Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse av human naturlig killer celle metabolisme

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/61466
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

I dette papiret beskriver vi en metode for å måle glykose og mitokondriegånding i primære humane Natural Killer (NK) celler isolert fra perifert blod, i ro eller etter IL15-indusert aktivering. Protokollen som beskrives kan lett utvides til primære menneskelige NK-celler aktivert av andre cytokiner eller løselige stimuli.

Abstract

Natural Killer (NK) celler medierer hovedsakelig medfødte anti-tumor og anti-viral immunrespons og reagerer på en rekke cytokiner og andre stimuli for å fremme overlevelse, cellulær spredning, produksjon av cytokiner som interferon gamma (IFNγ) og / eller cytotoksisitetsprogrammer. NK celle aktivering av cytokin stimulering krever en betydelig ombygging av metabolske veier for å støtte deres bioenergetiske og biosyntetiske krav. Det er en stor mengde bevis som tyder på at nedsatt NK celle metabolisme er forbundet med en rekke kroniske sykdommer, inkludert fedme og kreft, som fremhever den kliniske betydningen av tilgjengeligheten av en metode for å bestemme NK celle metabolisme. Her beskriver vi bruken av en ekstracellulær fluksaysator, en plattform som tillater sanntidsmålinger av glykose og mitokondrieoksygenforbruk, som et verktøy for å overvåke endringer i energimetabolismen til menneskelige NK-celler. Metoden som er beskrevet her, gjør det også mulig å overvåke metabolske endringer etter stimulering av NK-celler med cytokiner som IL-15, et system som for tiden undersøkes i et bredt spekter av kliniske studier.

Introduction

Natural Killer (NK) celler er medfødte lymfocytter som medierer anti-tumor og anti-virale responser. NK-celler utgjør 5-15% av alle lymfocytter i humant perifert blod, og finnes også i milt, lever, benmarg og lymfeknuter. NK-celler uttrykker ikke polymorfe klnotypiske reseptorer, for eksempel T-cellereseptorer (TCR) eller B-cellereseptorer (BCR). I motsetning blir aktiveringen av deres cytolytiske funksjoner tilskyndet av engasjement av reseptorer som gjenkjenner uforanderlige ligandes på overflaten av en målcelle1,2.

Hvile menneskelige NK celler isolert fra perifert blod kan overleve i flere dager i kultur medium supplert med menneskelig serum. Aktivering av NK-celler av cytokiner som IL-15 eller IL-2 driver cellene til spredning og til en økning av deres drapsevne, blant anneteffekter 3,4,5. Flere studier har vist en direkte sammenheng mellom NK celleaktivering og endringer i deres metabolskeaktivitet 6. Disse metabolske endringene er bestemt til å møte de spesielle kravene til cellene når det gjelder energi og biosyntese.

Aerobe celler og organismer får energi gjennom en rekke kjemiske reaksjoner som involverer katabolisme og oksidasjon av karbohydrater, fett og proteiner. Gjennom en kombinasjon av glykose, tricarboxylic acid (TCA) syklus og oksidativ fosforylering, eukaryotiske celler oppfyller flertallet av deres ATP etterspørsel og få mellomprodukter som kreves som byggeklosser for makromolekyler avgjørende for cellevekst og spredning. Prosessen med glykose (figur 1A) starter med inntreden av glukose i cellen. I cytosolen er glukose fosforylert og forvandlet til pyruvat (med en nettoproduksjon av 2 molekyler av ATP per glukosemolekyl), som kan reduseres til laktat eller transporteres inn i mitokondriene for å bli forvandlet til Acetyl-CoA og gå inn i TCA-syklusen. TCA-syklusen fortsetter å sykle drevet med flere molekyler av Acetyl-CoA og produserer CO2 (som til slutt vil spre seg utenfor cellen, og ved å reagere med H2O i mediet, vil generere karbonsyre som vil føre til forsuring av mediet) og NADH, molekylet som har ansvaret for å donere elektroner til elektrontransportkjeden (ETC). Elektronene reiser gjennom forskjellige proteinkomplekser og blir endelig akseptert av oksygen. Disse kompleksene (I, III og IV) pumper også H+ fra mitokondriematrisen inn i mellommembranerommet. Som en konsekvens av den elektrokjemiske gradienten som genereres, vil H+ gå inn igjen til matrisen gjennom den komplekse V (ATP-syntase), investere den potensielle energien akkumulert i generasjonen av ATP.

Både glykose og mitokondrie respirasjon kan blokkeres på forskjellige punkter ved hjelp av inhibitorer. Kunnskapen og bruken av disse hemmerne var grunnlaget for utviklingen av den ekstracellulære fluksanalysen. Ved å måle to enkle parametere i sanntid som pH og oksygen, utleder den ekstracellulære fluksaysatoren frekvensen av glykose og mitokondrieånding i en 96-brønns plate. Glykolysestresstesten utføres i et basalmedium uten glukose (figur 1B)7. De første målingene av den ekstracellulære forsuringsraten (ECAR) indikerer glykolyse-uavhengig forsuring. Det kalles ikke-glykolytisk forsuring og korrelerer med CO2 produsert av TCA som, som forklart tidligere, kombinerer med H2O i mediet for å generere H+ (TCA-koblet ECAR). Den første injeksjonen er glukose for å indusere glukoseutnyttelse og øke glykose. Den andre injeksjonen kombinerer både rotenon, en kompleks I-hemmer, og antimycin A, en kompleks III-hemmer sammen, for å blokkere ETC. Cellene reagerer på denne dramatiske reduksjonen i mitokondrie-ATP-produksjon ved å aktivere glykose for å opprettholde cellulære ATP-nivåer, og dette representerer mengden glykose som ikke brukes av cellen i basaltilstanden, men kan potensielt rekrutteres som svar på økninger i ATP-etterspørsel (kompenserende glykose). Den tredje injeksjonen er glukoseanalogen 2-Deoksygllukose (DG), som konkurrerer med glukose som substrat for enzymet hexokinase. Produktet av denne fosforyleringen, 2-deoksygllukose-6-fosfat kan ikke forvandles til pyruvat, og derfor er glykose blokkert, noe som senker ECAR til et minimum. ECAR målt på dette punktet inkluderer andre kilder til ekstracellulær forsuring som ikke tilskrives glykose eller respiratorisk aktivitet, samt eventuell gjenværende glykolyse som ikke er fullt hemmet av 2-DG (post 2-DG-forsuring).

