Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/61466
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

Bu yazıda, periferik kandan izole edilen primer insan Doğal Öldürücü (NK) hücrelerinde glikoliz ve mitokondriyal solunumu ölçmek için bir yöntem, istirahatte veya IL15 kaynaklı aktivasyonu takiben açıklıyoruz. Açıklanan protokol kolayca birincil insan NK hücreleri diğer sitokinler veya çözünür uyaranlar tarafından aktive genişletilebilir.

Abstract

Doğal Killer (NK) hücreleri esas olarak doğuştan gelen anti-tümör ve anti-viral immün yanıtlar aracılık ve sağkalım teşvik etmek sitokinler ve diğer uyaranların çeşitli yanıt, hücresel çoğalma, interferon gama gibi sitokinlerin üretimi (IFNγ) ve / veya sitotoksisite programları. Sitokin stimülasyon ile NK hücre aktivasyonu onların biyoenerjik ve biyosentetik gereksinimlerini desteklemek için metabolik yolların önemli bir remodeling gerektirir. Bozulmuş NK hücre metabolizmasının obezite ve kanser de dahil olmak üzere kronik hastalıkların bir dizi ile ilişkili olduğunu düşündüren kanıtlar büyük bir vücut vardır, Hangi NK hücre metabolizmasını belirlemek için bir yöntemin kullanılabilirliğinin klinik önemini vurgulamaktadır. Burada, insan NK hücrelerinin enerji metabolizmasındaki değişiklikleri izlemek için bir araç olarak glikoliz ve mitokondriyal oksijen tüketiminin gerçek zamanlı ölçümlerine olanak tanıyan bir platform olan hücre dışı akı analizörü nün kullanımını açıklıyoruz. Burada açıklanan yöntem aynı zamanda il-15 gibi sitokinler ile NK hücrelerinin uyarılmasından sonra metabolik değişikliklerin izlenmesi için izin verir, şu anda klinik çalışmaların geniş bir yelpazede araştırılmaktadır bir sistem.

Introduction

Doğal Killer (NK) hücreleri anti-tümör ve anti-viral tepkiler aracılık doğuştan lenfositler vardır. NK hücreleri insan periferik kantüm lenfositlerin% 5-15'ini oluşturur, ve dalak bulunabilir, karaciğer, kemik iliği ve lenf düğümleri. NK hücreleri, T-hücre reseptörleri (TCR) veya B-hücre reseptörleri (BCR) gibi polimorfik klodik reseptörleri ifade etmez. Buna karşılık, onların sitolitik fonksiyonların aktivasyonu bir hedef hücre yüzeyinde değişken ligandlar tanımak reseptörlerinin katılımı ile istenir1,2.

Periferik kandan izole edilmiş istirahat insan NK hücreleri insan serumu ile desteklenen kültür ortamında birkaç gün hayatta kalabilir. IL-15 veya IL-2 gibi sitokinler tarafından NK hücrelerinin aktivasyonu çoğalması ve öldürme yeteneğinin bir artış için hücreleri sürücüler, diğer etkileri arasında3,4,5. Çeşitli çalışmalar NK hücre aktivasyonu ve metabolik aktivite değişiklikleri arasında doğrudan bir korelasyon göstermiştir6. Bu metabolik değişiklikler enerji ve biyosentez açısından hücrelerin özel gereksinimlerini karşılamak için mukadder.

Aerobik hücreler ve organizmalar katabolizma ve karbonhidrat, yağ ve proteinlerin oksidasyon içeren kimyasal reaksiyonlar bir dizi yoluyla enerji elde. Glikoliz, trikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve oksidatif fosforilasyon kombinasyonu sayesinde ökaryotik hücreler ATP talebinin büyük bir kısmını karşılar ve hücre büyümesi ve çoğalması için gerekli olan makromoleküller için yapı taşları olarak gerekli ara ları elde ederler. Glikoli (Şekil 1A) hücreye glikoz girişi ile başlar. Sitosolda glikoz fosforilasyona ve pirüvatöre dönüştürülür (glukoz molekülü başına 2 kat atp net üretimi ile), laktat indirgenebilir veya asetil-CoA'ya dönüştürülmek üzere mitokondriye taşınabilir ve TCA döngüsüne girer. TCA döngüsü asetil-CoA daha molekülleri ile yakıt lı bisiklet devam ediyor ve CO2 üretir (sonunda hücre dışında yayılır ve, orta H2O ile tepki vererek, orta asitleşme yol açacaktır karbonik asit üretecek) ve NADH, elektron taşıma zincirine elektron bağışı sorumlu molekül (ETC). Elektronlar farklı protein kompleksleri ile seyahat ve nihayet oksijen tarafından kabul edilir. Bu kompleksler (I, III ve IV) mitokondriyal matristen membranlar arası uzaya H+ pompalar. Üretilen elektrokimyasal degradenin bir sonucu olarak, H+ karmaşık V (ATP-synthase) aracılığıyla matristekrar girecek, POTANSIYEL enerji ATP üretimi içine birikmiş yatırım.

Hem glikoliz hem de mitokondriyal solunum inhibitörleri kullanılarak farklı noktalarda engellenebilir. Bu inhibitörlerin bilgisi ve kullanımı hücre dışı akı testinin geliştirilmesinin temelini oluşturmuştur. Hücre dışı akı analizörü, pH ve oksijen gibi iki basit parametreyi gerçek zamanlı olarak ölçerek glikoliz ve mitokondriyal solunum oranını 96 kuyulu bir plakada algılar. Glikoliz stres testi glikozsuz bazal bir ortamda yapılır (Şekil 1B)7. Hücre dışı asitleşme hızının (ECAR) ilk ölçümleri glikoliden bağımsız asitleşmenin göstergesidir. Glikolitik olmayan asitleşme olarak adlandırılır ve TCA tarafından üretilen CO2 ile ilişkilidir ve daha önce de açıklandığı gibi, H+ (TCA'ya bağlı ECAR) üretmek için ortamda H2O ile birleşir. İlk enjeksiyon glikoz kullanımını teşvik etmek ve glikoli artırmak için glikoz olduğunu. İkinci enjeksiyon her iki rotenon birleştirir, karmaşık bir I inhibitörü, ve antimisin A, Kompleks III inhibitörü birlikte, ETC hücreleri hücresel ATP düzeylerini korumak için glikoliz aktive ederek mitokondriyal ATP üretiminde bu dramatik azalmaya yanıt, ve bu bazal durumda hücre tarafından kullanılmayan glikoliz miktarını temsil eder ama potansiyel ATP talep artışlara yanıt olarak işe olabilir (compens compentory glycos). Üçüncü enjeksiyon glukoz analog udur 2-Deoksiglukoz (DG), hangi enzim hekkokinaz için bir substrat olarak glikoz ile rekabet. Bu fosforilasyonun ürünü olan 2-deoksiglukoz-6-fosfat pirüvata dönüştürülemez ve bu nedenle glikoliz bloke edilir ve bu da ECAR'ı minimuma indirir. Bu noktada ölçülen ECAR glikoliz veya solunum aktivitesi ne kadar az kalıntı glikoliz tam olarak 2-DG tarafından inhibe olmayan diğer ekstrasellüler asitleşme kaynaklarını içerir (post 2-DG-asitleşme).

