंबर और दवा सांद्रता जैसे मापदंडों का परीक्षण और अनुकूलन किया गया है। अन्य श्वसनीय तरीकों की तुलना में, एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर पूरी तरह से स्वचालित है और वास्तविक समय में परीक्षण करने में सक्षम है, कोशिकाओं की बहुत कम मात्रा के साथ, एक साथ 92 नमूनों तक, और इस प्रकार अपेक्षाकृत त्वरित तरीके से17में उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (कई नमूनों और दोहराने के साथ) की अनुमति देता है।

एनके सेल मेटाबॉलिज्म का अध्ययन करके एनके सेल फंक्शन का आकलन करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं द्वारा इस विधि का उपयोग किया जा सकता है। इसे अन्य साइटोकिन्स, एंटीबॉडी या घुलनशील उत्तेजनाओं द्वारा सक्रिय कोशिकाओं पर भी लागू किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रयोगों चिकित्सा अनुसंधान के हेलसिंकी के नैतिक सिद्धांतों की घोषणा के अनुसार प्रदर्शन किया गया । दानदाताओं से परिधीय रक्त नमूने ९९-सीसी-०१६८ आईआरबी अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत ट्रांसफ्यूजन मेडिसिन के एनआईएच विभाग से प्राप्त किए गए थे, जिसमें रोगी ने सूचित सहमति दी थी ।

1. रीएजेंट तैयारी

  1. एनके कोशिकाओं के अलगाव के लिए अभिकर् पते
    नोट्स: एक सेल संस्कृति हुड में इन अभिकर् तार तैयार करें।
    1. एनके सेपरेशन बफर तैयार करें: 1 एमएम ईडीए और 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ पूरक पीबीएस (पीएच 7.4) जो पहले गर्मी-निष्क्रिय (30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर) किया गया है।
    2. एनके कल्चर मीडियम तैयार करें: सप्लीमेंट इस्कोव के मॉडिफाइड डल्बेको मीडिया (आईएमडीएम) 10% ह्यूमन सीरम (एचएस) के साथ। बाँझ फिल्टर और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। कोशिकाओं को जोड़ने से पहले मध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    3. 200 माइक्रोग्राम/एमएल पर पीबीएस में मानव आईएल-15 को फिर से र्घन करें।
  2. एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स परख के लिए रीएजेंट्स
    1. परख मीडिया तैयार करें: माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट मीडियम के लिए, बेस मीडियम में 1 एमएम सोडियम पायरुवेट, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 10 एमएम ग्लूकोज डालें; ग्लाइकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट मीडियम के लिए बेस मीडियम में 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन डालें।
      नोट: ग्लूकोज, पायरुवेट और ग्लूटामीन की सांद्रता एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर निर्माता द्वारा अनुशंसित प्रदान की जाती है। हालांकि, मीडिया संरचना शोधकर्ताओं द्वारा पूरी तरह से संस्कृति माध्यम की है कि मैच के लिए बदल सकता है, अगर वांछित ।
    2. दोनों मीडिया के पीएच को 0.1 एन नाओएच के साथ 7.4 तक समायोजित करें, एक बेंचटॉप पीएच मीटर का उपयोग करके, 0.2 माइक्रोन पोर आकार के माध्यम से बाँझ फिल्टर और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म मीडिया, पीएच की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो उपयोग से पहले 7.4 करने के लिए समायोजित।
      नोट: केवल परिवेश सीओ2 एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर के वातावरण में निहित है, बाइकार्बोनेट के बिना मीडिया का उपयोग महत्वपूर्ण है।
    3. रिएजेंट्स के लिए स्टॉक समाधान तैयार करें: ओलिगोमाइसिन (एटीपी सिंथेस अवरोधक), डीएमएसओ में 10 एमएमएम स्टॉक समाधान; 2,4-dinitrophenol (DNP, uncoupler), 1 एम स्टॉक समाधान DMSO में; एंटीमाइसिन ए (जटिल III अवरोधक), डीएमएसओ में 10 एमएम स्टॉक समाधान; रोटेनोन (जटिल मैं अवरोधक), DMSO में 10 mm स्टॉक समाधान। सभी अभिकर् ती के 30 μL aliquots बनाओ और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: इन दिशा निर्देशों के लिए व्यक्तिगत रूप से खरीदा और शोधकर्ता द्वारा तैयार अभिकर् ती के लिए करना है. यदि इसके बजाय एनालाइजर निर्माता से एजेंट खरीदे जाते हैं, तो अभिकर् थ तैयारी के लिए उनके दिशानिर्देशों का पालन करें।