Mitokondriestresstesten utføres i et medium med glukose (figur 1C)8. De første målingene av oksygenforbruket (OCR) tilsvarer basislinjen for mitokondrierespirasjon (basal respirasjon). Den første injeksjonen er oligomycin, som hemmer retur av protoner gjennom ATP-syntase (kompleks V), blokkerer ATP-syntese og dermed raskt hyperpolariserer mitokondriemembranen, noe som forhindrer ytterligere protonpumping gjennom respiratoriske komplekser, og fører til en reduksjon i OCR. Sammenligningen mellom baseline respirasjon og verdien gitt ved tilsetning av oligomycin representerer ATP-koblet åndedrett. Den gjenværende oligomycin-ufølsomme frekvensen av oksygenforbruk kalles protonlekkasje, som representerer strømmen av protoner gjennom lipid bilayer eller proteiner i den indre mitokondriemembranen som adeninkjernerotidtranslocase9. Den andre injeksjonen er den ukoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), en iionophore som induserer en massiv oppføring av H+ inn i mitokondriematrisen, noe som fører til depolarisering av mitokondriemembranen og forstyrrelse av mitokondrie-ATP-syntese. Celler reagerer på spredning av protonmotivkraften ved å øke frekvensen av elektrontransport og oksygenforbruk til maksimale nivåer i et nytteløst forsøk på å gjenopprette membranpotensialet (maksimal respiratorisk kapasitet). Forskjellen mellom maksimal respiratorisk kapasitet og basal respirasjon er cellens ekstra respiratoriske kapasitet, som representerer mengden åndedrett som ikke brukes av cellen til å generere ATP i basaltilstand, men kan potensielt rekrutteres som svar på økninger i ATP-etterspørsel eller under forhold med stress8. Den tredje injeksjonen er en kombinasjon av rotenon og antimycin A. Denne injeksjonen stopper fullstendig ETC og OCR reduseres til sitt laveste nivå, med det gjenværende oksygenforbruket som ikke-mitokondrie (forårsaket av NADPH-oksidaser, etc.).

Endringer i metabolske veier kan liksom forutsi funksjonen av NK-celler, som det har blitt foreslått at kontinuerlig aktivering av NK-celler med cytokiner in vitro kan føre til NK celleutmattelse ved studiet av forskjellige metabolske veier10,11. Sammenhengen mellom NK celle metabolsk status og funksjon er svært viktig fra synspunkt av kreft immunterapi. I dette feltet har aktivering av NK-celler med infusjon av IL-15, alene eller i kombinasjon med monoklonale terapeutiske antistoffer blitt testet for å forbedre tumorcelledrap12,,13,,14. Kunnskapen om metabolsk status for NK-cellene som svar på disse behandlingsstrategiene ville gi en verdifull prediktor for NK celleaktiveringsstatus og drapsfunksjon.

Studien av metabolske veier i andre myeloide og lymfoide celler som monocytter, T og B celler har blitt beskrevet15 og optimaliserte metoder har blitt publisert16. I denne protokollen gir vi en metode som kombinerer både en NK-isolasjonsprotokoll som gir høyt antall rene og levedyktige NK-celler og en optimalisert protokoll for å måle metabolsk aktivitet ved hjelp av en ekstracellulær fluksaysator. Her viser vi at dette er en gyldig metode for studiet av metabolske endringer i hvile og IL-15 aktiverte menneskelige NK-celler. For den ekstracellulære fluksanalysen har parametere som cellenummer og legemiddelkonsentrasjoner blitt testet og optimalisert. Sammenlignet med andre respirometriske metoder, er den ekstracellulære fluksalysatoren helautomatisk og i stand til å teste i sanntid, med svært lave mengder celler, opptil 92 prøver samtidig, og tillater dermed høy gjennomstrømning screenings (med flere prøver og replikerer) på en relativt raskmåte 17.

Denne metoden kan brukes av forskere som er interessert i å vurdere NK cellefunksjon ved å studere NK cellemetabolisme. Det kan brukes også på celler aktivert av andre cytokiner, antistoffer eller løselige stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i samsvar med Helsingfors's etiske prinsipper for medisinsk forskning. Perifere blodprøver fra donorer ble hentet fra NIH Department of Transfusion Medicine under 99-CC-0168 IRB godkjentprotokoll, med pasientskrevet informert samtykke.

1. Klargjøring av reagens

  1. Reagenser for isolering av NK-celler
    MERKNADER: Forbered disse reagensene i en cellekulturhette.
    1. Klargjør NK-separasjonsbuffer: Supplement PBS (pH 7.4) med 1 mM EDTA og 2% Fetal Calf Serum (FCS) som tidligere har vært varmeaktivert (ved 56 °C i 30 min).
    2. Forbered NK kultur medium: Supplement Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) med 10% Human Serum (HS). Sterilt filter og oppbevares ved 2-8 °C. Varm mediet til 37 °C før du legger til cellene.
    3. Resuspend Human IL-15 i PBS ved 200 μg/ml.
  2. Reagenser for ekstracellulær fluksanalyse
    1. Forbered analysemedier: For mitokondriestresstestmedium, tilsett 1 mM natriumpyuvat, 2 mM L-glutamin og 10 mM glukose til basismediet; for glykose stress test medium, tilsett 2 mM L-glutamin til basismediet.
      MERK: Konsentrasjonene av glukose, pyruvat og glutamin er gitt som anbefalt av den ekstracellulære fluksalysatorprodusenten. Imidlertid kan mediesammensetning endres av forskere for å passe perfekt til kulturmediet, om ønskelig.
    2. Juster pH-en til begge mediene til 7,4 med 0,1 N NaOH ved hjelp av en pH-måler på benkeplaten, sterilt filter gjennom en porestørrelse på 0,2 μM og oppbevares ved 2-8 °C. Varm media til 37 °C, kontroller pH og juster til 7,4 før bruk om nødvendig.
      MERK: Kun omgivelses-CO2 finnes i atmosfæren til den ekstracellulære fluksalysatoren, bruk av medier uten bikarbonat er kritisk.
    3. Klargjør lagerløsninger for reagenser: Oligomycin (ATP syntasehemmer), 10 mM lagerløsning i DMSO; 2,4-dinitrophenol (DNP, uncoupler), 1 M lagerløsning i DMSO; antimycin A (kompleks III-hemmer), 10 mM lagerløsning i DMSO; rotenon (kompleks I-hemmer), 10 mM lagerløsning i DMSO. Lag 30 μL aliquots av alle reagenser og oppbevar ved -20 °C.
      MERK: Disse retningslinjene er ment for reagenser kjøpt individuelt og utarbeidet av forskeren. Hvis reagenser kjøpes fra analysatorprodusenten i stedet, følger du retningslinjene for reagensforberedelse.