Mitokondriyal stres testi glikozlu bir ortamda yapılır (Şekil 1C)8. Oksijen tüketim hızının (OCR) ilk ölçümleri mitokondriyal solunumun (bazal solunum) taban çizgisine karşılık gelir. İlk enjeksiyon, ATP synthase (kompleks V) yoluyla protonların dönüşünü engelleyen, ATP sentezini engelleyen ve böylece solunum kompleksleri yoluyla daha fazla proton pompalanmasını önleyen mitokondriyal membranı hızla hiperpolarize eden ve OCR'de azalmaya yol açan oligomisindir. Temel solunum ile oligomisin ilavesi ile verilen değer arasındaki karşılaştırma ATP'ye bağlı solunumu temsil eder. Oksijen tüketiminin kalan oligomisin duyarsız oranı proton sızıntısı denir, hangi adenin nükleotid translocase gibi iç mitokondriyal membran lipid bilayer veya proteinler yoluyla proton akışını temsil eder9. İkinci enjeksiyon uncoupler 2,4-dinitrofenol (DNP), mitokondriyal matriks içine H+ büyük bir giriş indükler bir iyonofor, mitokondriyal membran depolarizasyon ve mitokondriyal ATP sentezinin bozulmasına yol açar. Hücreler membran potansiyelini (maksimal solunum kapasitesi) kurtarmak için beyhude bir girişim de elektron taşıma ve oksijen tüketimi oranını maksimum seviyelere artırarak proton-güdük kuvvetin dağılmasına yanıt verir. Maksimal solunum kapasitesi ve bazal solunum arasındaki fark hücrenin yedek solunum kapasitesi, bazal durumda ATP üretmek için hücre tarafından kullanılmayan solunum miktarını temsil eder ama potansiyel OLARAK ATP talebi artışlara yanıt olarak işe olabilir8. Üçüncü enjeksiyon rotenon ve antimisin A bir kombinasyonudur. Bu enjeksiyon ETC'yi tamamen durdurur ve OCR en düşük seviyesine iner, kalan oksijen tüketimi mitokondriyal değildir (NADPH-oksidazların neden olduğu vb.).

Metabolik yollardaki değişiklikler bir şekilde NK hücrelerinin işleyişini tahmin edebilir, bu in vitro sitokinler ile NK hücrelerinin sürekli aktivasyonu farklı metabolik yollar 10 çalışma ile NK hücre yorgunluğu yol açabileceği ileri sürülmüştür10,11. NK hücremetabolik durumu ve fonksiyonu arasındaki korelasyon kanser immünoterapisi açısından çok önemlidir. Bu alanda, IL-15 infüzyonu ile NK hücrelerinin aktivasyonu, tek başına veya monoklonal terapötik antikorlar ile birlikte tümör hücre öldürme geliştirmek için test edilmiştir12,13,14. Bu tedavi stratejilerine yanıt olarak NK hücrelerinin metabolik durumunun bilinmesi, NK hücre aktivasyon durumunun ve öldürme fonksiyonunun değerli bir belirleyicisini sağlayacaktır.

Monosit, T ve B hücreleri gibi diğer miyeloid ve lenfoid hücrelerde metabolik yolların çalışması15 tanımlanmış ve optimize edilmiş yöntemler16olarak yayınlanmıştır. Bu protokolde, hem yüksek sayıda saf ve canlı NK hücresi sağlayan bir NK izolasyon protokolünü hem de hücre dışı akı analizörü kullanarak metabolik aktiviteyi ölçmek için optimize edilmiş bir protokolü birleştiren bir yöntem salıyoruz. Burada bu istirahat ve IL-15 aktif insan NK hücrelerinde metabolik değişikliklerin çalışması için geçerli bir yöntem olduğunu göstermektedir. Hücre dışı akı testi için, hücre numarası ve ilaç konsantrasyonları gibi parametreler test edilmiş ve optimize edilmiştir. Diğer solunum yöntemi ile karşılaştırıldığında, ekstrasellüler akı analizörü tam otomatik ve gerçek zamanlı olarak test etmek mümkün, hücrelerin çok düşük miktarlarda, aynı anda 92 örnek, ve böylece nispeten hızlı bir şekilde yüksek iş çıkışları taramaları sağlar (birden fazla örnek ve çoğaltmalar ile)17.

Bu yöntem NK hücre metabolizması inceleyerek NK hücre fonksiyonunu değerlendirmek isteyen araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Diğer sitokinler, antikorlar veya çözünür uyaranlar tarafından aktive edilen hücrelere de uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler Helsinki'nin etik tıbbi araştırma ilkelerine uygun olarak yapılmıştır. 99-CC-0168 IRB onaylı protokol kapsamında, hastaların yazılı bilgilendirilmiş onayı ile NIH Transfüzyon Tıbbı Bölümü'nden donörlerden periferik kan örnekleri alındı.

1. Reaktif hazırlama

  1. NK hücrelerinin izolasyonu için reaktifler
    NOTLAR: Bu reaktifleri hücre kültürü başlığında hazırlayın.
    1. NK ayırma tamponu hazırlayın: Daha önce ısı yalıtımlı olan (30 dk için 56 °C'de) 1 mM EDTA ve %2 Fetal Baldır Serumu (FCS) ile Ek PBS (pH 7.4).
    2. NK kültür ortamı nı hazırlayın: Supplement Iscove'un %10 İnsan Serumu (HS) ile Modifiye Dulbecco's Media (IMDM). Steril filtre ve 2-8 °C'de saklayabilirsiniz. Hücrelere eklemeden önce orta yı 37 °C'ye ısıtın.
    3. PBS'de Human IL-15'i 200 μg/mL'de yeniden askıya alın.
  2. Hücre dışı akı tonu için reaktifler
    1. Test ortamı hazırlayın: Mitokondriyal stres testi ortamı için, baz ortama 1 mM sodyum pirüuvat, 2 mM L-glutamin ve 10 mM glikoz ekleyin; glikoliz stres testi ortamı için, baz ortama 2 mM L-glutamin ekleyin.
      NOT: Glikoz, pirüvat ve glutamin konsantrasyonları hücre dışı akı analizörü üreticisi tarafından tavsiye edilen şekilde sağlanır. Ancak, medya kompozisyonu, istenirse kültür ortamınınkiyle mükemmel bir şekilde eşleşecek şekilde araştırmacılar tarafından değiştirilebilir.
    2. Tezgah üstü pH metre, steril filtre 0,2 μM gözenek boyutu ve 2-8 °C'de depolamak kullanarak 0,1 N NaOH ile her iki ortamın pH'ını 7,4'e ayarlayın. 37 °C'ye kadar sıcak ortam, pH'ı kontrol edin ve gerekirse kullanmadan önce 7.4'e kadar hazırlanın.
      NOT: Hücre dışı akı analizörünün atmosferinde sadece ortam CO2 bulunursa, bikarbonatsız ortam kullanımı çok önemlidir.
    3. Reaktifler için stok çözümleri hazırlayın: Oligomisin (ATP synthase inhibitörü), DMSO'da 10 mM stok çözeltisi; 2,4-dinitrofenol (DNP, uncoupler), DMSO'da 1 M stok çözeltisi; antimisin A (kompleks III inhibitör), DMSO'da 10 mM stok çözeltisi; rotenone (kompleks I inhibitörü), DMSO'da 10 mM stok çözeltisi. Tüm reaktiflerden 30 μL aliquot yapın ve -20 °C'de saklayın.
      NOT: Bu yönergeler, bireysel olarak satın alınan ve araştırmacı tarafından hazırlanan reaktifler için tasarlanmıştır. Reaktifler bunun yerine analizör üreticisinden satın alınmışsa, reaktif hazırlama yönergelerine uyun.