2. एनके कोशिकाओं परिधीय रक्त से अलगाव

  1. मानव रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं (पीबीएमसी) तैयारी
    नोट: एक सेल संस्कृति हुड में इन चरणों का प्रदर्शन करते हैं। ब्लीच के साथ रक्त के संपर्क में सभी अवशेषों और सामग्री को दूषित करें और उन्हें जलाए जाने के लिए उपयुक्त कंटेनर में त्याग दें।
    1. एक 50 एमएल शंकु नली में लिम्फोसाइट सेपरेशन मीडियम (एलएसएम) के पिपेट 20 एमएल।
    2. ध्यान से, ट्यूब को 30 डिग्री कोण पर रखते हुए, एलएसएम पर रक्त का 20 एमएल, बहुत धीरे-धीरे और ट्यूब की दीवार को छूते हुए। एलएसएम के साथ रक्त के मिश्रण से बचें और दो तरल पदार्थों के बीच एक दृश्यमान और अच्छी तरह से परिभाषित इंटरफेज बनाएं।
      नोट: परिधीय रक्त या समृद्ध ल्यूकाफेरेसिस उत्पादों का उपयोग किया जा सकता है।
    3. कमरे के तापमान पर 25 मिनट, 1000 x ग्राम के लिए ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। ब्रेक का उपयोग न करें, क्योंकि यह ट्यूब (एलएसएम और रक्त) मिश्रण में दोनों चरण बना सकता है।
    4. ध्यान से अपकेंद्रित्र से ट्यूब बाहर ले और उन्हें एक रैक में जगह है। कोशिकाओं (मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं) की एक विशिष्ट परत की उपस्थिति की जांच करें जो एलएसएम (स्पष्ट) और प्लाज्मा (पीला) के बीच इंटरफेज पर बनेगी, जबकि ट्यूब के नीचे लाल रक्त कोशिकाएं गोली।
    5. धीरे-धीरे 10 एमएल प्लास्टिक पिपेट (लगभग 5-8 एमएल) के साथ मोनोन्यूक्लियर सेल परत को एस्पिरेट करें और इसे एक नए 50 एमएल शंकु नली में रखें। 2 अलग-अलग ट्यूबों के लिम्फोसाइट इंटरफेज को एक साथ पूल किया जा सकता है।
    6. 45 एमएल पीबीएस में रिसर्ण करके मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को 2x धोएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
      नोट: इस कदम के बाद, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमएमसी) का एक गोली प्राप्त की जाती है और शोधकर्ता एनके अलगाव कदम पर आगे बढ़ सकता है।
  2. पीबीएमसी से एनके अलगाव
    1. 2.1.6 से कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें एनके सेपरेशन बफर (1x 108 पीबीएमसी/एमएल) में फिर से खर्च करें।
    2. सेल रिसेपेंशन (109 पीबीएमसी) की 10 एमएल लें और उन्हें 50 एमएल ट्यूब में रखें।
    3. एनके सेल आइसोलेशन एंटीबॉडी मिक्स के 500 माइक्रोन (50 माइक्रोन/एमआरएल ऑफ बफर) और एंटी-सीडी 3 पॉजिटिव आइसोलेशन एंटीबॉडी मिक्स के 10 माइक्रोन (1 माइक्रोन/एमआरएल ऑफ बफर) को पीबीएमसीसी में जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. भंवर चुंबकीय मोती और एंटीबॉडी (100 μL मोती/ कभी-कभी सरगर्मी के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    5. एनके आइसोलेशन बफर (3.5 मिलीलीटर बफर/एमएल पीबीएमसी) के 35 एमएल जोड़ें, चुंबक पर 15 मिनट (2.2 x 107 पीबीएमसी/एमएल) के लिए मिश्रण और रखें। उस समय के बाद, मोती और कोशिकाओं को सकारात्मक रूप से चुना गया (सभी लेकिन एनके कोशिकाएं) ट्यूब की दीवारों का पालन करेंगी।
    6. ध्यान से किनारों या ट्यूब के नीचे को छूने के बिना एक 50 एमएल प्लास्टिक पिपेट के साथ सुपरनैट (एनके कोशिकाओं युक्त) को इकट्ठा करें।
    7. 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर सेल काउंटर और सेंट्रलाइज का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    8. आईएमडीएम में 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल पर अलग एनके कोशिकाओं को 10% एचएस युक्त और प्रयोग किए जाने तक उन्हें 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: यह एनके अलगाव प्रोटोकॉल 50 एमएल ट्यूब और एक बड़े चुंबक के उपयोग के लिए अनुकूलित सेल नंबर और रीएजेंट वॉल्यूम बताता है। इस प्रोटोकॉल को बढ़ाया जा सकता है (यदि अधिक पीबीएमसी प्राप्त किए जाते हैं) विभिन्न ट्यूबों में अलगाव चरणों को दोहराकर या ट्यूब में मात्रा को कम करके नीचे बढ़ाया जाता है। 14-45 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए 50 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब का उपयोग किया जाता है, वॉल्यूम 4-14 के लिए, 15 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब का उपयोग किया जाता है और वॉल्यूम 1-4 एमएल के लिए, 5 एमएल पॉलीस्टीरेन ट्यूब का उपयोग किया जाता है। चुंबक अलग है और प्रत्येक मामले में उपयुक्त ट्यूब फिट है। एंटीबॉडी मिक्स और मैग्नेटिक्स मोतियों की मात्रा को कोशिकाओं की संख्या और अंतिम मात्रा के अनुसार भी बढ़ाया जा सकता है।
  3. एनके सेल जनसंख्या प्रवाह साइटोमेट्री के लिए धुंधला
    1. चरण 2.2.8 से प्रति नमूना0.25 x 10 6 कोशिकाएं लें, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा माध्यम को हटा दें और पीबीएस के 500 माइक्रोल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
    2. निर्माता की सिफारिश के अनुसार व्यवहार्यता डाई जोड़ें (डीएमएसओ के 1 माइक्रोन-सेल पुनर्पौण के 1 मिलीएल में डाई का पुनर्गठन) और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. 5 एमएल पीबीएस में रिसर्ण करके 2x धोएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    4. प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर 30 मिनट के लिए 10% एचएस युक्त आईएमडीएम के 100 माइक्रोन में इसी एंटी-ह्यूमन एंटीबॉडी के साथ दाग (तालिका 1देखें)। सभी एंटीबॉडी को संयुक्त किया जा सकता है और एक ही धुंधला चरण में उपयोग किया जा सकता है।
    5. एनके सेल जनसंख्या की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें। सेल गेटिंग और विश्लेषण विधि का उपयोग करें जो पहले18,,19वर्णित है ।
  4. घुलनशील आईएल-15 के साथ एनके कोशिकाओं उत्तेजना
    1. 96 अच्छी तरह से प्लेट (गोल नीचे) के कुएं में 10% एचएस युक्त आईएमडीएम के 100 माइक्रोन में चरण 2.2.8 या 2.4.3 से 0.75 x 106 कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
    2. आईएमडीएम में तनु ह्यूमन आईएल-15 से 1 माइक्रोग्राम/एमएल जिसमें 10% एचएस होते हैं। 0.5 μg/mL की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए कोशिकाओं में पतला मानव आईएल-15 के 100 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: 0.5 μg/mL आईएल-15 की एक संतृप्त एकाग्रता है। आईएल-15 या अन्य साइटोकिन्स जैसे आईएल-2, आईएल-12 या आईएल-18 की कम सांद्रता का शोधकर्ताओं द्वारा परीक्षण किया जा सकता है यदि वांछित है।
    3. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें और बाहाकार प्रवाह परख करने से पहले 48 घंटे के लिए उत्तेजित करें। आईएमडीएम में एक ही एकाग्रता और मात्रा पर अउत्सुलित (नियंत्रण) कोशिकाओं को फिर से स्थापित करें जिसमें आईएल-15 के बिना 10% एचएस होते हैं, और उन्हें 48 घंटे के लिए एक ही इनक्यूबेटर में रखें।

3. सेंसर कारतूस का हाइड्रेशन

नोट: सेंसर कारतूस के 96 जांच सुझावों में ओ2 और एच+ के लिए व्यक्तिगत ठोस-राज्य फ्लोरोफोरस होते हैं जिन्हें ओ2 और पीएच परिवर्तनों का पता लगाने के लिए हाइड्रेटेड होने की आवश्यकता होती है।

  1. एनालाइजर चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म होने दें।
  2. सेंसर कारतूस पैकेज खोलें और यूटिलिटी प्लेट से सेंसर कारतूस को अलग करें। उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं में कैलिब्रेंट समाधान के 200 μL जोड़ें और प्लेट पर सेंसर कारतूस वापस डाल दिया, यह मान्य है कि सेंसर पूरी तरह से समाधान में डूबे हुए हैं। इष्टतम परिणामों के लिए कारतूस को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ2-फ्रीइनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें जो वाष्पीकरण को रोकने के लिए ठीक से आर्द्र है। हाइड्रेशन के दौरान सेंसर के नीचे बुलबुला गठन को रोकें।
    नोट: न्यूनतम कारतूस जलयोजन समय एक सीओ 2 -मुक्त इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर4घंटे है। वैकल्पिक रूप से, सीओ 2-फ्री इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पानी के200माइक्रोन के साथ सेंसर कारतूस का रात भर हाइड्रेशन, इसके बाद संवेदक कारतूस की एक इनक्यूबेशन के साथ 200 माइक्रोन पूर्व-गर्म कैलिब्रेंट समाधान 45 - 60 मिनट रन की शुरुआत से पहले, उपयोग किया जा सकता है।

4. एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स परख

  1. चिपकने वाली-लेपित प्लेटों की तैयारी
    नोट: चूंकि मेटाबोलिक मापदंडों का माप 96-अच्छी तरह से परख प्लेट के तल पर गठित माइक्रोचैम्बर में होता है, इसलिए निलंबन कोशिकाओं को पहले कुएं के नीचे का पालन किया जाना चाहिए। मसल माटिलस एडुलिस से निकाली गई एक कोशिका चिपकने वाला कार्यरत है। कोशिका चिपकने वाला निर्माता 1 से 5 माइक्रोग्राम/सेमी2की कोटिंग एकाग्रता की सिफारिश करता है । एनालाइजर सेल कल्चर माइक्रोप्लेट के कुएं की सतह लगभग 0.110 सेमी2होती है . इस प्रकार, 5 μg/सेमी2 एकाग्रता के लिए, चिपकने वाले के लगभग 0.55 माइक्रोन की आवश्यकता होती है। चिपकने वाले समाधान के 25 माइक्रोल का उपयोग प्रत्येक अच्छी तरह से कोट करने के लिए किया जाएगा, एनालाइजर सेल कल्चर माइक्रोप्लेट के लिए इष्टतम चिपकने वाला समाधान एकाग्रता लगभग 22.4 माइक्रोग्राम/एमएल (22.4 माइक्रोग्राम/एमएल एक्स 0.025 एमएल = 0.56 μ μ g) के आसपास है।
    1. 0.1 मीटर सोडियम बाइकार्बोनेट, पीएच 8.0 में सेल चिपकने वाला समाधान (22.4 μg/l) का 2.5 एमएल तैयार करें। बाइकार्बोनेट सेल अनुयायी प्रदर्शन के लिए इष्टतम पीएच प्रदान करता है, जो निर्माता के अनुसार, 6.5 और 8.0 के बीच है।
    2. परख प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए सेल चिपकने वाले समाधान के पिपेट 25 माइक्रोन और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। उसके बाद, समाधान निकालें और 2x को बाँझ पानी के 200 माइक्रोन से धोएं/ एक सेल कल्चर हुड के अंदर 15 मिनट के लिए प्लेट को खुला रखकर कुओं को सूखने दें।
      नोट: लेपित प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. चिपकने वाली प्लेटों में सेल सीडिंग चिपकने वाला
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर चरण 2.4.3 से सेंट्रलाइज कोशिकाएं। गर्म माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट मीडियम (यदि माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट किया जा रहा है) या ग्लाइकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट मीडियम (यदि ग्लाइकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट किया जा रहा है) में सुपरनेटेंट और वॉश सेल्स को हटा दें। गोली कोशिकाओं को फिर से और एक ही माध्यम में पसंदीदा सेल एकाग्रता के लिए resuspend (पुनः पेंशन की मात्रा चुना सेल एकाग्रता पर निर्भर करेगा; क्योंकि प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के १८० μL शामिल होंगे, तैयार करें 0.26 x 106,0.52 x10 6,1.04 x 106,2.08 x 106,4.17 x 106 और 8.33 x10 6 कोशिकाएं/ 0.047 x 106,0.094 x 106,0.187 x 106,0.375 x 106,0.75 x 106 और 1. 5 x 106 कोशिकाएं क्रमशः)।
    2. प्रत्येक कुएं के किनारे के साथ प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन की प्लेट 180 माइक्रोन। एक मल्टीचैनल पिपेट की सिफारिश की जाती है। पृष्ठभूमि सुधार के लिए नियंत्रण कुओं के रूप में विश्लेषक संस्कृति प्लेट के कुओं A1, A12, H12, और H12 का उपयोग करें । इन कुओं (कोई कोशिकाओं) में परख माध्यम के 180 μL जोड़ें। यदि वांछित है और यदि प्लेट में पर्याप्त जगह है तो अतिरिक्त नियंत्रण कुओं का उपयोग किया जा सकता है।
      नोट: सीरम की उपस्थिति खराब सेल लगाव का कारण बन सकती है।
    3. सीओ2-फ्री इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। इस बीच में 10x यौगिकों तैयार (नीचे चरण 4.3 देखें)।
    4. सेंट्रलाइज सेटिंग्स को जीरो ब्रेकिंग में बदलें। 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें। माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए जांच है कि वे अच्छी तरह से नीचे एक मोनोलेयर फार्म । प्लेटों को25मिनट के लिए सीओ 2-फ्री इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, चढ़ाना के बाद कुल समय लगभग 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए।
  3. सेंसर कारतूस में लोड करने के लिए 10x काम समाधान की तैयारी
    नोट: सेंसर कारतूस के ९६ जांच सुझावों में से प्रत्येक 4 बंदरगाहों (ए, बी, सी और डी) है कि व्यक्तिगत कुओं में क्रमिक रूप से यौगिकों सुई करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बंदरगाहों ।
    1. माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस परख माध्यम (स्टेप 1.2.3 से स्टॉक समाधान का उपयोग करें) में 10 माइक्रोन ओलिगोमाइसिन, 1 mM DNP, और 10 माइक्रोन रोटेनोन और 10 माइक्रोन एंटीमाइसिन ए का मिश्रण तैयार करें। इंजेक्शन के बाद कुएं में अंतिम सांद्रता 1 μM ओलिगोमाइसिन, 0.1 mM DNP और 1 μM एंटीमाइसिन ए/
    2. ग्लाइकोलिस तनाव परीक्षण करने के लिए, ग्लाइकोलिस तनाव परख माध्यम में 10 माइक्रोन रोटेनोन और 10 माइक्रोन एंटीमाइसिन ए के मिश्रण का 2.5 मिलियन एलएल तैयार करें (चरण 1.2.3 से स्टॉक समाधान का उपयोग करें)। ग्लाइकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट मीडियम में ग्लूकोज को घोलें 100 एमएम सॉल्यूशन के लिए और 500 एमएम सॉल्यूशन के लिए ग्लाइकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट मीडियम में 2-डिऑक्सी-ग्लूकोज (2-डीजी) । इंजेक्शन के बाद कुएं में अंतिम सांद्रता 10 एमएम ग्लूकोज, 1 माइक्रोन एंटीमाइसिन ए/रोटेनोन और ५० एमएम 2-डीजी होगी ।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म समाधान, पीएच की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो 7.4 करने के लिए समायोजित। लोड यौगिकों चरण 4.3.1 में तैयार किया गया है। (माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट के लिए) या 4.3.2 (ग्लाइकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट के लिए) पोर्ट्स ए, बी और सी में हाइड्रेटेड सेंसर कारतूस (स्टेप 3.2 से) का उपयोग करके मल्टीचैनल माइक्रोपिपेटर और पोर्ट-लोडिंग गाइड का उपयोग करके कारतूस के साथ प्रदान किया गया, जैसा कि तालिका 2में दिखाया गया है।
      नोट: परख के दौरान सभी कुओं में उचित इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए, बंदरगाहों की प्रत्येक श्रृंखला है कि उपयोग किया जाता है (जैसे, सभी बंदरगाहों ए) पूरे सेंसर कारतूस भर में एक ही इंजेक्शन की मात्रा शामिल होना चाहिए । यह पृष्ठभूमि सुधार कुओं पर लागू होता है और यहां तक कि उन कुओं के लिए प्रयोग में इस्तेमाल नहीं किया ।
    4. कार्यक्रम की स्थापना करते समय सीओ2-फ्री इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर लोडेड सेंसर कारतूस को इनक्यूबेट करें।
  4. एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स परख प्रोटोकॉल स्थापित करना
    1. एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर सॉफ्टवेयर खोलें, और समूह परिभाषाओं और प्लेट मैप टैब का उपयोग करके उन कुओं के समूहों को इंगित करें जिनमें समान स्थितियां हैं (उदाहरण के लिए, समान संख्या में कोशिकाओं के साथ कुओं, या या तो आराम कोशिकाओं या आईएल-15-उत्तेजित कोशिकाओं के साथ कुओं)। इसके अलावा, पृष्ठभूमि सुधार कुओं (डिफ़ॉल्ट रूप से A1, A12, H1, और H12 सेट किया जाएगा संकेत मिलता है, लेकिन अतिरिक्त कुओं का इस्तेमाल किया जा सकता है) और खाली कुओं ।
    2. प्रोटोकॉल टैब का उपयोग कर सॉफ्टवेयर में तालिका 3 में वर्णित कार्यक्रम की स्थापना करें।
    3. रन परख टैब का उपयोग करके कार्यक्रम शुरू करें। सेंसर कारतूस (हाइड्रेटेड और 10x यौगिकों के साथ भरी हुई) और ट्रे पर उपयोगिता प्लेट रखें। अंशांकन चरण (15 - 20 मिनट) के बाद, जब प्रेरित किया जाता है, तो संलग्न कोशिकाओं के साथ परख प्लेट (ढक्कन के बिना) के लिए अंशांकन प्लेट को बदलें। इसके बाद, रन पूरी तरह से स्वचालित है (मशीन सभी माप और इंजेक्शन प्रदर्शन करेगी)।
      नोट: एक ही प्लेट में माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट और ग्लाइकोलिटिक स्ट्रेस टेस्ट करना संभव है, जब तक कि विशिष्ट यौगिकों को उचित बंदरगाहों (ओलिगोमाइसिन, डीएनपी और एंटीमाइसिन/रोटेनोन इन पोर्ट्स ए) में लोड किया जाता है, बी और सी क्रमशः कुओं में जहां एक माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट किया जाता है; ग्लूकोज, एंटीमाइसिन/रोटेनोन और 2-डीजी बंदरगाहों ए, बी और सी में क्रमशः कुओं में जहां ग्लाइकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट किया जाता है), प्रत्येक परीक्षण के लिए बंदरगाहों और कुओं की प्रत्येक श्रृंखला में इंजेक्शन के लिए समान मात्रा का उपयोग किया जाता है सॉफ्टवेयर के समूह परिभाषाओं और प्लेट मैप टैब का उपयोग करके ठीक से पहचाना जाता है ।
    4. रन के पूरा होने के बाद, डेटा को पुनः प्राप्त करें और सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें।