2. NK celler isolasjon fra perifert blod

  1. Perifere blod mononukleære celler (PBMCs) forberedelse fra humant blod
    MERK: Utfør disse trinnene i en cellekulturhette. Dekontaminere alle rester og materiale i kontakt med blod med blekemiddel og kast dem i riktig beholder som skal brennes.
    1. Pipette 20 ml lymfocyttseparasjonsmedium (LSM) i et konisk rør på 50 ml.
    2. Forsiktig, mens du holder røret i en 30 ° vinkel, pipette 20 ml blod over LSM, veldig forsiktig og berøre veggen av røret. Unngå blanding av blod med LSM og skape en synlig og veldefinert interfase mellom de to væskene.
      MERK: Perifert blod eller berikede leukafereseprodukter kan brukes.
    3. Sentrifuger rørene i 25 min, 1000 x g ved romtemperatur. Ikke bruk bremse, da det kan gjøre begge fasene i røret (LSM og blod) blanding.
    4. Ta forsiktig ut rørene fra sentrifugen og legg dem i et stativ. Kontroller tilstedeværelsen av et iøynefallende lag av celler (mononukleære celler) som vil danne seg i mellomfase mellom LSM (klar) og plasma (gul), mens røde blodlegemer pellet på bunnen av røret.
    5. Aspirer forsiktig det mononukleære cellelaget med en 10 ml plastpipette (rundt 5-8 ml) og legg det i et nytt konisk rør på 50 ml. Lymfocyttinterfaget på opptil 2 forskjellige rør kan samles sammen.
    6. Vask de mononukleære cellene 2x ved å bruke på nytt i 45 ml PBS og sentrifugering ved 800 x g i 5 min, ved romtemperatur.
      MERK: Etter dette trinnet oppnås en pellet av perifere blodmononukleære celler (PBMCer) og forskeren kan gå videre til NK-isolasjonstrinnet.
  2. NK-isolasjon fra PBMCer
    1. Telle cellene fra 2.1.6 og resuspend dem i NK Separasjon Buffer (1x 108 PBMCs / ml).
    2. Ta 10 ml cellerefusjon (109 PBMCer) og plasser dem i et 50 ml rør.
    3. Tilsett 500 μL (50 μL/ml buffer) av NK-celleisoleringsantistoffblanding og 10 μL (1 μL/ml buffer) med anti-CD3 positiv isolasjonsantistoffblanding til PBMCene og inkuber ved romtemperatur i 10 min.
    4. Vortex de magnetiske perlene og tilsett 1 ml til blandingen av PBMCer med antistoffer (100 μL perler / ml PBMCer). Inkuber i 10 min ved romtemperatur ved av og til omrøring.
    5. Tilsett 35 ml NK-isolasjonsbuffer (3,5 ml buffer/ml PBMCer), bland og plasser på magneten i 15 min (2,2 x 107 PBMCer/ml). Etter den tiden vil perlene og cellene positivt valgt (alle unntatt NK-celler) ha holdt seg til veggene i røret.
    6. Samle forsiktig opp supernatanten (som inneholder NK-celler) med en 50 ml plastpipette uten å berøre sidene eller bunnen av røret.
    7. Telle cellene ved hjelp av en celle teller og sentrifuge på 800 x g for 5 min.
    8. Resuspend isolerte NK-celler ved 5 x 106 celler/ml i IMDM som inneholder 10 % HS og plasser dem i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 til forsøket utføres.
      MERK: Denne NK-isolasjonsprotokollen yter cellenumre og reagensvolumer tilpasset bruk av et 50 ml rør og en stor magnet. Denne protokollen kan skaleres opp (i tilfelle flere PBMCer oppnås) ved å gjenta isolasjonstrinnene i forskjellige rør eller skaleres ned ved å redusere volumet i røret. For endelige volumer på 14-45 ml brukes et 50 ml polystyrenrør, for volumer 4-14 brukes et 15 ml polystyrenrør og for volumer 1-4 ml brukes et 5 ml polystyrenrør. Magneten er forskjellig og passer til riktig rør i hvert tilfelle. Mengden antistoffblanding og magnetiske perler kan også skaleres i henhold til antall celler og det endelige volumet.
  3. NK cellepopulasjonsfarging for strømningscytometri
    1. Ta 0,25 x 106 celler per prøve fra trinn 2.2.8, fjern mediet ved sentrifuging ved 800 x g i 5 min ved romtemperatur og gjenoppuss cellepellet i 500 μL PBS.
    2. Tilsett levedyktighet fargestoff i henhold til produsentens anbefaling (1 μL DMSO-rekonstituert fargestoff til 1 ml celleusfusjon) og inkuber ved romtemperatur i 30 min.
    3. Vask 2x ved å bruke på nytt i 5 ml PBS og sentrifugering ved 800 x g i 5 min, ved romtemperatur.
    4. Flekk med tilsvarende anti-menneskelige antistoffer i 100 μL IMDM som inneholder 10% HS i 30 min på is beskyttet mot lys (se tabell 1). Alle antistoffene kan kombineres og brukes i et enkelt fargetrinn.
    5. Analyser prøvene etter flytcytometri for å evaluere renheten til NK-cellepopulasjonen oppnådd. Bruk cellesekings- og analysemetoden som tidligere er beskrevet18,19.
  4. NK celler stimulering med løselig IL-15
    1. Resuspend 0,75 x 106 celler fra trinn 2.2.8 eller 2.4.3 i 100 μL av IMDM som inneholder 10% HS i en brønn på en 96 brønnplate (rund bunn).
    2. Fortynn human IL-15 til 1 μg/ml i IMDM som inneholder 10 % HS. Tilsett 100 μL av den fortynnede menneskelige IL-15 til cellene for å nå en endelig konsentrasjon på 0,5 μg/ml.
      MERK: 0,5 μg/ml er en mettende konsentrasjon på IL-15. Lavere konsentrasjoner av IL-15 eller andre cytokiner som IL-2, IL-12 eller IL-18 kan testes av forskere hvis ønskelig.
    3. Plasser cellene i inkubatoren ved 37 °C og stimuler i 48 timer før de utfører den ekstracellulære fluksanalysen. Resuspend uforstimulerte (kontroll) celler ved samme konsentrasjon og volum i IMDM som inneholder 10% HS uten IL-15, og plasser dem i samme inkubator i 48 timer.