2. NK hücrelerinin periferik kandan izolasyonu

  1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) insan kanında hazırlık
    NOT: Bu adımları hücre kültürü başlığında gerçekleştirin. Kanla temas eden tüm kalıntıları ve malzemeleri çamaşır suyu yla dezenfekte edin ve yakmak için uygun kabın içine atın.
    1. 50 mL konik tüp içine Lenfosit Ayırma Ortamı (LSM) Pipet 20 mL.
    2. Tüpü 30° açıda tutarken, lsm üzerinde 20 mL kan pipeti, çok nazikçe ve tüp duvarına dokunarak dikkatli olun. LSM ile kanın karışmasını önlemek ve iki sıvı arasında görünür ve iyi tanımlanmış bir interfaz oluşturmak.
      NOT: Periferik kan veya zenginleştirilmiş leukapheresis ürünleri kullanılabilir.
    3. Tüpleri oda sıcaklığında 25 dk, 1000 x g santrifüj edin. Tüp (LSM ve kan) karışımı her iki faz yapabilir gibi fren kullanmayın.
    4. Dikkatle santrifüj tüpleri çıkarmak ve bir rafa yerleştirin. LSM (açık) ve plazma (sarı) arasındaki interfazda oluşacak dikkat çekici bir hücre tabakasının (mononükleer hücreler) varlığını kontrol edin, tüpün alt kısmında kırmızı kan hücreleri pelet ise.
    5. Mononükleer hücre tabakasını 10 mL plastik pipetle (yaklaşık 5-8 mL) hafifçe aspire edin ve yeni bir 50 mL konik tüpe yerleştirin. 2 farklı tüpün lenfosit interfazı bir araya getirilebilir.
    6. Mononükleer hücreleri 45 mL PBS'de yeniden suyararak ve oda sıcaklığında 800 x g'de 5 dk santrifüj ederek 2 kat yıkayın.
      NOT: Bu adımdan sonra periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMCs) bir pelet elde edilir ve araştırmacı NK izolasyon adımına devam edebilir.
  2. PBMC'lerden NK yalıtımı
    1. Hücreleri 2.1.6'dan sayın ve NK Ayırma Arabelleği'nde (1x 108 PBMCs/mL) yeniden askıya alın.
    2. Hücre süspansiyonunun 10 mL'sini (109 PBMC) alın ve 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    3. 500 μL (50 μL/mL tampon) NK hücre izolasyonu antikor karışımı ve 10 μL (1 μL/ mL tampon) anti-CD3 pozitif izolasyon antibody karışımını PBMC'lere ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
    4. Manyetik boncukları girdap ve antikor (100 μL boncuk/ml PBMC) ile PBMCs karışımına 1 mL ekleyin. Ara sıra karıştırarak oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
    5. 35 mL NK izolasyon tampon (3,5 ml tampon/ml PBMCs) ekleyin, 15 dakika (2,2 x 107 PBMCs/mL) için mıknatısın üzerine karıştırın ve yerleştirin. Bu süre sonunda, boncuklar ve hücreler olumlu seçilmiş (tüm ama NK hücreleri) tüp duvarlarına yapışmış olacaktır.
    6. Tüpün kenarlarına veya dibine dokunmadan 50 mL plastik pipetle süpernatantı (NK hücreleri içeren) dikkatlice toplayın.
    7. Hücreleri hücre sayacı ve santrifüj kullanarak 5 dk 800 x g olarak sayın.
    8. IMDM'de %10 HS içeren 5 x 106 hücre/mL'de izole Edilmiş NK hücrelerini yeniden askıya alın ve deney yapılana kadar %5 CO2 ile 37 °C'de bir kuvöze yerleştirin.
      NOT: Bu NK yalıtım protokolü, 50 mL'lik bir tüp ve büyük bir mıknatısın kullanımına uyarlanmış hücre numaralarını ve reaktif hacimlerini belirtir. Bu protokol, farklı tüplerdeki izolasyon adımlarını tekrarlayarak (daha fazla PBMC elde edilmesi durumunda) büyütülebilir veya tüpteki hacmi azaltarak küçültülebilir. 14-45 mL son hacimlerde 50 mL polistiren tüp kullanılır, 4-14 ciltler için 15 mL polistiren tüp, 1-4 mL hacimler için 5 mL polistiren tüp kullanılır. Mıknatıs farklı ve her durumda uygun tüp uygun. Antikor karışımı ve manyetik boncuk miktarı da hücre sayısıve son hacmine göre ölçeklenebilir.
  3. Akış sitometrisi için NK hücre popülasyonu boyama
    1. Adım 2.2.8'den numune başına 0.25 x 106 hücre alın, oda sıcaklığında 5 dk için 800 x g'de santrifüj ederek ortayı çıkarın ve hücre peletini 500 μL PBS'de yeniden askıya alın.
    2. Üreticinin tavsiyesine göre canlıboya (1 mL hücre resuspension'ya 1 μL DMSO yeniden yapılandırılmış boya) ve 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
    3. 5 mL PBS'de yeniden suyararak 2 kat yıkayın ve oda sıcaklığında 800 x g'de 5 dk santrifüj edin.
    4. Işıktan korunan buz üzerinde 30 dk için %10 HS içeren 100 μL IMDM'deki ilgili anti-insan antikorları ile lekelenmiştir (Bkz. Tablo 1). Tüm antikorlar kombine edilebilir ve tek bir boyama adımda kullanılır.
    5. Elde edilen NK hücre popülasyonunun saflığını değerlendirmek için örnekleri akış sitometrisi ile analiz edin. Daha önce18,19açıklanan hücre gating ve analiz yöntemini kullanın.
  4. Çözünür IL-15 ile NK hücreleri stimülasyonu
    1. 96 iyi plakalı (yuvarlak alt) kuyuda %10 HS içeren IMDM'nin 100 μL'sinde 2,2,8 veya 2,4,3 adımlarından 0,75 x 106 hücreyi yeniden askıya alın.
    2. %10 HS içeren IMDM'de insan IL-15 ila 1 μg/mL seyreltin. 0.5 g/mL nihai konsantrasyonulaşmak için hücrelere seyreltilmiş insan IL-15 100 μL ekleyin.
      NOT: 0.5 μg/mL IL-15 doyurici bir konsantrasyondur. IL-15 veya IL-2, IL-12 veya IL-18 gibi diğer sitokinlerin daha düşük konsantrasyonları istenirse araştırmacılar tarafından test edilebilir.
    3. Hücreleri 37 °C'de kuvöze yerleştirin ve hücre dışı akı teşbitini yapmadan önce 48 saat süreyle uyarın. IL-15 olmadan %10 HS içeren IMDM'de aynı konsantrasyon ve hacimdeki uyarılmamış (kontrol) hücreleri yeniden askıya alın ve 48 saat boyunca aynı kuvöze yerleştirin.