5. सेल संख्या निर्धारण

नोट: परिणाम सेल संख्या में संभावित अंतर के लिए खाते में सामान्यीकृत किया जा सकता है । नीचे वर्णित दो प्रमुख दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है।

  1. डीएनए सामग्री निर्धारण
    1. प्रत्येक कुएं से एक पिपेट के साथ शेष परख माध्यम निकालें। जब मध्यम एस्पिरेशन करते हैं, तो ध्यान रखें कि कोशिकाओं को परेशान न करें। विश्लेषण तक प्लेट को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: ठंड कदम कुशल सेल लाइसिस और डीएनए सामग्री निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है ।
    2. आसुत पानी (200 μL/well) में सेल प्रसार परख सेल-लाइसिस बफर (20x) का 1x समाधान तैयार करें।
    3. सेल प्रसार परख डाई स्टॉक समाधान (400x) को 1x सेल-लाइसिस बफर में जोड़ें। 50 से 50.000 कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, 1x सेल प्रसार परख डाई का उपयोग करें। उच्च सेल संख्या के लिए, 1x से अधिक अंतिम एकाग्रता पर सेल प्रसार परख डाई का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इस मामले में, 5x अंतिम एकाग्रता पर सेल प्रसार परख डाई का उपयोग करें (सेल प्रसार परख स्टॉक समाधान 80-गुना 1x सेल-लाइसिस बफर में पतला करें)।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से सेल प्रसार परख रिएजेंट के 200 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2-5 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें। प्रकाश से रक्षा करें।
    5. उत्तेजन पर नमूनों की फ्लोरेसेंस को मापें: 480 एनएम; उत्सर्जन: निर्माता की सिफारिशों के अनुसार फ्लोरेसेंस माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 520 एनएम।
  2. प्रोटीन सामग्री निर्धारण
    1. ध्यान से, कोशिकाओं को छूने के बिना प्रत्येक अच्छी तरह से परख माध्यम को पूरी तरह से एस्पिरेट करें और कम से कम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियसपर कोशिकाओं को फ्रीज करें। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को लंबे समय तक (1 सप्ताह तक) के लिए जमे हुए रखा जा सकता है जब तक विश्लेषण किया जाता है।
    2. प्रत्येक कुएं में 1x प्रोटीज अवरोधक (100x स्टॉक समाधान से) के साथ 1x प्रोटीज अवरोधकों (100x स्टॉक समाधान से) के साथ 50 माइक्रोन रेडियोइम्यूनोप्रिपिटेशन परख (रिपा) लाइसिस माध्यम जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक शेखर पर थाली रखें, और फिर एक पूर्ण सेल लाइसिस के लिए 30 मिनट के लिए बर्फ पर थाली इनक्यूबेट ।
    3. कमरे के तापमान पर 200 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए प्लेट को सेंट्रलाइज करें। यह कदम प्रोटीन माप के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए सेलुलर मलबे गोली होगा ।
    4. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार बिसिनकोनिक एसिड (बीसीए) परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता को मापें।