3. Hydrering av sensorpatron

MERK: Sensorspissene på 96 proberåtten inneholder individuelle fluoroforer for O2 og H+ som må hydreres for å oppdage O2- og pH-endringer.

  1. Slå på analysatoren og la den varme opp til 37 °C.
  2. Åpne sensorkassettpakken og skill sensorkassetten fra nytteplaten. Tilsett 200 μL kalibrantoppløsning i hver brønn av nytteplaten og sett sensorkassetten tilbake på platen, og valider at sensorene er helt nedsenket i oppløsningen. For optimale resultater inkuber patronen over natten ved 37 °C i en CO2-friinkubator som er riktig fuktet for å forhindre fordampning. Forhindre bobledannelse under sensorene under hydrering.
    MERK: Minste sylindertid for sylinderampulle er 4 timer ved 37 °C i en CO2-friinkubator. Alternativt kan hydrering over natten av sensorkassetten med 200 μL sterilt vann ved 37 °C i en CO2-friinkubator, etterfulgt av en inkubasjon av sensorpatronen med 200 μL forhåndsoppvarmet kalifarløsning 45 – 60 min før starten av løpet, brukes.

4. Ekstracellulær fluksanalyse

  1. Utarbeidelse av klebebelagte plater
    MERK: Siden målingen av metabolske parametere foregår i et mikrokammer dannet på bunnen av 96-brønnanalyseplaten, må suspensjonsceller først følges bunnen av brønnen. Et cellelim hentet fra blåskjell Mytilus edulis er ansatt. Produsenten av cellelimet anbefaler en beleggkonsentrasjon på 1 til 5 μg/cm2. Brønnen av analysator celle kultur mikroplate har en overflate på ca 0,110 cm2. For en konsentrasjon på 5 μg/cmkreves det derfor rundt 0,55 μg lim. Siden 25 μL av klebemiddeloppløsningen vil bli brukt til å belegge hver brønn, er den optimale selvklebende oppløsningskonsentrasjonen for analysatorcellekulturens mikroplater rundt 22,4 μg/ml (22,4 μg/ml x 0,025 ml = 0,56 μg).
    1. Forbered 2,5 ml cellelimoppløsning (22,4 μg/ml) i 0,1 M natriumbikarbonat, pH 8,0. Bikarbonat gir optimal pH for celletilhengsytelse som ifølge produsenten er mellom 6,5 og 8,0.
    2. Pipette 25 μL av cellelimløsningen til hver brønn av analyseplaten og inkuber ved romtemperatur i 20 min. Deretter fjerner du oppløsningen og vasker 2x med 200 μL sterilt vann/brønn. La brønnene tørke ved å holde platen åpen i 15 minutter inne i en cellekulturhette.
      MERK: Belagte plater kan oppbevares i opptil 1 uke ved 4 °C.
  2. Cellesåing i plater belagt med lim
    1. Sentrifugeceller fra trinn 2.4.3 ved 200 x g i 5 min ved romtemperatur. Fjern supernativa og vask celler i oppvarmet mitokondriestresstestmedium (hvis en mitokondriestresstest utføres) eller glykosestresstestmedium (hvis en glykolysestresstest utføres). Pelletceller igjen og resuspend til foretrukket cellekonsentrasjon i samme medium (resuspension volum vil avhenge av cellekonsentrasjonen valgt; siden hver brønn vil inneholde 180 μL av celle suspensjon, forberede 0,26 x 106,0,52 x 106,1,04 x 106,2,08 x 106,4,17 x 106 og 8,33 x 106 celler / ml celle suspensjoner for 2 0,047 x 106,0,094 x 106,0,187 x 106,0,375 x 106,0,75 x 106 og 1. 5 x 106 celler per brønn).
    2. Plate 180 μL cellefjæring per brønn langs siden av hver brønn. En flerkanals pipette anbefales. Bruk brønnene A1, A12, H1 og H12 på analysekulturplaten som kontrollbrønner for bakgrunnskorreksjon. Tilsett 180 μL av analysemediet i disse brønnene (ingen celler). Ytterligere kontrollbrønner kan brukes om ønskelig, og hvis det er nok plass i platen.
      MERK: Tilstedeværelsen av serum kan forårsake dårlig celletilbehør.
    3. Inkuber platen i 30 min ved 37 °C i en CO2-friinkubator. Forbered 10x forbindelser i mellomtiden (se trinn 4.3 nedenfor).
    4. Endre sentrifugeinnstillingene til null bremsing. Sentrifuger platen ved 200 x g i 5 min. Vær oppmerksom på cellene under mikroskopet for å kontrollere at de danner et monolag nederst på brønnen. Overfør platene tilbake til CO2-friinkubator i 25 min. For best resultat bør total tid etter plating ikke være større enn rundt 1 time.
  3. Utarbeidelse av 10x arbeidsløsninger for å laste inn i sensorpatronen
    MERK: Hver av de 96 probespissene på sensorkassetten har 4 porter (A, B, C og D) som kan brukes til å injisere forbindelser sekvensielt i individuelle brønner.
    1. For å utføre mitokondriestresstest, klargjør du 2,5 ml hver av 10 μM oligomycin, 1 mM DNP og en blanding av 10 μM rotenon og 10 μM antimycin A, i mitokondriestressanalysemedium (bruk lagerløsningene fra trinn 1.2.3). Endelige konsentrasjoner i brønnen etter injeksjon vil være 1 μM oligomycin, 0,1 mM DNP og 1 μM antimycin A/rotenon.
    2. For å utføre glykosestresstest, klargjør 2,5 ml av en blanding av 10 μM rotenon og 10 μM antimycin A i glykosestressanalysemedium (bruk lagerløsningene fra trinn 1.2.3). Oppløs glukose i glykolyse stress test medium for en 100 mM løsning og 2-deoksy-glukose (2-DG) i glykolyse stress test medium for en 500 mM løsning. Endelige konsentrasjoner i brønnen etter injeksjon vil være 10 mM glukose, 1 μM antimycin A/rotenon og 50 mM 2-DG.
    3. Varme oppløsninger til 37 °C, sjekk pH og juster til 7,4 om nødvendig. Last forbindelser utarbeidet i trinn 4.3.1. (for en mitokondriestresstest) eller 4.3.2 (for en glykolysestresstest) i port A, B og C i den hydrerte sensorkassetten (fra trinn 3.2) ved hjelp av en flerkanals mikropipettor og portlastingsveiledningene som følger med sylinderampullen, som vist i tabell 2.
      MERK: For å sikre riktig injeksjon i alle brønner under analysen må hver rekke porter som brukes (f.eks. alle porter A) inneholde samme injeksjonsvolum på tvers av hele sensorkassetten. Dette gjelder bakgrunnskorrigeringsbrønner og til og med de brønnene som ikke brukes i forsøket.
    4. Inkuber den lastede sensorpatronen ved 37 °C i en CO2-friinkubator under konfigurering av programmet.
  4. Sette opp ekstracellulære fluksanalyseprotokoller
    1. Åpne den ekstracellulære fluksaysatorprogramvaren, og ved hjelp av kategoriene Gruppedefinisjoner og Platekart angir grupper av brønner som har lignende forhold (f.eks. brønner med samme antall celler eller brønner med enten hvileceller eller IL-15-stimulerte celler). Angi også bakgrunnskorrigeringsbrønner (som standard vil A1, A12, H1 og H12 bli satt, men flere brønner kan brukes) og tomme brønner.
    2. Konfigurer programmet som er beskrevet i tabell 3 i programvaren ved hjelp av kategorien Protokoll.
    3. Start programmet ved hjelp av kategorien Kjør analyse. Plasser sensorkassetten (hydrert og lastet med 10x forbindelser) og nytteplaten på brettet. Etter kalibreringstrinnet (15 – 20 min), når du blir bedt om det, må kalibrantplaten skiftes ut for analyseplaten (uten lokk) med vedlagte celler. Etter dette er løpet helautomatisk (maskinen vil utføre alle målinger og injeksjoner).
      MERK: Det er mulig å utføre en mitokondriestresstest og en glykolytisk stresstest i samme plate, så lenge de spesifikke forbindelsene lastes inn i de riktige portene (oligomycin, DNP og antimycin/rotenon i port A, B og C henholdsvis av brønnene der en mitokondriestresstest utføres; glukose, antimycin/rotenon og 2-DG i port A, B og C av brønnene der en glykolysestresstest utføres), brukes de samme volumene for injeksjoner i hver serie av porter og brønner for hver test som er riktig identifisert ved hjelp av kategoriene Gruppedefinisjoner og Platekart i programvaren.
    4. Etter at kjøringen er fullført, henter du dataene og analyserer dem ved hjelp av programvaren.