3. Sensör kartuşunun hidrasyonu

NOT: Sensör kartuşu'nun 96 prob ucu,O 2 ve pH değişikliklerini tespit etmek için sulu olması gereken O2 ve H+ için ayrı ayrı katı hal floroforları içerir.

  1. Analizörü açın ve 37 °C'ye kadar ısıtın.
  2. Sensör kartuş paketini açın ve sensör kartuşunu yardımcı plakadan ayırın. Yardımcı plakanın her kuyusuna 200 μL'lik kalibr çözeltisi ekleyin ve sensör kartuşu plakaüzerine geri türün, sensörlerin çözeltiye tamamen batırılmış olduğunu doğrulayın. Optimum sonuçlar için kartuş bir gecede 37 °C'de bir CO2-buharlaşmayı önlemek için düzgün nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın. Hidrasyon sırasında sensörler altında kabarcık oluşumunu önleyin.
    NOT: En az kartuş hidrasyon süresi CO2-serbest inkübatörde 37 °C'de 4 saattir. Alternatif olarak, sensör kartuşunun bir gecede nemlendirmesi ile 37 °C'de 200 μL steril su ile CO2-serbest inkübatörde, ardından sensör kartuşunun 200 μL önceden ısıtılmış kalibrant çözeltisi 45 - 60 dk ile inkübasyonu kullanılabilir.

4. Hücre dışı akı tonu

  1. Yapışkan kaplı plakaların hazırlanması
    NOT: Metabolik parametrelerin ölçümü 96-well-assay plakasının alt kısmında oluşan bir mikrohaznasyonda gerçekleştiği için, süspansiyon hücreleri öncelikle kuyunun dibine yapıştırılmalıdır. Midye Mytilus edulis çıkarılan bir hücre yapıştırıcı istihdam edilmektedir. Hücre yapıştırıcısının üreticisi 1 ila 5 g/cm2arasında bir kaplama konsantrasyonu önerir. Analizör hücre kültürü mikroplaka sının kuyusu yaklaşık 0.110 cm2'likbir yüzeye sahiptir. Bu nedenle, 5 μg/cm2 konsantrasyon için yaklaşık 0,55 g yapıştırıcı gereklidir. Her kuyuyu kaplamak için yapışkan çözeltinin 25 0L'si kullanılacağından, analizör hücre kültürü mikroplakaları için en uygun yapışkan çözelti konsantrasyonu 22,4 μg/mL (22,4 μg/mL x 0,025 mL = 0,56 μg) civarındadır.
    1. 0,1 M sodyum bikarbonat, pH 8.0 hücre yapışkan çözeltisi (22,4 μg/mL) 2,5 mL hazırlayın. Bikarbonat, üreticiye göre 6,5 ile 8,0 arasında olan hücre yapışma performansı için optimum pH sağlar.
    2. Pipet 25 μL hücre yapışkan çözeltisi her kuyuya ispon plaka ve 20 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra çözeltiyi çıkarın ve 200 μL steril su/kuyu ile 2kat yıkayın. Bir hücre kültürü başlık içinde 15 dakika açık plaka tutarak kuyular kuruolsun.
      NOT: Kaplamalı plakalar 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
  2. Yapıştırıcı ile kaplanmış tabaklarda hücre tohumlama
    1. Oda sıcaklığında 5 dk için 200 x g adım 2.4.3 santrifüj hücreleri. Isınmış mitokondriyal stres testi ortamı (mitokondriyal stres testi yapılıyorsa) veya glikoliz stres testi ortamı (glikoliz stres testi yapılıyorsa) süpernatantları çıkarın ve hücreleri yıkayın. Pelet hücreleri tekrar ve aynı ortamda tercih edilen hücre konsantrasyonuna geri askıya (resuspension hacmi seçilen hücre konsantrasyonuna bağlıdır; her kuyu hücre süspansiyon180 μL içerecektir beri, hazırlamak 0.26 x 106, 0.52 x 106, 1.04 x 106, 2.08 x 106, 4.17 x 106 ve 8.33 x 106 hücre süspansiyonları için 0 047 x 106, 0.094 x 106,0.187 x 106, 0.375 x 106, 0.75 x 106 ve 1. 5 x 106 hücreleri sırasıyla).
    2. Plaka 180 μL hücre süspansiyon her kuyunun yan boyunca iyi başına. Çok kanallı bir pipet önerilir. Arka plan düzeltmeiçin kontrol kuyuları olarak analizör kültür plakası A1, A12, H1 ve H12 kuyularını kullanın. Bu kuyulara 180 μL'lik bir araştırma ortamı ekleyin (hücre yok). İstenirse ve plakada yeterli alan varsa ek kontrol kuyuları kullanılabilir.
      NOT: Serumun varlığı hücre ekinin zayıfbulunmasına neden olabilir.
    3. 37 °C'de 30 dakika boyunca co2-serbest kuluçka makinesinde plakayı kuluçkaya yatırın. Bu arada 10x bileşikleri hazırlayın (aşağıdaki adım 4.3'e bakın).
    4. Santrifüj ayarlarını sıfır frenleme ile değiştirin. 5 dk için 200 x g plaka santrifüj. Mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin ve kuyunun dibinde bir monokat oluşturamayacaklarını kontrol edin. Plakaları 25 dakika boyunca CO2-freeinkübatöre geri aktarın. En iyi sonuçlar için, kaplamadan sonra toplam süre yaklaşık 1 saat daha fazla olmamalıdır.
  3. Sensör kartuşuna yüklemek için 10x çalışma çözümlerinin hazırlanması
    NOT: Sensör kartuşunun 96 prob ipucunun her biri, bileşikleri tek tek kuyulara sırayla enjekte etmek için kullanılabilecek 4 bağlantı noktası (A, B, C ve D) barındırır.
    1. Mitokondriyal stres testi yapmak için, mitokondriyal stres testi orta sında 10 μM oligomisin, 1 mM DNP ve 10 μM rotenone ve 10 μM antimisin A karışımının 2,5 mL'sini hazırlayın (1.2.3 adımdaki stok çözeltilerini kullanın). Enjeksiyon sonrası kuyudaki son konsantrasyonlar 1 μM oligomisin, 0.1 mM DNP ve 1 μM antimisin A/rotenon olacaktır.
    2. Glikoliz stres testi yapmak için, glikoliz stres testi orta sında 10 μM rotenon ve 10 μM antimisin A karışımının 2,5 mL'sini hazırlayın (1.2.3 adımdaki stok çözeltilerini kullanın). 500 mM çözeltisi için glikoliz stres test ortamındaki glikozu 100 mM çözeltisi ve 500 mM çözeltiiçin glikoliz stres testi ortasında 2-deoksi-glukoz (2-DG) için çözün. Enjeksiyon sonrası kuyudaki son konsantrasyonlar 10 mM glukoz, 1 μM antimisin A/rotenon ve 50 mM 2-DG olacaktır.
    3. 37 °C'ye sıcak çözeltiler, pH'ı kontrol edin ve gerekirse 7.4'e kadar hazırlanın. 4.3.1 adımda hazırlanan yük bileşikleri. (mitokondriyal stres testi için) veya 4.3.2 (glikoliz stres testi için) sulu sensör kartuşunun A, B ve C bağlantı noktalarına (3.2 adımdan) çok kanallı bir mikropipet ve kartuşla birlikte sağlanan bağlantı noktası yükleme kılavuzları kullanılarak Tablo 2'degösterildiği gibi .
      NOT: Tsur sırasında tüm kuyularda uygun enjeksiyon sağlamak için, kullanılan her bir bağlantı noktası serisi (örn. tüm bağlantı noktaları A) tüm sensör kartuşunda aynı enjeksiyon hacmini içermelidir. Bu, arka plan düzeltme kuyuları ve hatta deneyde kullanılmayan kuyular için geçerlidir.
    4. Programı kurarken yüklü sensör kartuşu co2-free inkübatöriçinde 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  4. Hücre dışı akı test protokollerinin ayarlanması
    1. Hücre dışı akı çözümleyicisi yazılımını açın ve Grup Tanımları ve Plaka Haritası sekmelerini kullanarak benzer koşullara sahip kuyu gruplarını (örneğin, aynı sayıda hücreye sahip kuyular veya dinlenen hücreler veya IL-15 uyarılmış hücrelere sahip kuyular) gösterir. Ayrıca, arka plan düzeltme kuyuları (varsayılan olarak A1, A12, H1 ve H12 ayarlanır, ancak ek kuyular kullanılabilir) ve boş kuyular belirtin.
    2. Protokol sekmesini kullanarak yazılımda Tablo 3'te açıklanan programı ayarlayın.
    3. Programı Çalıştır Yayın sekmesini kullanarak başlatın. Sensör kartuşu (sulu ve 10x bileşikleri ile yüklü) ve yardımcı plaka tepsi üzerine yerleştirin. Kalibrasyon adımından (15 – 20 dk) sonra, istendiğinde, asayplakasının kalıtım plakasını (kapaksız) ekli hücrelerle değiştirin. Bundan sonra, çalışma tam otomatiktir (makine tüm ölçümleri ve enjeksiyonları gerçekleştirecektir).
      NOT: Belirli bileşikler uygun limanlara yüklendiği sürece (oligomisin, DNP ve a portlarında antimisin/rotenon) aynı plakada mitokondriyal stres testi ve glikolitik stres testi yapmak mümkündür. Mitokondriyal stres testinin yapıldığı kuyuların B ve C'si; glukoz, antimisin/rotenone ve 2-DG bağlantı noktalarında sırasıyla A, B ve C limanlarında glikoliz stres testinin yapıldığı kuyular), her test için her bir bağlantı noktası ve kuyu için aynı hacimler, yazılımın Grup Tanımları ve Plaka Haritası sekmeleri kullanılarak doğru bir şekilde tanımlanır.
    4. Çalıştırmatamamlandıktan sonra, verileri alın ve yazılımı kullanarak analiz edin.