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Representative Results

परिधीय रक्त से एनके कोशिकाओं का अलगाव एक शुद्ध और व्यवहार्य आबादी प्रदान करता है

बाह्य प्रवाह परख अच्छी तरह से एच+ और ओ 2 एकाग्रता के माप पर आधारित है और कोशिकाओं या उनकी व्यवहार्यता की विभिन्नआबादी के बीच भेद नहीं करेगा। इस कारण से, ब्याज की कोशिका की एक अत्यधिक शुद्ध और व्यवहार्य आबादी प्राप्त करना इन प्रयोगों में सफल होने के लिए महत्वपूर्ण कदम था।

परिधीय रक्त से एनके कोशिकाओं का अलगाव धारा 2 में कहा गया था। प्राप्त एनके कोशिकाओं की शुद्धता और व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए, पीएमबीसी और अलग एनके सेल आबादी से छोटे एलिकोट्स को फ्लो साइटोमेट्री(चित्रा 2 ए)द्वारा दाग और विश्लेषण किया गया था। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को आगे (एफएससी-ए) बनाम साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) दिखाने वाले प्लॉट में गेट किया गया था । इस आबादी के भीतर, एफएससी-ए बनाम फॉरवर्ड स्कैटर हाइट (एफएससी-एच) दिखाने वाले भूखंड में विकर्ण के साथ एकल कोशिकाओं को गेट किया गया था। एकल आबादी के भीतर, व्यवहार्यता का आकलन किया गया था, और दोनों में ९८% से अधिक पाया गया, पीएमबीसी और एनके सेल आबादी । एनके सेल आबादी अलग की शुद्धता CD3 के खिलाफ डबल धुंधला द्वारा स्थापित किया गया था (टी कोशिकाओं में मौजूद, PBMCS के बीच प्रमुख आबादी) और CD56 या NKp46(चित्रा 2B)। एनके कोशिकाओं को सीडी 3 के लिए जनसंख्या नकारात्मक और CD56 या NKp46 के लिए सकारात्मक के रूप में परिभाषित किया गया है। इन मानदंडों के अनुसार, एनके कोशिकाओं की शुद्धता लगभग ८८% थी, जो पीबीएमसी की आबादी में मौजूद लोगों की तुलना में एनके कोशिकाओं पर 18 गुना संवर्धन का प्रतिनिधित्व करती है ।

ओसीआर और आईसीएआर मान सेल नंबर पर निर्भर हैं

माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण के लिए, कोशिकाओं को तीन अलग-अलग यौगिकों के अलावा मेटाबोलिक रूप से बेफिक्र किया गया था: ओलिगोमाइसिन, डीएनपी और एंटीमाइसिन ए + रोटेनोन। हर सेल प्रकार के लिए, प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या को एक बाह्य कोशिका प्रवाह परख प्रयोग के लिए सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया गया था। चित्रा 3 ए कई मानव एनके सेल नंबर (0.75 x 10 6, 0.375 x 106,0.187 x 106,0.094 x 106और 0.047 x 106) का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के प्रतिनिधि भूखंडों को दिखाता है।6 सभी माप-माप में किए गए। सेल नंबर कुएं में डीएनए या प्रोटीन की मात्रा(चित्रा 3B)के साथ रैकरली सहसंबंधित हैं। जैसा कि अपेक्षित था, उच्च सेल संख्याओं ने उच्च ओसीआर मूल्यों को प्रदर्शित किया, जबकि 0.187 x 106 कोशिकाओं से कम ने मजबूत परिणाम प्रदान नहीं किए। दूसरी ओर, उच्च सेल संख्या (1.5 x 106)इष्टतम नहीं थे, डीएनपी के अतिरिक्त होने पर, प्रत्येक चक्र(चित्र 3 सी)में कुएं में ऑक्सीजन एकाग्रता पूरी तरह से समाप्त हो गई थी, जो ओसीआर की सटीक गणना को पहले से ही समाप्त कर देती थी। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनकूपलर की एकाग्रता को सावधानीपूर्वक बढ़ाया जाना चाहिए, क्योंकि उपमैक्सेमल ओसीआर में पर्याप्त डीएनपी परिणाम नहीं जोड़ना, जबकि बहुत अधिक जोड़ने से अधिकतम ओसीआर भी बाधित हो सकता है। मानव एनके कोशिकाओं में, 100 माइक्रोन डीएनपी इष्टतम खुराक(चित्र 3 डी) पायागया। कार्बनिल सायनाइड-4-(ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फिनाइल हाइड्राजोन (एफसीसीपी) या कार्बोनिल सायनाइड एम-क्लोरोफेनिल हाइड्राजीन (सीसीसीपी) जैसे अन्य अनकपलर्स का उपयोग डीएनपी के बजाय किया जा सकता है लेकिन प्रत्येक सेल प्रकार के लिए भी टिटैरेट करने की आवश्यकता होगी।

ग्लाइकोलिस तनाव परीक्षण के लिए, ECAR के एक आधारभूत माप के बाद, ग्लूकोज से वंचित कोशिकाओं को निम्नलिखित यौगिकों से बेफिक्र किया गया: ग्लूकोज, एंटीमाइसिन ए + रोटेनोन और 2-डीजी। चित्रा 3E कई एनके कोशिकाओं संख्या (0.75 x 106,0.375 x 106,0.187 x 106,0.094 x 10 6 और 0.047 x 106) का उपयोग करके ईएआर के प्रतिनिधि भूखंडों को दिखाता है।6 सभी माप-माप में किए गए। ग्लाइकोलिसिस तनाव परख उच्चतम चढ़ाना घनत्व में सबसे सफल रहा था, जबकि कम से कम 0.187 x 10 6 कोशिकाओं को अच्छीतरह से मजबूत परिणाम प्रदान नहीं किया।