5. Bestemmelse av cellenummer

MERK: Resultatene kan normaliseres for å ta høyde for mulige forskjeller i cellenummer. To store tilnærminger beskrevet nedenfor kan brukes.

  1. Bestemmelse av DNA-innhold
    1. Fjern det gjenværende analysemediet med en pipette fra hver brønn. Når du aspirerer medium, vær forsiktig så du ikke forstyrrer cellene. Platen kan oppbevares ved -20 °C til analyse.
      MERK: Frysetrinnet er viktig for effektiv bestemmelse av cellelys og DNA-innhold.
    2. Forbered en 1x løsning av celleproliferasjonsanalysecellelysbuffer (20x) i destillert vann (200 μL/brønn).
    3. Legg til cellespredningsanalysen fargestoff lagerløsning (400x) i 1x celle-lysis buffer. For påvisning av 50 til 50.000 celler per brønn, bruk 1x celleproliferasjonsanalyse fargestoff. For høyere celletall anbefales bruk av cellespredningsanalysen ved en endelig konsentrasjon høyere enn 1x. I dette tilfellet, bruk cellespredningsanalysen fargestoff ved en 5x endelig konsentrasjon (fortynne cellespredningssløsningen 80 ganger i 1x cellelysbuffer).
    4. Tilsett 200 μL av celleproliferasjonsanalysereagensen til hver brønn. Inkuber prøvene i 2–5 min ved romtemperatur. Beskytt mot lys.
    5. Mål fluorescensen av prøvene ved eksitasjon: 480 nm; utslipp: 520 nm ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser i henhold til produsentens anbefalinger.
  2. Bestemmelse av proteininnhold
    1. Forsiktig, aspirere helt analysemediet fra hver brønn uten å berøre cellene og fryse cellene ved -20 °C i minst 1 time. Alternativt kan cellene holdes frosset i lengre tid (opptil 1 uke) til analysen utføres.
    2. Tilsett 50 μL radioimmunoprecipitation analyse (RIPA) lysis medium supplert med 1x proteasehemmere (fra en 100x lagerløsning) til hver brønn. Legg platen på en shaker i 5 min ved romtemperatur, og inkuber deretter platen på is i 30 min for en komplett cellelys.
    3. Sentrifuger platen i 5 min ved 200 x g ved romtemperatur. Dette trinnet vil pellet cellulært rusk for å hindre interferens med proteinmålingen.
    4. Mål proteinkonsentrasjon ved bicinchoninsyre (BCA) analyse i henhold til produsentens anbefalinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av NK-celler fra perifert blod gir en ren og levedyktig befolkning

Den ekstracellulære fluksanalysen er basert på måling av H+ og O 2 konsentrasjon ibrønnen og vil ikke skille mellom ulike populasjoner av celler eller deres levedyktighet. Av denne grunn var det å få en svært ren og levedyktig befolkning av interessecellen det viktigste skrittet for å lykkes i disse eksperimentene.