5. Hücre numarası belirleme

NOT: Sonuçlar, hücre numarasındaki olası farklılıkları hesaba katmak için normale döndürülebilir. Aşağıda açıklanan iki ana yaklaşım kullanılabilir.

  1. DNA içeriği nin belirlenmesi
    1. Kalan ispon ortamını her kuyudan bir pipetle çıkarın. Ne zaman ortam aspirating, hücreleri rahatsız etmemeye dikkat edin. Plaka analiz edilene kadar -20 °C'de saklanabilir.
      NOT: Donma adımı etkin hücre likve DNA içeriği nin belirlenmesi için önemlidir.
    2. Distile suda (200 μL/kuyu) hücre proliferasyonu araştırma hücresi-lysis tampon (20x) 1x çözeltisi hazırlayın.
    3. Hücre çoğalması 1x hücre-lizis arabelleği içine hücre çoğalma asastok çözeltisi (400x) ekleyin. Kuyu başına 50 ila 50.000 hücre tespiti için, 1x hücre çoğalma tsay boya kullanın. Daha yüksek hücre sayıları için, 1x daha yüksek bir son konsantrasyonda hücre çoğalması tahlil boya sı kullanılması tavsiye edilir. Bu durumda, hücre proliferasyon tahlil boyası 5x son konsantrasyonda kullanın (1x hücre-lizis tampon içine hücre proliferasyon tahlil stok çözeltisi 80 kat seyreltmek).
    4. Her kuyuya hücre proliferasyonu namına 200 μL'lik bir asareni ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 2-5 dk kuluçkaya yatırın. Işıktan koruyun.
    5. Uyarma sırasında numunelerin floresansını ölçün: 480 nm; emisyon: 520 nm üreticinin önerilerine göre bir floresan mikroplaka okuyucu kullanarak.
  2. Protein içeriği nin belirlenmesi
    1. Dikkatlice, hücrelere dokunmadan her kuyudan tamamen aspirasyon orta ve en az 1 saat için -20 °C'de hücreleri dondurmak. Alternatif olarak, analiz yapılana kadar hücreler daha uzun süre (1 haftaya kadar) dondurulabilir.
    2. Her kuyuya 1x proteaz inhibitörleri (100x stok çözeltisinden) ile takviye edilmiş 50 μL radyoimmünopreyağış tadı (RIPA) lysis ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir shaker üzerine plaka yerleştirin ve sonra tam bir hücre lisis için 30 dakika buz üzerinde plaka kuluçka.
    3. Oda sıcaklığında 200 x g'da 5 dk için plakayı santrifüj edin. Bu adım protein ölçümü ile girişimönlemek için hücresel enkaz pelet olacaktır.
    4. Üreticinin tavsiyelerine göre bicinchoninic asit (BCA) tsay ile protein konsantrasyonu ölçün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NK hücrelerinin periferik kandan izolasyonu saf ve canlı bir popülasyon sağlar

Hücre dışı akı teşpini kuyudaki H+ ve O2 konsantrasyonunun ölçümü ne dayanır ve farklı hücre popülasyonları veya canlılıkları arasında ayrım yapmaz. Bu nedenle, ilgi hücresinin son derece saf ve canlı bir nüfus elde etmek bu deneylerde başarılı olmak için önemli bir adım oldu.