आईएल-15 उपचार ओसीआर और ईएआर बेसल और अधिकतम मूल्यों को बढ़ाता है

0.75 x 10 6 कोशिकाओं के इष्टतम सीडिंग घनत्व प्रति अच्छीतरह से बाद के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था। एनके कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए साइटोकिन आईएल-15 की संतृप्त सांद्रता की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सुसंस्कृत किया गया था, जिसके बाद उनकी व्यवहार्यता क्रमशः 93.7 ± 4.8% और 85.7 ± 12.0% पाई गई थी। चित्रा 4ए, बी 0.75 x 106 एनके कोशिकाओं के साथ एक विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण प्रयोग को दिखाता है। इस परीक्षण में, ओलिगोमाइसिन ऑक्सीजन की खपत(चित्रा 4A)में नाटकीय कमी की ओर जाता है और ईआरए में वृद्धि करता है जो सेलुलर एटीपी स्तर(चित्रा 4B)को बनाए रखने की कोशिश करने के लिए ग्लाइकोलिसिस में स्विच का प्रतिनिधित्व करता है। आईएल-15 द्वारा एनके सेल के सक्रियण के कारण माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत और एक्सट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन दोनों में वृद्धि हुई। यह परिणाम तब सुसंगत था जब कई मानव विषयों की तुलना(चित्रा 4C) कीगई थी। बेसल, मैक्सिमल और एटीपी से जुड़े श्वसन, लेकिन प्रोटोन रिसाव या गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन नहीं, आईएल-15(चित्रा 4सी, डी)के साथ वृद्धि हुई। इसके अलावा, ओसीआर/ईएआर दर में कमी आई, जो आईएल-15 उत्तेजना(चित्रा 4E)के बाद ग्लाइकोलिटिक मेटाबोलिज्म में बदलाव की प्रवृत्ति का संकेत है ।

चित्रा 4एफ, जी 0.75 x 106 एनके कोशिकाओं के साथ एक विशिष्ट ग्लाइकोलिसिस तनाव परीक्षण प्रयोग दिखाता है। ग्लूकोज के अलावा ग्लाइकोलिस सक्रियण के कारण ईएआर में भारी वृद्धि हुई, जबकि बाद में एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन के अलावा प्रतिपूरक ग्लाइकोलिस दिया गया, और 2-डीजी ने मार्ग का अवरोध और न्यूनतम(चित्रा 4F)में कमी का कारण बना। समानांतर में, ग्लूकोज लगातार ऑक्सीजन की खपत में थोड़ी कमी का कारण बना, संभवतः क्रैबट्री प्रभाव20द्वारा, जबकि एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन ने श्वसन को पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया और 2-डीजी कोई और प्रभाव प्रदान नहीं करता है(चित्रा 4G)। आईएल-15 के साथ एक्सट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत दोनों की सक्रियता इस परीक्षण में भी देखी जा सकती है, और फिर यह कई दानदाताओं(चित्रा 4H)से कोशिकाओं का उपयोग करते समय सुसंगत है।

Figure 1
चित्रा 1: एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स परख की योजनाबद्ध।
(ए)ग्लाइकोलिसिस का स्कीमेटिक, ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड साइकिल (टीसीए) और इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी) । लाल रंग में विभिन्न चरणों के अवरोधक लिखे जाते हैं। ईटीसी में इलेक्ट्रॉन प्रवाह को दाता के रूप में एनएचएच के साथ हरे रंग में और अंतिम स्वीकारकर्ता के रूप में ओ 2 का प्रतिनिधित्व कियाजाता है। (ख)ग्लाइकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट योजनाबद्ध प्रोफाइल जो एक्सट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन रेट (आईसीएआर) बनाम समय का प्रतिनिधित्व करता है । (ग)माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट योजनाबद्ध प्रोफाइल जो ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) बनाम समय का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से शुद्ध ।
(A)गेटिंग रणनीति का पालन एनके कोशिकाओं (दाएं कॉलम) की शुद्धता और व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया गया था बनाम कुल पीबीएमसीसी (बाएं कॉलम) । मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (शीर्ष पैनलों) के गेट से, एकल कोशिकाओं का चयन (मध्य पैनल) किया गया था और व्यवहार्यता (नीचे पैनल) मापी गई थी। (ख)सीडी 3 और सीडी 56 या NKp46 के लिए लाइव कोशिकाओं को दाग दिया गया था। पैनलों में संख्या चयनित क्षेत्रों में कोशिकाओं के प्रतिशत का संकेत देती है। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: सक्रिय मानव एनके कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लूकोज तनाव परीक्षणों का अनुकूलन।
(A)माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट: प्रत्येक चढ़ाना घनत्व के लिए ओसीआर (0.75 x10 6,0.375 x10 6,0.187 x10 6,0.094 x 106 और 0.047 x 106)दिखाया गया है। प्रत्येक डेटा बिंदु मानक विचलन के साथ 3 कुओं के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। परिणाम 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। (ख)डीएनए (ऊपरी पैनल) और प्रोटीन (निचले पैनल) का स्तर विभिन्न चढ़ाना घनत्व पर कुएं में । परिणाम कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। प्रत्येक डेटा बिंदु मानक विचलन के साथ 3 कुओं के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। परिणाम 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। (ग)कोई कोशिकाओं (काला निशान), 0.75 x 10 6 कोशिकाओं (नीले निशान) या1.5 x 10 6 कोशिकाओं (हरी ट्रेस) युक्त कुओं मेंकच्चे ऑक्सीजन स्तर के निशान। डीएनपी के अलावा हरे रंग के निशान में, ऑक्सीजन पूरी तरह से हर चक्र में समाप्त हो जाती है। (घ)075 x 10 6 कोशिकाओं की अतिरिक्तश्वसन क्षमता का परीक्षण कई डीएनपी एकाग्रता की उपस्थिति में किया गया था। (ई)ग्लाइकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट: प्रत्येक चढ़ाना घनत्व के लिए ईआरआर (0.75 x 106,0.375 x 106,0.187 x10 6,0.094 x 106 और 0.047 x 106)दिखाया गया है। प्रत्येक डेटा बिंदु मानक विचलन के साथ 3 कुओं के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। परिणाम 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आईएल-15 द्वारा एनके सेल एक्टिवेशन के बाद मेटाबॉलिक परिवर्तनों का पता लगाना।
माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट: ओसीआर(ए)और ईएआर(बी)भूखंड 0.75 x 106 आराम या आईएल-15 सक्रिय कोशिकाओं के लिए दिखाए जाते हैं। प्रत्येक डेटा बिंदु मानक विचलन के साथ 3 कुओं के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। परिणाम 5 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। व्यक्तिगत मानव दाता के लिए बेसल और मैक्सिमल श्वसन परिवर्तन(सी)में दिखाए जाते हैं, जबकि एटीपी से जुड़े श्वसन, प्रोटोन रिसाव, गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन (एनएमआर)(डी)में दिखाए जाते हैं और ओसीआर/ईएआर अनुपात(ई)में दिखाया गया है । ग्लाइकोलिस स्ट्रेस टेस्ट: ईएआर(एफ)और ओसीआर(जी)भूखंड 0.75 x 106 आराम या आईएल-15 सक्रिय कोशिकाओं के लिए दिखाए जाते हैं। प्रत्येक डेटा बिंदु मानक विचलन के साथ 3 कुओं के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। परिणाम 5 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। व्यक्तिगत मानव दाता के लिए बेसल और मैक्सिमल एक्स्ट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन परिवर्तन(एच)में दिखाए गए हैं। एनएस: महत्वपूर्ण नहीं; * पी ˂ 0.05; ** पी ˂ 0.01; पी ˂ 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: ईसीए पर टीसीए और ग्लाइकोलिस का योगदान।
ईसीए का पहला माप टीसीए चक्र में उत्पादित सीओ2 के कारण एसिडिफिकेशन के लिए काफी हद तक मेल खाता है। ग्लाइकोलिस ईंधन के लिए ग्लूकोज के अलावा के बाद ईसीए में टीसीए-व्युत्पन्न एसिडिफिकेशन का योगदान कम हो जाता है। एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन का इंजेक्शन टीसीए को ब्लॉक करता है, और ग्लाइसोलिसिस अपने अधिकतम स्तर (प्रतिपूरक ग्लाइकोलिस) में वृद्धि करके एटीपी मांग में वृद्धि की भरपाई करता है। ग्लाइकोलिसिस की 2-डीजी द्वारा नाकाबंदी ईआरआर को न्यूनतम स्तर तक कम करती है, जो एसिडिफिकेशन के अनुरूप होती है जिसे ग्लाइकोलिसिस या श्वसन गतिविधि के साथ-साथ किसी भी अवशिष्ट ग्लाइकोलिसिस को 2-डीजी (पोस्ट 2-डीजी-एसिडिफिकेशन) द्वारा पूरी तरह से बाधित नहीं किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) काम एकाग्रता क्लोन (एंटीबॉडी के लिए) अंतिम धुंधला मात्रा
माउस विरोधी मानव सीडी 3 BV711 50 एनजी/एमएल यूएचटीटी1 100 माइक्रोन
माउस विरोधी मानव सीडी 56 पीई 1/50 कमजोर पड़ने B159 100 माइक्रोन
माउस विरोधी मानव NkP46 पीई 1/50 कमजोर पड़ने 9/E2 100 माइक्रोन
व्यवहार्यता डाई 1/1000 कमजोर पड़ने 500 माइक्रोन

तालिका 1: प्रवाह साइटोमेट्री के लिए उपयोग किए जाने वाले रीएजेंट और एंटीबॉडी।

माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट
बंदरगाह आयतन यौगिक 10x स्टॉक परख में अंतिम एकाग्रता
एक 20 माइक्रोन ओलिगोमाइसिन 10 माइक्रोन 1 माइक्रोन
बी 22 माइक्रोन डीएनपी 1 mm 0.1 mm
सी 25 माइक्रोन एंटीमाइसिन ए + रोटेनोन 10 माइक्रोन प्रत्येक 1 माइक्रोन प्रत्येक
ग्लाईकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट
बंदरगाह आयतन यौगिक 10x स्टॉक परख में अंतिम एकाग्रता
एक 20 माइक्रोन ग्लूकोज 100 एमएमएम 10 mm
बी 22 माइक्रोन एंटीमाइसिन ए + रोटेनोन 10 माइक्रोन प्रत्येक 1 माइक्रोन प्रत्येक
सी 25 माइक्रोन 2-डीजी 500 एमएमएम 50mm

तालिका 2: कंपाउंड लोडिंग।

चरण लूप दोहराएं (समय)
मिश्रण ज़रा रुको माप
अंशांकन ––
संतुलन ––
बेसलाइन रीडिंग 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट 3
अंत पाश ––
पोर्ट ए इंजेक्ट करें ––
माप 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट 3
अंत पाश ––
पोर्ट बी इंजेक्ट करें ––
माप 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट 3
अंत पाश ––
पोर्ट सी इंजेक्ट करें ––
माप 3 मिनट 0 मिनट 3 मिनट 3
अंत पाश ––
अंत कार्यक्रम ––

तालिका 3: कार्यक्रम लेआउट।

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Discussion

इस पत्र में, हमने परिधीय रक्त से शुद्ध और व्यवहार्य प्राथमिक मानव एनके कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक अलग-थलग करने और उसे बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है । हमने एक एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर का उपयोग करके ऑक्सीजन खपत दर और बाहुलीय अम्लीकरण दर द्वारा मूल्यांकन की गई इन एनके कोशिकाओं की मेटाबोलिक गतिविधि के मापन के लिए शर्तों को भी अनुकूलित किया है। अन्य श्वसनीय तरीकों की तुलना में, एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर तेज होता है, कोशिकाओं की छोटी संख्या की आवश्यकता होती है, और उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग की अनुमति देता है। हालांकि, इसके अभिकर्ण महंगे हैं, और यौगिकों के इंजेक्शन सिर्फ चार तक सीमित हैं । एनके सेल में साइटोकिन्स द्वारा ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन की मेटाबोलिक रिमॉडलिंग और एक्टिवेशन मजबूत एनके सेल प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यकहै,और यहां वर्णित तकनीकें वास्तविक समय में एनके कोशिकाओं के मेटाबोलिक प्रोफाइल के अध्ययन की अनुमति देती हैं। इस प्रोटोकॉल को अन्य साइटोकिन्स, जैसे आईएल-2, आईएल-12 और आईएल-18, या एंटीबॉडी द्वारा सक्रिय कोशिकाओं तक बढ़ाया जा सकता है जो रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए बाध्य करते हैं। हमने कई महत्वपूर्ण चरणों को संबोधित किया है जिन्हें अक्सर अनदेखा किया जाता है, जैसे इष्टतम संगम पर कोशिकाओं को चढ़ाना या अधिकतम ऑक्सीजन खपत को प्रोत्साहित करने के लिए अनकूपरर की इष्टतम एकाग्रता का उपयोग करना। फिर भी, हम वास्तविक ओ2 स्तर घटता(चित्रा 3C)की जांच करने की सलाह देते हैं, यदि आईएल-15 से अलग अन्य उत्तेजनाएं कोशिकाओं को दी जाती हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कि ओ2 कुओं में समाप्त नहीं हो रहा है। यदि ऐसा था, तो सेल संख्या को तब तक कम किया जाना चाहिए जब तक कि वास्तविक ओसीआर के कम अनुमान को रोकने के लिए एक रैखिक ओ2 खपत नहीं देखी जाती है।

बेसल श्वसन कोशिका की बेसल मेटाबोलिक स्थिति को दर्शाता है, जो काफी हद तक माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी सिंथेस 8 की गतिविधि सेनियंत्रितहोता है, और बेसल एटीपी मांग (प्रोटीन+संश्लेषण, साइटोस्केलेटन गतिशीलता, एटीपी जैसे ना+/ आमतौर पर, पर्याप्त सब्सट्रेट्स की उपस्थिति में यह पैरामीटर मेटाबोलिक रूप से सक्रिय या तनावग्रस्त कोशिकाओं में बढ़ता है। ओलिगोमाइसिन के अलावा, जो एटीपी सिंथेस को ब्लॉक करता है, एटीपी से जुड़े श्वसन और प्रोटोन रिसाव का पता चलता है, जो लिपिड बाइलेयर या इनर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के प्रोटीन में हो सकता है, लेकिन अकपलिंग प्रोटीन (यूसीपी)9जैसे प्रोटीन के माध्यम से भी प्रेरक हो सकता है, अनुकूली थर्मोजेनेसिस के नियमन में फंसाया गया है और इस प्रकार ब्राउनपोसी में गर्म करने के लिए मिटोनड्रियल ऊर्जा क्षमता को परिवर्तित करता है। मैक्सिमल श्वसन माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला के लिए सब्सट्रेट्स की उपलब्धता और श्वसन परिसरों की मात्रा और गतिविधि सहित कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन परिसरों और उनकी गतिविधि को पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों जैसे एसिटिलेशन या फॉस्फोरिलेशन22,23द्वाराभी संशोधित किया जा सकता है। यह पैरामीटर कोशिकाओं के स्वास्थ्य और तीव्र अपमान का जवाब देने के लिए उनकी क्षमता को भी इंगित कर सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन की स्थितियों के तहत, अधिकतम श्वसन कम हो जाता है, और यह एटीपी मांग में परिवर्तन का जवाब देने के लिए सेल की क्षमता को सीमित करता है और सेल मृत्यु24की ओर जाता है।

यह टिप्पणी करना बहुत महत्वपूर्ण है कि, माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलिसिस तनाव परीक्षणों के हर बार बिंदु के लिए, ECAR ग्लाइकोलिस-व्युत्पन्न एसिडिफिकेशन का योग है (लैक्टेट + एच+की पीढ़ी के माध्यम से) औरश्वसन-व्युत्पन्नएसिडिफिकेशन (सीओ 2 की पीढ़ी के माध्यम से, जो एच2ओ में एचओओ 3- और एच+उत्पन्न करने के लिए घुल जाता है), और महत्वपूर्ण बात, श्वसन-व्युत्पन्न एसिडिफिकेशन कुछ सेल प्रकार25में कुल ईएआर का पर्याप्त अनुपात हो सकता है।3 इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए, वास्तविक ग्लाइटोलिटिक दरों की गणना करने के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल हैं। इस उद्देश्य के लिए, ग्लाइकोलिटिक तनाव परीक्षण(चित्रा 4G)के दौरान ऑक्सीजन की खपत दरों का उपयोग हर समय बिंदु पर श्वसन द्वारा प्रोटोन उत्पादन दर की गणना करने के लिए किया जा सकता है, और उस मूल्य को कुल प्रोटोन उत्पादन दर से घटाया जा सकता है, जिसे ईएआर मूल्यों और मध्यम7,25, 26,26की बफरिंग शक्ति का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है।,

निर्माता की सिफारिश की तुलना में इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण संशोधन ग्लालिसिस तनाव परीक्षण का दूसरा इंजेक्शन है। एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन को ओलिगोमाइसिन के लिए पसंद किया जाता है, कई कारणों से जिन्हें पहले ही वर्णित किया जा चुका है7:1) कुछ कोशिकाएं एक उच्च ग्लाइकोलिटिक क्षमता प्रदर्शित करती हैं जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन के अभाव में भी कोशिका की बेसल एटीपी मांग को पूरी तरह से पूरा कर सकती हैं; 2) एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन के साथ ईटीसी को अवरुद्ध करने से कृत्रिम रूप से सेल की एटीपी मांग बढ़ जाती है, क्योंकि यह एटीपी सिंथेस (माइटोकॉन्ड्रिया एक एटीपी सिंक बन जाता है) द्वारा एटीपी हाइड्रोलिसिस का कारण बनता है, जो श्वसन अवरोध के बाद गिरने वाली माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को ठीक करने के प्रयास में प्रोटॉन पंप करने के लिए उलट जाता है; 3) ईटीसी को अवरुद्ध करने से मध्यम (टीसीए चक्र में उत्पन्न श्वसन सह 2 जो एचसीओ3 - और एच+में परिवर्तित होता है) केश्वसनअम्लीकरण को रोकता है जो ईसीए परिणामों को चकित कर सकता है। इस प्रकार, एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन के साथ मनाया गया अधिकतम आईसीएआर केवल ग्लाइकोलिस के कारण होता है। दिलचस्प बात यह है कि यह सूचित किया गया है कि अकेलेश्वसनअवरोधकों के साथ मनाया गया आईसीएआर अभी भी उपमैक्सीमल 7 हो सकता है, और सेलुलर एटीपी मांग (और इसलिए अधिकतम आईसीएआर) को बढ़ाने के लिए एक अतिरिक्त तंत्र का वर्णन किया गया है: आयनोफोर मोनेंसिन के अलावा, जो ना+ के आयात को सेल27 में बढ़ाता है और प्लाज्मा झिल्ली ना+ //K+ -ATPase द्वारा एटीपी हाइड्रोलिसिस की दर को उत्तेजित करता है, जो एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन7के मिश्रण तक है।

एक दूसरी महत्वपूर्ण अवधारणा यह है कि हम गैर-ग्लायकोलिटिक एसिडिफिकेशन के घटाव की सिफारिश नहीं करते हैं, जो शायदश्वसन सीओ 2 से मेल खाता है जो निर्माता द्वारा अनुशंसित ग्लायॉलिक मापदंडों की गणना करने के लिए पूरे ट्रेस से एचसीओ3- और एच+में परिवर्तित होता है, ग्लाइकोलिसिस स्ट्रेस टेस्ट के प्रत्येक चरण के दौरान यह राशि काफी बदल जाती है (यह बेसल राज्य में सबसे अधिक है, क्रैबट्री प्रभाव20के कारण ग्लूकोज के अलावा कम हो जाती है, और एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन के साथ लगभग समाप्त हो जाती है)(चित्रा 5)।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल एक बाहुलीय फ्लक्स एनालाइजर के साथ मानव प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं की मेटाबोलिक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए एक सरल और कुशल उपकरण दिखाता है। इस विधि का उपयोग इन कोशिकाओं में मेटाबोलिक स्थिति से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है, जिसे साइटोकिन उत्तेजना द्वारा या कुछ रोग स्थितियों के तहत कोशिका सक्रियण के साथ बदलने के लिए जाना जाता है, जिसमें मोटापा, कैंसर या वायरल संक्रमण28शामिल हैं।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक समर्थन और चर्चा के लिए डॉ माइकल एन बोरी (नेशनल हार्ट, फेफड़े, और रक्त संस्थान) का शुक्रिया अदा करते हैं । इस अध्ययन को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान और राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। संयुक्त को एमआईसीएन (स्पेन) के रेमन वाई कैजल प्रोग्राम (अनुदान RYC2018-026050-I) द्वारा समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

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References

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मानव प्राकृतिक हत्यारा सेल मेटाबोलिज्म का विश्लेषण
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Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

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