Isolering av NK-celler fra perifert blod ble utført som angitt i avsnitt 2. For å vurdere renheten og levedyktigheten til NK-cellene som ble oppnådd, ble små aliquots fra PMBCer og den isolerte NK-cellepopulasjonen farget og analysert av strømningscytometri (figur 2A). Mononukleære celler ble inngjerdet i plottet som viser fremover (FSC-A) versus sidespøsområde (SSC-A). Innenfor denne populasjonen ble enkeltceller inngjerdet langs diagonalen i plottet som viser FSC-A versus fremover scatter høyde (FSC-H). Innenfor singletpopulasjonene ble levedyktigheten vurdert, og funnet å være høyere enn 98% i begge, PMBCer og NK cellepopulasjoner. Renheten av NK cellepopulasjonen isolert ble etablert ved dobbel farging mot CD3 (tilstede i T-celler, den dominerende befolkningen blant PBMCS) og CD56 eller NKp46 (figur 2B). NK-celler er definert som populasjonsnegativ for CD3 og positivt for CD56 eller NKp46. Ifølge disse kriteriene var renheten til NK-cellene rundt 88%, noe som representerer en 18-ganger berikelse på NK-celler sammenlignet med de som er tilstede i PBMCs-befolkningen.

OCR- og ECAR-verdier er avhengige av cellenummer

For mitokondriestresstesten ble cellene metabolsk perturbed ved tillegg av tre forskjellige forbindelser: oligomycin, DNP og antimycin A + rotenon. For hver celletype ble antall celler per brønn nøye optimalisert for et ekstracellulært fluksanalyseeksperiment. Figur 3A viser representative tomter av mitokondrie oksygenforbruk (OCR) ved hjelp av flere menneskelige NK celletall (0,75 x 106,0,375 x 106,0,187 x 106,0,094 x 106 og 0,047 x 106). Alle målinger ble gjort i triplicate. Celletall korrelerer lineært med mengden DNA eller protein i brønnen (figur 3B). Som forventet viste høye celletall høyere OCR-verdier, mens færre enn 0,187 x 106 celler per brønn ikke ga robuste resultater. På den annen side var høyere celletall (1,5 x 106) ikke optimale, da oksygenkonsentrasjonen i brønnen ble helt utarmet i hver syklus (figur 3C), som utelukker nøyaktig beregning av OCR. Konsentrasjonen av ukoupler må titreres nøye for hver celletype, da det ikke tilfører tilstrekkelige DNP-resultater i submaximal OCR, mens det å legge til for mye også kan hemme maksimal OCR. I humane NK-celler ble det funnet at 100 μM DNP var den optimale dosen (figur 3D). Andre ukulere som karbonylcyanid-4-(trifluorometotoksy) fenylhydrazon (FCCP) eller karbonylcyanid m-klorofenylhydrantzin (CCCP) kan også brukes i stedet for DNP, men må også titreres for hver celletype.

For glykose stresstest, etter en baseline måling av ECAR, ble glukosesultne celler perturbed av følgende forbindelser: glukose, antimycin A + rotenon og 2-DG. Figur 3E viser representative tomter av ECAR ved hjelp av flere NK-celler tall (0,75 x 106,0,375 x 106,0,187 x 106,0,094 x 106 og 0,047 x 106). Alle målinger ble gjort i triplicate. Glykolyse stressanalysen var mest vellykket på høyeste plating tetthet, mens færre enn 0,187 x 106 celler per brønn ikke ga robuste resultater.

IL-15-behandling øker OCR- og ECAR basal- og maksimalverdier

Den optimale såetettheten på 0,75 x 106 celler per brønn ble brukt til påfølgende eksperimenter. NK-celler ble dyrket i nærvær eller fravær av mettende konsentrasjoner av cytokin IL-15 i 48 timer, hvor etter hvilken tid deres levedyktighet ble funnet å være 93,7 ± 4,8% og 85,7 ± 12,0%, henholdsvis. Figur 4A,B viser et typisk mitokondriestresstesteksperiment med 0,75 x 106 NK-celler per brønn. I denne testen fører oligomycin til en dramatisk reduksjon i oksygenforbruket (figur 4A) og til en økning i ECAR som representerer en overgang til glykose for å prøve å opprettholde cellulære ATP-nivåer (figur 4B). Aktivering av NK-cellen av IL-15 forårsaket en økning i både mitokondrie oksygenforbruk og ekstracellulær forsuring. Dette resultatet var konsistent når flere personer ble sammenlignet (figur 4C). Basal, maksimal og ATP-koblet respirasjon, men ikke protonlekkasje eller ikke-mitokondriegjenånding, økt med IL-15 (figur 4C,D). Ocr/ECAR-frekvensen gikk også ned, noe som indikerer en trend for å skifte til en glykolytisk metabolisme etter IL-15 stimulering (figur 4E).

Figur 4F, G viser et typisk glykosestresstesteksperiment med 0,75 x 106 NK-celler per brønn. Tilsetning av glukose utløste en stor økning i ECAR på grunn av glykoseaktivering, mens påfølgende tilsetning av antimycin A og rotenon drev kompenserende glykose, og 2-DG forårsaket en hemming av banen og en reduksjon av ECAR til minimum (figur 4F). Parallelt forårsaket glukose konsekvent en liten reduksjon i oksygenforbruket, muligens av Crabtree-effekten20, mens antimycin A og rotenon fullstendig blokkerte respirasjonen og 2-DG gir ingen ytterligere effekter (figur 4G). Aktivering av både ekstracellulær forsuring og mitokondrie oksygenforbruk med IL-15 kan observeres også i denne testen, og igjen er dette konsistent når du bruker celler fra flere donorer (figur 4H).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk av ekstracellulære fluksanalyser.
(A)Skjematisk glykose, trikarboksylsyresyklusen (TCA) og elektrontransportkjeden (ETC). Hemmere av forskjellige trinn er skrevet i rødt. Elektronfluksen i ETC er representert i grønt med NADH som donor og O2 som endelig akseptor. (B) Glykolyse stress test skjematisk profil som representerer ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) versus tid. (C) Mitokondriestresstestskjematisk profil som representerer oksygenforbruket (OCR) kontra tid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Naturlige Killer (NK) celler renset fra perifere mononukleære celler (PBMCer).
(A) Gating strategi fulgte for å vurdere renhet og levedyktighet av NK-celler (høyre kolonne) versus summen av PBMCer (venstre kolonne). Fra porten til mononukleære celler (topppaneler) ble enkeltceller valgt (midterste paneler) og levedyktighet ble målt (bunnpaneler). (B) Levende celler ble farget for CD3 og CD56 eller NKp46. Tallene i panelene angir prosentandelen av celler i de valgte områdene. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Optimalisering av mitokondrie- og glukosestresstestene i aktiverte menneskelige NK-celler.
(A)Mitokondriestresstest: OCR for hver platingtetthet (0,75 x 106,0,375 x 106,0,187 x 106,0,094 x 106 og 0,047 x 106). Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av 3 brønner med standardavvik. Resultatene er representative for 3 uavhengige eksperimenter. (B) DNA (øvre panel) og protein (nedre panel) nivåer i brønnen ved ulike plating tettheter. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av 3 brønner med standardavvik. Resultatene er representative for 3 uavhengige eksperimenter. (C) Rå oksygennivå spor i brønner som inneholder ingen celler (svart spor), 0,75 x 106 celler (blå spor) eller 1,5 x 106 celler (grønt spor). I det grønne sporet etter tilsetning av DNP er oksygen helt utarmet i hver syklus. (D)Den ekstra åndedrettskapasiteten på 0,75 x 106 celler ble testet i nærvær av flere DNP-konsentrasjoner. (E)Glykolyse Stress Test: ECAR for hver plating tetthet (0,75 x 106,0,375 x 106,0,187 x 106,0,094 x 106 og 0,047 x 106) vises. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av 3 brønner med standardavvik. Resultatene er representative for 3 uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Påvisning av metabolske endringer etter NK celleaktivering av IL-15.
Mitokondriestresstest: OCR (A) og ECAR (B) plott er vist for 0,75 x 106 hvile- eller IL-15 aktiverte celler. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av 3 brønner med standardavvik. Resultatene er representative for 5 uavhengige eksperimenter. Basal- og maximal respirasjonsendringer for individuell human donor er vist i (C), mens ATP-koblet respirasjon, protonlekkasje, ikke-mitokondrieånding (NMR) er vist i (D) og OCR/ECAR-forholdet vises i (E). Glykolyse Stresstest: ECAR (F) og OCR (G) plott er vist for 0,75 x 106 hvile- eller IL-15 aktiverte celler. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av 3 brønner med standardavvik. Resultatene er representative for 5 uavhengige eksperimenter. Basale og maksimale ekstracellulære forsuringsendringer for individuell human donor er vist i (H). ns: ikke signifikant; * p ˂ 0,05; ** p ˂ 0,01; i 1999 ble det ˂. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bidrag fra TCA og glykose på ECAR.
De første målingene av ECAR tilsvarer i stor grad forsuring på grunn av CO2 produsert i TCA-syklusen. Etter tilsetning av glukose til drivstoff glykose reduseres bidraget fra TCA-avledet forsuring til ECAR. Injeksjon av Antimycin A og Rotenone blokkerer TCA, og glykose kompenserer økningen i ATP etterspørsel ved å øke til sitt maksimale nivå (kompenserende glykose). Blokade av glykose av 2-DG reduserer ECAR til minimale nivåer, tilsvarende forsuring som ikke tilskrives glykose eller respiratorisk aktivitet, samt eventuell gjenværende glykolyse som ikke er fullt hemmet av 2-DG (post 2-DG-forsuring). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Reagent Konsentrasjon i arbeid Klone (for antistoffer) Endelig fargingsvolum
Mus anti-menneskelig CD3 BV711 50 ng/ml UCHT1 Gjestgiveri 100 μl
Mus anti-menneskelig CD56 PE 1/50 fortynning B159 Leilighet 100 μl
Mus anti-menneskelig NkP46 PE 1/50 fortynning 9/E2 100 μl
Levedyktighet Fargestoff 1/1000 fortynning 500 μl

Tabell 1: Reagenser og antistoffer som brukes til strømningscytometri.

Mitokondriestresstest
Port Volum Sammensatte 10x Lager Endelig konsentrasjon i analysen
A 20 μl oligomycin 10 μM 1 μM
B 22 μl Dnp 1 mM (andre personer) 0,1 mM
C 25 μl antimycin A + rotenon 10 μM hver 1 μM hver
Glykolyse Stress Test
Port Volum Sammensatte 10x Lager Endelig konsentrasjon i analysen
A 20 μl Glukose 100 mM 10 mM
B 22 μl antimycin A + rotenon 10 μM hver 1 μM hver
C 25 μl 2-DG Leilighet 500 mM 50 mM

Tabell 2: Sammensatt lasting.

Trinn Loop Gjenta (tider)
Blanding vent Måle
Kalibrering ––
Likevekt ––
Avlesninger ved baseline 3 minutter 0 minutter 3 minutter 3
Sluttsløyfe ––
Injiser port A ––
Målinger 3 minutter 0 minutter 3 minutter 3
Sluttsløyfe ––
Injiser port B ––
Målinger 3 minutter 0 minutter 3 minutter 3
Sluttsløyfe ––
Injiser port C ––
Målinger 3 minutter 0 minutter 3 minutter 3
Sluttsløyfe ––
Avslutt program ––

Tabell 3: Programoppsett.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papiret har vi etablert en protokoll for effektivt å isolere og kultivere rene og levedyktige primære menneskelige NK-celler fra perifert blod. Vi har også optimalisert betingelsene for måling av metabolsk aktivitet av disse NK-cellene vurdert av oksygenforbruk og ekstracellulær forsuring ved hjelp av en ekstracellulær fluksasanalysator. Sammenlignet med andre respirometriske metoder er den ekstracellulære fluksalysatoren rask, krever et lite antall celler og tillater screeninger med høy gjennomstrømming. Men, reagenser er dyre, og injeksjoner av forbindelser er begrenset til bare fire. Metabolsk remodeling og aktivering av glykose og oksidativ fosforylering av cytokiner i NK-celle er avgjørende for robuste NK-celleresponser21, og teknikkene som er beskrevet her, tillater studiet av metabolsk profil av NK-celler i sanntid. Denne protokollen kan utvides til celler aktivert av andre cytokiner, for eksempel IL-2, IL-12 og IL-18, eller antistoffer som binder seg til å aktivere reseptorer. Vi har adressert flere viktige trinn som ofte blir oversett, for eksempel plating cellene på optimal samløpet eller bruke den optimale konsentrasjonen av uncoupler for å stimulere maksimalt oksygenforbruk. Likevel anbefaler vi å sjekke de faktiske O2-nivåkurvene ( figur3C), hvis andre stimuli forskjellig fra IL-15 gis til cellene, for å sikre at O 2 ikke blir tømt ibrønnene. Hvis det var tilfelle, bør cellenummeret reduseres til et lineært O2-forbruk observeres for å forhindre en undervurdering av den virkelige OCR.

Basal respirasjon gjenspeiler cellens basale metabolske tilstand, som i stor grad kontrolleres av aktiviteten til mitokondrie-ATP-syntase8, og er en indikasjon på basal ATP-etterspørselen (for proteinsyntese, cytoskeletondynamikk, ATPaser som Na+/ K+-ATPase, etc). Vanligvis, i nærvær av tilstrekkelige substrater denne parameteren øker i metabolsk aktive eller stresset celler. Tillegg av oligomycin, som blokkerer ATP-syntase, avslører ATP-koblet respirasjon og protonlekkasje, som kan skje over lipid bilayer eller proteiner i den indre mitokondriemembranen, men kan også være induserbar gjennom proteiner som Uncoupling Proteins (UCPs)9, innblandet i reguleringen av adaptiv termotilblivelsen og dermed konvertere mitokondrieenergi potensial til å varme i brune adipocytes. Maksimal åndedrett bestemmes av faktorer som tilgjengeligheten av substrater for mitokondrie respiratorisk kjede og mengden og aktiviteten til respiratoriske komplekser. Mitokondrie respiratoriske komplekser og deres aktivitet kan også endres ved posttranslational modifikasjoner som acetylering eller fosforylering22,,23. Denne parameteren kan også indikere helsen til cellene og deres evne til å reagere på akutte fornærmelser. Under situasjoner med mitokondriedysfunksjon reduseres maksimal respirasjon, og dette begrenser cellens kapasitet til å reagere på endringer i ATP-etterspørsel og fører til celledød24.

Det er svært viktig å bemerke at for hvert tidspunkt av mitokondrie- og glykosestresstester, ECAR er summen av glykose-avledet forsuring (via generering av laktat + H+) og respiratorisk-avledet forsuring (via generering av CO2, som oppløses i H2O for å generere HCO3- og H+), og viktigst, respiratorisk-avledet forsuring kan utgjøre en betydelig andel av den totale ECAR i noen celletyper25. For interesserte forskere er det publiserte protokoller for å beregne faktiske glykolytiske priser. For dette formål kan oksygenforbruket under den glykolytiske stresstesten (figur 4G) brukes til å beregne protonproduksjonshastigheten ved respirasjon på hvert tidspunkt, og den verdien kan trekkes fra den totale produksjonen av proton, som oppnås ved hjelp av ECAR-verdier og bufferkraften til mediet7,,25,,26.

En viktig endring av denne protokollen sammenlignet med produsentens anbefaling er den andre injeksjonen av glykosestresstesten. Antimycin A og rotenon foretrekkes å oligomycin, av flere grunner som allerede erbeskrevet 7: 1) noen celler viser en høy glykolytisk kapasitet som fullt ut kan møte den basale ATP-etterspørselen i cellen, selv i fravær av oksidativ fosforylering; 2) blokkerer ETC med antimycin A og rotenon øker kunstig ATP-etterspørselen av cellen, da det forårsaker ATP hydrolyse av ATP-syntase (mitokondriene blir en ATP-vask), som reverserer for å pumpe protoner i et forsøk på å gjenopprette mitokondriemembranpotensialet som kollapser etter respiratorisk hemming; 3) blokkering av ETC forhindrer respirasjonsforsuring av mediet (respiratorisk CO2 generert i TCA-syklusen som omdannes til HCO3- og H+) som kan forvirre ECAR-resultatene. Dermed er observert maksimal ECAR med antimycin A og rotenon bare tilskrives glykose. Interessant, det har blitt rapportert at ECAR observert med respiratoriske hemmere alene kan fortsatt være submaximal 7 , og en ekstramekanismefor å øke cellulær ATP etterspørsel (og derfor maksimal ECAR) har blitt beskrevet: tillegg av ionophore monensin, som øker importen av Na+ inn i cellen27 og stimulerer frekvensen av ATP hydrolyse av plasmamembranen Na+/ K+-ATPase, til blandingen av antimycin A og rotenone7.

Et annet viktig konsept er at vi ikke anbefaler subtraksjon av ikke-glykolytisk forsuring, som sannsynligvis tilsvarer respiratoriske CO2 som omdannes til HCO3- og H+, fra hele sporet for å beregne glykolytiske parametere som anbefalt av produsenten, da dette beløpet endres betydelig i hvert trinn av Glycolysis Stress Test (det er høyest i basal tilstand, reduseres etter tilsetning av glukose på grunn avCrabtree-effekten 20, og er nesten avskaffet med antimycin A og rotenone) (figur 5).

For å oppsummere viser denne protokollen et enkelt og effektivt verktøy for å teste metabolsk aktivitet av menneskelige naturlige morderceller med en ekstracellulær fluksasanalysator. Denne metoden kan brukes til å avhøre metabolsk tilstand i disse cellene, som er kjent for å endre med celleaktivering ved cytokinstimulering eller under visse patologiske forhold, inkludert fedme, kreft eller virusinfeksjoner28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for støtte og diskusjon. Denne studien ble støttet av Intramural Research Programs av National Institutes of Health, National Cancer Institute og National Heart, Lung, and Blood Institute. JT støttes av Ramon y Cajal-programmet (stipend RYC2018-026050-I) av MICINN (Spania).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 160 Naturlige Killer celler metabolisme ekstracellulær fluks glycolyse mitokondrier åndedrett elektron transportkjede strømningscytometri
Analyse av human naturlig killer celle metabolisme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton,… More

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter