Bu yazıda, periferik kandan izole edilen primer insan Doğal Öldürücü (NK) hücrelerinde glikoliz ve mitokondriyal solunumu ölçmek için bir yöntem, istirahatte veya IL15 kaynaklı aktivasyonu takiben açıklıyoruz. Açıklanan protokol kolayca birincil insan NK hücreleri diğer sitokinler veya çözünür uyaranlar tarafından aktive genişletilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Doğal Killer (NK) hücreleri esas olarak doğuştan gelen anti-tümör ve anti-viral immün yanıtlar aracılık ve sağkalım teşvik etmek sitokinler ve diğer uyaranların çeşitli yanıt, hücresel çoğalma, interferon gama gibi sitokinlerin üretimi (IFNγ) ve / veya sitotoksisite programları. Sitokin stimülasyon ile NK hücre aktivasyonu onların biyoenerjik ve biyosentetik gereksinimlerini desteklemek için metabolik yolların önemli bir remodeling gerektirir. Bozulmuş NK hücre metabolizmasının obezite ve kanser de dahil olmak üzere kronik hastalıkların bir dizi ile ilişkili olduğunu düşündüren kanıtlar büyük bir vücut vardır, Hangi NK hücre metabolizmasını belirlemek için bir yöntemin kullanılabilirliğinin klinik önemini vurgulamaktadır. Burada, insan NK hücrelerinin enerji metabolizmasındaki değişiklikleri izlemek için bir araç olarak glikoliz ve mitokondriyal oksijen tüketiminin gerçek zamanlı ölçümlerine olanak tanıyan bir platform olan hücre dışı akı analizörü nün kullanımını açıklıyoruz. Burada açıklanan yöntem aynı zamanda il-15 gibi sitokinler ile NK hücrelerinin uyarılmasından sonra metabolik değişikliklerin izlenmesi için izin verir, şu anda klinik çalışmaların geniş bir yelpazede araştırılmaktadır bir sistem.
Giriş
Doğal Killer (NK) hücreleri anti-tümör ve anti-viral tepkiler aracılık doğuştan lenfositler vardır. NK hücreleri insan periferik kantüm lenfositlerin% 5-15'ini oluşturur, ve dalak bulunabilir, karaciğer, kemik iliği ve lenf düğümleri. NK hücreleri, T-hücre reseptörleri (TCR) veya B-hücre reseptörleri (BCR) gibi polimorfik klodik reseptörleri ifade etmez. Buna karşılık, onların sitolitik fonksiyonların aktivasyonu bir hedef hücre yüzeyinde değişken ligandlar tanımak reseptörlerinin katılımı ile istenir1,2.
Periferik kandan izole edilmiş istirahat insan NK hücreleri insan serumu ile d....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneyler Helsinki'nin etik tıbbi araştırma ilkelerine uygun olarak yapılmıştır. 99-CC-0168 IRB onaylı protokol kapsamında, hastaların yazılı bilgilendirilmiş onayı ile NIH Transfüzyon Tıbbı Bölümü'nden donörlerden periferik kan örnekleri alındı.
1. Reaktif hazırlama
-
NK hücrelerinin izolasyonu için reaktifler
NOTLAR: Bu reaktifleri hücre kültürü başlığında hazırlayın.- NK ayırma tamponu hazırlayın: Daha önce ısı yalıtımlı olan (30 dk için 56 °C'de) 1 mM EDTA ve %2 Fetal Baldır Serumu (FCS) ile Ek PBS (pH 7.4).
- NK kültür ortamı nı hazırlayın: Supplement Iscove'un %10 İnsan Serumu (HS) ile M....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
NK hücrelerinin periferik kandan izolasyonu saf ve canlı bir popülasyon sağlar
Hücre dışı akı teşpini kuyudaki H+ ve O2 konsantrasyonunun ölçümü ne dayanır ve farklı hücre popülasyonları veya canlılıkları arasında ayrım yapmaz. Bu nedenle, ilgi hücresinin son derece saf ve canlı bir nüfus elde etmek bu deneylerde başarılı olmak için önemli bir adım oldu.
NK hücrelerinin periferik kandan izolasyonu bölüm 2'de belirtildiği gibi g.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, saf ve canlı birincil insan NK hücrelerini periferik kandan verimli bir şekilde izole etmek ve elde etmek için bir protokol oluşturduk. Ayrıca, oksijen tüketimi ve hücre dışı asitleşme oranı ile değerlendirilen bu NK hücrelerinin metabolik aktivitesinin ölçümü için koşulları da ekstrasellüler akı analizörü kullanarak optimize ettik. Diğer solunum yöntemleri ile karşılaştırıldığında, hücre dışı akı analizörü hızlıdır, az sayıda hücre gerektirir ve yüksek iş akışı taramalarına olanak tanır. Ancak, reaktifler pah.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.
Teşekkürler
Yazarlar destek ve tartışma için Dr Michael N. Sack (Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü) teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Intramural Araştırma Programları tarafından desteklenmiştir. JT MICINN (İspanya) Ramon y Cajal programı (hibe RYC2018-026050-I) tarafından desteklenir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2-Deoksi-D-glikoz (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glikolür stres testi enjektör bileşiği |
| 2,4-Dinotrofenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC birleştirici / mitokondriyal stres testi enjektör bileşiği |
| 96 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası / Kapaklı Yuvarlak Alt | Costar | 3799 | NK hücre kültürü |
| Antimisin A | MilliporeSigma | A8674 | Kompleks III inhibitörü / glikoliz ve mitokondriyal stres testi enjektör bileşiği |
| BD FACSDIVA Yazılımı | BD Biosciences Akış | verisi toplama | |
| BD LSR Fortessa BD | Biosciences | Akış verisi toplama | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Hücre yapıştırıcısı |
| CyQUANT hücre proliferasyon testi | ThermoFisher Scientific | C7026 | DNA kantitasyonu için hücre proliferasyon testi. Hücre parçalama tamponu ve CyQUANT GR boya |
| içerir EasySep İnsan CD3 Pozitif Seçim Kiti II | Kök hücre teknolojileri | 17851 | PBMC'lerden NK hücre izolasyonu |
| EasySep İnsan NK hücre Zenginleştirme Kiti | Kök hücre teknolojileri | 19055 | PBMC'lerden NK hücre izolasyonu |
| EasySep Mıknatıs | Kök hücre teknolojileri | 18001 | PBMC'lerden NK hücre izolasyonu |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Kalite Biyolojik | 10128-446 | NK satış ayırma tamponu |
| FACS tüpleri | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Akış sitometrisi deneyi |
| Falcon 50 ml Konik tüpler | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK hücre ayırma |
| Fetal Buzağı Serumu (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK hücre ayırma tamponu |
| FlowJo Yazılımı | BD Biosciences | Akış verileri analizi | |
| Glikoz | MilliporeSigma | G8270 | Mitokondriyal stres testi ortamının bileşeni. Glikoliz stres testi enjektör bileşiği |
| Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli | ThermoFisher Scientific | 78429 | Proteaz inhibitörü 100X. RIPA lizis tamponunda kullanım |
| İnsan IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK hücre stimülasyonu |
| İnsan serumu (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK hücre kültürü ortamı takviyesi |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK hücresi kültür ortamı |
| L-Glutamin (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Stres testi ortamının bileşeni |
| CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti | ThermoFisher Scientific | L34965 | Akış sitometrisi boyama için canlılık boyası |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMC'lerin insan kanından ayrılması |
| Fare anti-insan CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T hücresi akış sitometrisi boyama |
| Fare anti-insan CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK akış sitometrisi boyama |
| Fare anti-insan NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK akış sitometrisi boyama |
| Oligomisin | MilliporeSigma | 75351 | Kompleks V inhibitörü / mitokondriyal stres testi enjektör bileşiği |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK hücresi ayırma tamponu |
| Pierce BCA Protein Test Kiti | ThermoFisher Scientific | 23225 | Protein konsantrasyonunun belirlenmesi için |
| RIPA Tamponu | Boston BioProducts | BP-115 | Hücre lizisi |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Kompleks II inhibitörü / glikoliz ve mitokondriyal stres testi enjektör bileşiği |
| Denizatı Dalga Kontrol Cihazı Yazılımı | Agilent | Denizatı XFe96 Analizörü için Kontrolör | |
| Denizatı Dalga Masaüstü Yazılımı | Agilent | Veri analizi için | |
| Denizatı XF Temel Orta | Agilent | 102353-100 | Hücre Dışı Akı tahlili baz ortamı |
| Denizatı XFe96 Analizörü | Agilent | Hücre Dışı Akı Analizörü | |
| Denizatı XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 20 XF96 hücre kültürü plakası, 18 XFe96 sensör kartuşu, bileşikleri tahlil kartuşuna aktarmak için yükleme kılavuzları ve 1 şişe kalibrant çözeltisi (500 ml) içerir. |
| Sodyum bikarbonat | MilliporeSigma | S5761 | Cell-Tak çözeltisini hazırlamak için |
| Sodyum piruvat (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Mitokondriyal stres testi ortamının bileşeni |
Kaynaklar
- Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