NK hücrelerinin periferik kandan izolasyonu bölüm 2'de belirtildiği gibi gerçekleştirildi. Elde edilen NK hücrelerinin saflığını ve canlılığını değerlendirmek için PMBC'lerden ve izole NK hücre popülasyonundan küçük aliquotlar akış sitometrisi ile boyandı ve analiz edildi(Şekil 2A). Mononükleer hücreler, yan dağılım alanı (SSC-A) karşı ileri (FSC-A) gösteren çizimde geçitli idi. Bu popülasyon içinde, fsc-A karşı ileri dağılım yüksekliği (FSC-H) gösteren çizim de diyagonal boyunca tek hücreler geçitli edildi. Tekli popülasyonlarda canlılık değerlendirildi ve her iki pmbc'de ve NK hücre popülasyonlarında %98'den daha yüksek bulundu. Izole Edilen NK hücre popülasyonunun saflığı CD3 (T hücrelerinde bulunan, PBMCS'de baskın popülasyon) ve CD56 veya NKp46'ya karşı çift boyama ile kurulmuştur(Şekil 2B). NK hücreleri CD3 için popülasyon negatif ve CD56 veya NKp46 için pozitif olarak tanımlanır. Bu kriterlere göre, NK hücrelerinin saflığı %88 civarındaydı ve bu da NK hücrelerinde PBMCs popülasyonundakilere kıyasla 18 kat zenginleşmeyi temsil ediyor.

OCR ve ECAR değerleri hücre numarasına bağlıdır

Mitokondriyal stres testi için, hücreler metabolik olarak üç farklı bileşiğin eklenmesiyle tedirgin edildi: oligomisin, DNP ve antimisin A + rotenon. Her hücre tipi için, iyi başına hücre sayısı dikkatle bir hücre dışı akı tsay deney için optimize edildi. Şekil 3A çeşitli insan NK hücre numaraları (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 10 6 ve 0,047 x 106) kullanarak mitokondriyal oksijen tüketim oranı (OCR) temsili çizimler gösterir.6 Tüm ölçümler triplicate yapıldı. Hücre sayıları kuyudaki DNA veya protein miktarıile doğrusal olarak ilişkilidir (Şekil 3B). Beklendiği gibi, yüksek hücre numaraları daha yüksek OCR değerleri gösterirken, her kuyu başına 0,187 x 106 hücreden daha azı sağlam sonuçlar vermedi. Öte yandan, daha yüksek hücre numaraları (1.5 x 106)optimal değildi, DNP eklenmesi üzerine, kuyudaki oksijen konsantrasyonu tamamen her döngüsünde tükenmiş oldu(Şekil 3C),Hangi OCR doğru hesaplanmasını engeller. Submaksimal OCR'ye yeterli DNP sonuçları eklenmese de, çok fazla ekleme maksimal OCR'yi de inhibe edebilir. İnsan NK hücrelerinde 100 μM DNP optimal doz olarak bulunmuştur (Şekil 3D). Karbonil siyanür-4-(trifluoromethoxy) fenilhidrat (FCCP) veya karbonil siyanür m-klorofenil hidrazin (CCCP) gibi diğer uncouplers DNP yerine kullanılabilir ama her hücre tipi için de titre etmek gerekir.

Glikoliz stres testi için, ECAR bir temel ölçüm den sonra, glikoz-aç hücreleri aşağıdaki bileşikler tarafından tedirgin edildi: glikoz, antimisin A + rotenon ve 2-DG. Şekil 3E, ecar'ın temsili çizimlerini birkaç NK hücre numarası (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106,0,094 x 10 6 ve 0,047 x 106) kullanarak gösterir.6 Tüm ölçümler triplicate yapıldı. Glikoliz stres idamı en yüksek kaplama yoğunluğunda başarılı olurken, her kuyu başına 0,187 x 106 hücreden daha azı sağlam sonuçlar vermedi.

IL-15 tedavisi OCR ve ECAR bazal ve maksimal değerleri artırır

Sonraki deneylerde kuyu başına 0,75 x 106 hücrenin optimum tohumlama yoğunluğu kullanılmıştır. NK hücreleri sitokin IL-15'in doymak konsantrasyonlarının varlığında veya yokluğunda 48 saat kültürlüydü ve bu dönemde canlılıkları sırasıyla %93.7 ± 4.8 ve %85.7 ± %12.0 olarak bulundu. Şekil 4A,B, her kuyubaşına 0.75 x 106 NK hücreleri ile tipik bir mitokondriyal stres testi deneyi gösterir. Bu testte, oligomisin oksijen tüketiminde dramatik bir azalmaya yol açar(Şekil 4A) ve hücresel ATP düzeylerini korumak için glikoliz bir geçiş temsil ECAR bir artışa(Şekil 4B). NK hücresinin IL-15 ile aktivasyonu hem mitokondriyal oksijen tüketiminde hem de hücre dışı asitleşmede artışa neden oldu. Bu sonuç, birkaç insan denekleri karşılaştırıldığında tutarlıydı(Şekil 4C). Bazal, maksimal ve ATP'ye bağlı solunum, ancak proton sızıntısı veya mitokondriyal olmayan solunum, IL-15 ile artmıştır (Şekil 4C,D). Ayrıca, OCR/ECAR oranı azalmış, IL-15 stimülasyonu ndan sonra glikolitik metabolizmaya geçme eğilimi ni gösterir(Şekil 4E).

Şekil 4F,G, her kuyuda 0.75 x 106 NK hücreli tipik bir glikoliz stres testi deneyi göstermektedir. Glukoz eklenmesi glikoliaktilasyon nedeniyle ECAR büyük bir artış tetikledi, antimisin A ve rotenone sonraki eklenmesi kompansatör glikoli yol açtı, ve 2-DG yol inhibisyonu ve minimum ECAR bir azalmaya neden oldu(Şekil 4F). Buna paralel olarak, glikoz sürekli oksijen tüketiminde hafif bir azalmaya neden, muhtemelen Crabtree etkisitarafından 20, antimisin A ve rotenon tamamen solunum engelledi ve 2-DG herhangi bir daha fazla etki sağlamaz(Şekil 4G). Hem ekstrasellüler asitleşme hem de IL-15 ile mitokondriyal oksijen tüketiminin aktivasyonu bu testte de gözlenebilir ve yine bu çeşitli donörlerin hücreleri kullanılarak tutarlıdır(Şekil 4H).

Figure 1
Şekil 1: Hücre dışı akı testleri şeması.
(A) glikoliz şeması, trikarboksilik asit döngüsü (TCA) ve elektron taşıma zinciri (ETC). Farklı adımların inhibitörleri kırmızı ile yazılır. ETC'deki elektron akısı NADH donör, O2 ise son kabul örnek olarak yeşil olarak temsil edilir. (B) Zamana karşı hücre dışı asitleşme oranını (ECAR) temsil eden glikoliz stres testi şeması şeması. (C) Oksijen tüketim oranını (OCR) zamana göre temsil eden mitokondriyal stres testi şematik profili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Doğal Öldürücü (NK) hücreleri periferik mononükleer hücrelerden (PBMCs) arındırılır.
(A) Gating stratejisi NK hücrelerinin saflığını ve canlılığını değerlendirmek için izledi (sağ sütun) PBMCs toplamı (sol sütun). Mononükleer hücrelerin kapısından (üst paneller), tek hücre seçilmiş (orta paneller) ve canlılık ölçüldü (alt paneller). (B) Canlı hücreler CD3 ve CD56 veya NKp46 için lekelendi. Panellerde sayılar seçili bölgelerdeki hücrelerin yüzdesini gösterir. Sonuçlar üç bağımsız deneyi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Aktif insan NK hücrelerinde mitokondriyal ve glukoz stres testlerinin optimizasyonu.
(A) Mitokondriyal Stres testi: Her kaplama yoğunluğu için OCR (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 10 6 ve 0,047 x 106) gösterilir.6 Her veri noktası standart sapma ile 3 kuyunun ortalamasını temsil eder. Sonuçlar 3 bağımsız deneyi temsil eder. (B) DNA (üst panel) ve protein (alt panel) düzeyleri farklı kaplama yoğunluklarında kuyuda. Sonuçlar en az üç bağımsız deneyi temsil eder. Her veri noktası standart sapma ile 3 kuyunun ortalamasını temsil eder. Sonuçlar 3 bağımsız deneyi temsil eder. (C) Hiçbir hücre (siyah iz), 0.75 x 106 hücre (mavi iz) veya 1.5 x 106 hücre (yeşil iz) içeren kuyularda ham oksijen seviyesi izleri. DNP eklenmesinden sonra yeşil iz, oksijen tamamen her döngüsünde tükenmiş. (D) 0.75 x 106 hücrenin yedek solunum kapasitesi birkaç DNP konsantrasyonu varlığında test edildi. (E) Glikoliz Stres Testi: Her kaplama yoğunluğu için ECAR (0.75 x 106, 0.375 x 106, 0.187 x 106, 0.094 x 106 ve 0.047 x 106) gösterilir. Her veri noktası standart sapma ile 3 kuyunun ortalamasını temsil eder. Sonuçlar 3 bağımsız deneyi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: NK hücre aktivasyonu sonrası metabolik değişikliklerin IL-15 ile saptanması.
Mitokondriyal Stres testi: OCR (A) ve ECAR (B) çizimleri 0.75 x 106 istirahat veya IL-15 aktif hücreler için gösterilmiştir. Her veri noktası standart sapma ile 3 kuyunun ortalamasını temsil eder. Sonuçlar 5 bağımsız deneyi temsil eder. Bireysel insan donörleri için bazal ve Maksimal Solunum değişiklikleri(C),ATP'ye bağlı solunum, proton sızıntısı, mitokondriyal olmayan solunum (NMR)(D)ve OCR/ECAR oranı(E)olarak gösterilmiştir. Glikoliz Stres testi: ECAR (F) ve OCR (G) çizimleri 0.75 x 106 istirahat veya IL-15 aktif hücreler için gösterilir. Her veri noktası standart sapma ile 3 kuyunun ortalamasını temsil eder. Sonuçlar 5 bağımsız deneyi temsil eder. Bireysel insan donör için bazal ve Maksimal ekstrasellüler asitleşme değişiklikleri gösterilmiştir (H). ns: önemli değil; * p 0.05; ** p 0.01; p 0,001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: TCA ve glikolisin ECAR'a katkısı.
ECAR'ın ilk ölçümleri büyük ölçüde TCA döngüsünde üretilen CO2'ye bağlı asitleşmeye karşılık gelmektedir. Glikoliye glikoz ilave sinden sonra TCA kaynaklı asitleşmenin ECAR'a katkısı azalır. Antimisin A ve Rotenone enjeksiyonu TCA'yı bloke eder ve glikoli, atp talebindeki artışı maksimal seviyesine (kompansatör glikoli) yükselterek dengeler. Glikoliz in2-DG ile abluka minimal düzeylerde ECAR azalır, glikoliz veya solunum aktivitesi atfedilen değil asitleşme yanı sıra herhangi bir kalıntı glikoliz tam olarak 2-DG tarafından inhibe değil (post 2-DG-asitleşme). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Reaktif Çalışma Konsantrasyonu Klon (antikorlar için) Son boyama hacmi
Fare anti-insan CD3 BV711 50 ng/ml UCHT1 100 μl
Fare anti-insan CD56 PE 1/50 seyreltme B159 100 μl
Fare anti-insan NkP46 PE 1/50 seyreltme 9/E2 100 μl
Canlılık Boyası 1/1000 seyreltme 500 μl

Tablo 1: Akış sitometrisi için kullanılan reaktifler ve antikorlar.

Mitokondriyal Stres Testi
Bağlantı noktası Birim Bileşik 10x Stok Tahlilde Son Konsantrasyon
A 20 μl oligomisin 10 μM 1 μM
B 22 μl DNP 1 mM 0,1 mM
C 25 μl antimisin A + rotenone Her biri 10 μM Her biri 1 μM
Glikoliz Stres Testi
Bağlantı noktası Birim Bileşik 10x Stok Tahlilde Son Konsantrasyon
A 20 μl Glikoz 100mm 10 mM
B 22 μl antimisin A + rotenone Her biri 10 μM Her biri 1 μM
C 25 μl 2-DG 500 mM 50 mM

Tablo 2: Bileşik yükleme.

Adım Döngü Yineleme (kez)
Karışımı Bekle Ölçü
Kalibrasyon ––
Denklik ––
Temel okumalar 3 dakika 0 dakika 3 dakika 3
Bitiş döngüsü ––
Inject Port A ––
Ölçüm 3 dakika 0 dakika 3 dakika 3
Bitiş döngüsü ––
Enjekte Bağlantı Noktası B ––
Ölçüm 3 dakika 0 dakika 3 dakika 3
Bitiş döngüsü ––
Bağlantı Noktası C'yi Enjekte Edin ––
Ölçüm 3 dakika 0 dakika 3 dakika 3
Bitiş döngüsü ––
Programı Sonla ––

Tablo 3: Program düzeni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, saf ve canlı birincil insan NK hücrelerini periferik kandan verimli bir şekilde izole etmek ve elde etmek için bir protokol oluşturduk. Ayrıca, oksijen tüketimi ve hücre dışı asitleşme oranı ile değerlendirilen bu NK hücrelerinin metabolik aktivitesinin ölçümü için koşulları da ekstrasellüler akı analizörü kullanarak optimize ettik. Diğer solunum yöntemleri ile karşılaştırıldığında, hücre dışı akı analizörü hızlıdır, az sayıda hücre gerektirir ve yüksek iş akışı taramalarına olanak tanır. Ancak, reaktifler pahalı, ve bileşiklerin enjeksiyonları sadece dört sınırlıdır. Metabolik remodeling ve glikoliz ve Oksidatif fosforilasyon NK hücre sitokinler tarafından aktivasyonu sağlam NK hücre yanıtları için gereklidir21, ve burada açıklanan teknikler gerçek zamanlı Olarak NK hücrelerinin metabolik profilinin çalışmasına izin. Bu protokol, IL-2, IL-12 ve IL-18 gibi diğer sitokinler tarafından aktive edilen hücrelere veya aktive reseptörlerine bağlanan antikorlara genişletilebilir. Hücreleri en iyi kesişme noktasında kaplamak veya maksimum oksijen tüketimini uyarmak için en uygun uncoupler konsantrasyonunu kullanmak gibi genellikle gözden kaçan birkaç önemli adımı ele aldık. Bununla birlikte,O 2'nin kuyularda tükenmediğinden emin olmak için, IL-15'ten farklı diğer uyaranların hücrelere verilmesi durumunda gerçek O 2 seviye eğrilerini(Şekil 3C)kontrol etmenizi öneririz. Bu durumda, gerçek OCR'nin küçümsenmesini önlemek için doğrusal O2 tüketimi gözlemlenene kadar hücre sayısı azaltılmalıdır.

Bazal solunum büyük ölçüde mitokondriyal ATP synthase aktivitesi tarafından kontrol edilir hücrenin bazal metabolik durumunu yansıtır8, ve bazal ATP talebinin bir göstergesidir (protein sentezi için, sitoskeleton dinamikleri, Na gibi ATPases+/ K+-ATPase, vb). Tipik olarak, yeterli substratvarlığında bu parametre metabolik olarak aktif veya stresli hücrelerde artar. Oligomisin eklenmesi, hangi bloklar ATP synthase, ATP bağlı solunum ve proton sızıntısı ortaya koymaktadır, hangi lipid bilayer veya iç mitokondriyal membran proteinler arasında olabilir, ama aynı zamanda Uncoupling Proteinler gibi proteinler yoluyla indüklenebilir (UCPs)9, adaptif termogenez düzenlenmesinde karıştığı ve böylece kahverengi aditetes ısı mitokondriyal enerji potansiyelini dönüştürme. Maksimal solunum mitokondriyal solunum zinciri için substratların mevcudiyeti ve solunum komplekslerinin miktarı ve aktivitesi gibi faktörler tarafından belirlenir. Mitokondriyal solunum kompleksleri ve aktivitesi de asetilasyon veya fosforilasyon22,23gibi posttranslational değişiklikler ile değiştirilebilir. Bu parametre aynı zamanda hücrelerin sağlığını ve akut hakaretlere yanıt verme kapasitelerini de gösterebilir. Mitokondriyal disfonksiyon durumlarında, maksimal solunum azalır, ve bu ATP talebindeki değişikliklere yanıt vermek için hücre nin kapasitesini sınırlar ve hücre ölümüne yol açar24.

Bunu söylemek çok önemlidir. mitokondriyal ve glikoli stres testlerinin her zaman noktası için, ECAR glikoli kaynaklı asitleşme toplamıdır (laktat üretimi ile + H+ )ve solunum kaynaklı asitleşme (CO2üretimi ile ,HCO3 üretmek için H2O çözünür- ve H+), ve daha da önemlisi, solunum kaynaklı asitleşme bazı hücre tiplerinde toplam ECAR önemli bir oranda hesap olabilir25. Ilgilenen araştırmacılar için, gerçek glikolitik oranları hesaplamak için yayınlanan protokoller vardır. Bu amaçla, glikolitik stres testi sırasında oksijen tüketim oranları(Şekil 4G)her zaman noktada solunum ile proton üretim oranını hesaplamak için kullanılabilir ve bu değer, ECAR değerleri veorta7 ,25,,26tampon gücü kullanılarak elde edilen toplam proton üretim hızından çıkarılabilir.

Üreticinin tavsiyesi ile karşılaştırıldığında bu protokolün önemli bir değişiklik glikoliz stres testi nin ikinci enjeksiyonudur. Antimisin A ve rotenon oligomisin tercih edilir, zaten tarif edilmiştir çeşitli nedenlerden dolayı7: 1) bazı hücreler tamamen hücrenin bazal ATP talebi karşılamak olabilir yüksek glikolitik kapasite görüntülemek, oksidatif fosforilasyon yokluğunda bile; 2) antimisin A ve rotenon ile ETC bloke yapay olarak hücrenin ATP talebini artırır, ATP synthase tarafından ATP hidrolize neden olarak (mitokondri bir ATP lavabo haline), solunum inhibisyonu sonra çöker mitokondriyal membran potansiyelini kurtarmak için bir girişim proton pompa ters; 3) ETC'nin bloke edilmesi, ECAR sonuçlarını şaşırtmaya neden olan ortamın (HCO3ve H+'yadönüştürülen TCA döngüsünde üretilen solunum CO2) solunum asitleşmesini önler. Böylece, antimisin A ve rotenon ile gözlenen maksimal ECAR sadece glikoliz atfedilebilir. İlginçtir, bu ECAR tek başına solunum inhibitörleri ile gözlenen hala submaksimalolabilir bildirilmiştir 7, ve hücresel ATP talebini artırmak için ek bir mekanizma (ve bu nedenle maksimal ECAR) tanımlanmıştır: iyonofor monensin eklenmesi, hangi hücreiçine Na+ ithalatını artırır ve plazma membran Na + / K+-ATPase tarafından ATP hidroliz oranını uyarır, antimisin A ve rotenonekarışımı 7.+

İkinci önemli kavram ise glikolitik olmayan asitleşmenin çıkarTını önermememizdir. muhtemelen HCO3dönüştürülür solunum CO2 karşılık gelir- ve H+, üretici tarafından tavsiye edildiği gibi glikolitik parametreleri hesaplamak için tüm iz, Glikoliz Stres Testi her aşamasında bu miktar önemli ölçüde değişir gibi (bazal durumda en yüksek, Crabtree etkisi nedeniyle glikoz eklenmesinden sonra azalır20, ve neredeyse antimisin A ve rotenone ile kaldırılır) (5 Şekil).

Özetlemek gerekirse, bu protokol bir ekstrasellüler akı analizörü ile insan doğal katil hücrelerin metabolik aktivitesini test etmek için basit ve verimli bir araç gösterir. Bu yöntem, sitokin stimülasyon veya obezite, kanser veya viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere belirli patolojik koşullar altında hücre aktivasyonu ile değiştirmek için bilinen bu hücrelerde metabolik durumu sorgulamak için kullanılabilir28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

Yazarlar destek ve tartışma için Dr Michael N. Sack (Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü) teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Intramural Araştırma Programları tarafından desteklenmiştir. JT MICINN (İspanya) Ramon y Cajal programı (hibe RYC2018-026050-I) tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 160 Doğal Öldürücü hücreler metabolizma hücre dışı akı glikoliz mitokondri solunum elektron taşıma zinciri akış sitometrisi
İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton,… More

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter