Summary
吸入干粉配方在治疗呼吸系统疾病方面有很大的潜力。在进入人类研究之前，有必要在前科研究中评估干粉配方的功效。提出了一种简单而非侵入性的方法，通过体外路线对小鼠的干粉进行管理。
Abstract
在开发可吸入干粉配方时，必须评估其在前层动物模型中的生物活动。本文介绍了一种在小鼠体内输送干粉制剂的非侵入性方法。提供由 200 μL 凝胶装载移液器尖端组成的干粉装装置，通过三向塞孔连接到 1 mL 注射器。少量干粉（1-2毫克）被装入移液器尖端，并在注射器中通过0.6毫升的空气分散。由于移液器尖端是一次性的，价格低廉，因此可以提前将不同的干粉配方加载到不同的提示中。在同一动物实验中，无需设备清洁和剂量补充，即可评估各种配方，从而节省时间并消除残留粉末交叉污染的风险。粉末分散的程度可以通过移液器尖端残留的粉末量来检查。包括一个带有定制光源和导引管的鼠标内导管协议。适当的插管是影响干粉配方在健康内输送到小鼠深肺区域的关键因素之一。
Introduction
肺病的施政途径为局部和系统行动提供治疗提供各种好处。对于肺病的治疗，可以通过肺分娩实现高局部药物浓度，从而减少所需剂量，降低全身副作用的发生率。此外，肺部相对较低的酶活性可以减少过早的药物代谢。肺部也有效地吸收药物的全身作用，由于大和良好的灌注表面积，极薄的上皮细胞层和肺毛细血管1的高血量。
吸入干粉配方已被广泛研究，用于预防和治疗各种疾病，如哮喘，慢性阻塞性肺病，糖尿病和肺疫苗接种2，3，4。固体状态下的药物通常比液体形式更稳定，干粉吸入器比雾化器5、6更便携、更方便用户。在开发吸入干粉配方时，需要在肺管理7后，在药物前动物模型中评估其安全性、药效和疗效。与能主动吸入干粉的人类不同，肺向小动物输送干粉具有挑战性。有必要建立一个有效的协议，将干粉送到动物的肺部。
老鼠被广泛用作研究动物模型，因为它们经济，繁殖良好。它们也易于处理，许多疾病模型都已建立起来。给小鼠肺部施用干粉有两种主要方法：吸入和体内管理。为了吸入，小鼠被放置在全身或鼻子专用室，其中干粉被气溶胶化，动物呼吸气溶胶没有安定8，9。设备昂贵，药品输送效率低。虽然全身腔在技术上可能不那么具有挑战性，但仅鼻腔暴露室可以最大限度地减少药物暴露在身体表面。无论如何，仍然很难精确控制和确定交付到肺部的剂量。干粉主要沉积在鼻咽部位，其中粘膜清除突出10。此外，在管理过程中，室内老鼠承受着巨大的压力，因为它们受到限制，得不到食物和水的供应。对于体内管理，它通常是指将物质直接引入气管。有两种不同的技术来实现这一点：气管切除术和骨质管内分。前者需要外科手术，使气管切口，这是侵入性的，很少用于粉末管理。这里只描述了第二种技术。与吸入法相比，体内输病是小鼠肺输配的常用方法，因为其输送效率高，药物损失最小。这是一种简单快捷的方法，可在几毫克内精确地将少量粉末输送到鼠标。虽然小鼠在解剖学和生理上与人类不同，在插管过程中需要麻醉，但内科管理绕过上呼吸道，为评估干粉配方的生物活动（如肺吸收、生物利用和治疗效果）提供了更有效的方法。
要在内经管理干粉，必须插管小鼠，这可能具有挑战性。本文介绍了定制干粉灌装器和管内装置的制造情况。演示了在小鼠肺部进行干燥粉末的灌接和窒息过程。
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Protocol
本研究的实验已获香港大学活体动物教学及研究委员会（CULATR）批准。本研究使用喷雾冷冻干燥（SFD）制备的干粉配方，其中含有0.5%的红素酶信使RNA（mRNA）、5%的合成肽PEG12KL4和94.5%的曼尼托（w/w），用于演示肺16中的mRNA表达。SFD 粉末的质中空气动力学直径 （MMAD） 为 2.4μm。喷雾干燥（SD）曼尼托粉用于研究粉末分散16中使用的空气量的影响。SD 粉末的 MMAD 为 1.5μm。
1. 制造干粉窒息器和装载干粉
- （可选）中和干粉（小瓶中）和 200 μL 非滤光圆凝胶加载移液器尖端的静电。根据制造商的指示，使用防静电枪或与除离子功能的平衡。
- 准备一张尺寸约为 4 厘米 x 4 厘米的称重纸。将纸张对角线折叠成两半，然后展开。
- 称重纸上重1-2毫克干粉。
- 通过更宽的开口用粉末填充凝胶加载移液器尖端。轻轻敲击以包装粉末，直到粉末在尖端狭窄端附近形成松散的聚集物（图1A）。避免将粉末包装得太紧，因为它可能会阻碍粉末的分散。
- 通过三向塞孔（图 1B ）将装粉尖连接到1mL 注射器。注射器的大小可以根据用于分散粉末的空气量而改变。连接期间垂直握住尖端和注射器，以防止粉末溢出。如果不立即执行管理，使用寄生胶片密封尖端的开口，并暂时在适当条件下存储，直到管理。
2. 内存设备的制造
- 光源 （图2）
- 用发光二极管 （LED） 手电筒和直径为 0.8-1 mm 的柔性光纤准备定制光源。
- 用手钻或钻头在 LED 手电筒的透明透镜上制作一个中心孔，使光纤几乎无法通过。
- 通过孔插入光纤。打开 LED 手电筒，调整插入的位置和深度，以获得光纤另一端的最大亮度。
- 将光纤与透明环氧胶粘合到位。
- 指导犬 （图 3）
- 拿一个1mL塑料巴斯德移液器（图3A），把移液器保持在两端。
- 使用酒精灯（或实验室中的其他热源，如邦森燃烧器）将酒精灯放在火焰上方 5-10 厘米处加热移液器中间（图 3B）。旋转移液器，以确保均匀加热。
- 当塑料变软变形时，将移离火焰的移开移动器，轻轻伸展移液器。
- 用一把剪刀将中间拉伸的移液器切成 A 部分和 B 部分（图 3C-E）。使用第 A 部分作为精细的尖端移液器，将 B 部分用作引导管。为了增加成功与引导管管交配的机会，在 B 部分（图 3F）的末尾制作一个斜面（不太锋利，这可能会增加伤害动物的风险）。当将 200 μL 凝胶加载移液器尖端（用于粉末装载）插入导管时，应将管子突出 1-2 mm。
注：具有适当尺寸（内部和外部直径）进行插管的导管（B部分）内部和外部针头内可容纳21根针头，同时也可以放入17号针内。在拉伸移液管时可能需要多次尝试才能达到适当的尺寸。 - （可选）：在导管的较宽端切开一个小开口，使其更加灵活，以便更容易保持光纤（图3F）。此开口还允许安装用于液体气溶胶管理的微喷雾器。
3. 灌引
- 通过腹腔内注射将小鼠（BALB/c，7-9周）与氯胺酮（100毫克/千克）和西拉津（10毫克/千克）麻醉。
- 准备一个用玻璃制成的平台，并将其安装到带夹子的支架上（图4A）。将麻醉鼠标放在平台上（倾斜度约为 60° 时）置于超平位置。平台的高度和倾斜角度可以通过支架上的夹子位置进行调整。
- 将鼠标的切口钩在尼龙牙线上（图4B）。暂停鼠标。用胶带或橡皮筋固定鼠标的位置。
- 在导引管打开时，将光纤插入导管中，然后用光纤水平尖进行插管。打开 LED 手电筒进行照明。
- 用一对钳子轻轻伸出老鼠的舌头，露出它的气管。
- 用另一只手用光纤将导管握住。通过口腔插入它们。通过光纤的照明，气管的开口可以可视化为声带之间的孔。
- 将引导罐的斜面对准开口的中线（图 5A）。通过将导管的最佳尖端瞄准气管开口，用光纤轻轻地将引导管插入气管。
- 入管后，迅速取出光纤，将导管留在气管内（图5B）。应观察正常的呼吸。
- 在引导管的开口处握住细尖移液器（A部分），将少量的空气（约0.2 mL）注入小鼠的肺部。小鼠胸部的轻微膨胀表示适当的内分。在粉末管理之前取出细尖移液器。
4. 粉末管理
- 按住与第 1.5 步中描述的注射器相连的粉末加载尖端。确保注射器和尖端之间的气流断开。
- 向后拉注射器柱塞以提取 0.6 mL 的空气。
注：用于分散粉末的空气体积取决于粉末的特性和所装粉量。结果部分进一步描述了这一点。 - 转动三向塞孔的阀门，将注射器和粉末加载尖端之间的气流连接起来。
- 将装有粉末的尖端插入已放置在鼠标气管中的导管（图 5C）中。握住引导管，用力推注射器柱塞，以连续动作将粉末分散为气溶胶进入肺部。
注意：设备的任何前向运动应最小化，以避免伤害动物。 - 取出尖端并检查尖端内的粉末是否已清空。如果没有，重复步骤 4.1 到 4.4。
注意：如果粉末因过度敲击而包装过于紧密，则可能无法正确分散。 - 管理完成后，从气管中取出引导管。
- 允许鼠标通过水平定位在一个超平位置，其舌头半突出，以避免气道的封锁恢复。
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Representative Results
当使用干粉充气器将粉末气溶胶输送到动物的肺部时，所使用的空气量至关重要，因为它会影响粉末的安全性以及粉末分散效率。为了优化该方法，使用不同体积的空气（0.3 mL、0.6 mL 和 1.0 mL）来分散干粉（1 毫克喷雾干曼尼托），并在给药后监测小鼠的重量 48 小时（图 6）。使用0.3 mL和0.6 mL的空气不会导致小鼠在施用后体重减轻至48小时。将粉末与 1 mL 空气分散，在 24 小时内导致超过 5% 的体重减轻，48 小时后仍未完全恢复。在此协议中，使用了7-9周大的BALB/c小鼠。根据物种、菌株和动物年龄、粉末特性（如颗粒大小分布、凝聚力和密度）以及要施用的粉末质量，用于高效粉末分散和动物耐受性的空气量可能需要调查人员对不同动物模型进行优化。
使用上述方法将喷雾冷冻干燥 （SFD） 制备的干粉配方交付给小鼠。SFD配方含有0.5%的mRNA表达红素酶蛋白，5%的合成肽作为输送载体，94.5%的曼尼托16。BALB/c 小鼠在体外施用 1 毫克含有 5μg mRNA 的 SFD 粉末，使用体内成像系统 （IVIS） （图 7）在 24 h 时评估肺部的红素酶表达。SFD粉末分散在深肺中，并观察到红道酶的表达。作为比较，SFD粉末在PBS中重组（最终体积为75μL），并以相同的灌引程序作为液体给小鼠施用，但使用微喷雾器代替产生液体气溶胶16。重组配方的红素酶表达明显高于干粉配方，这可能是由于粉末溶解问题或粉末和液体形式之间的药理动力学特征不同。用mRNA干粉气溶胶治疗的肺的组织学特征与未经治疗的控制和脂糖（LPS）治疗组（图8）进行了比较。没有任何治疗的肺部显示出健康的呈现，而肺内用10微克LPS治疗，显示空气空间分布不规则，炎症细胞渗透到间歇和肺间空间。用SFD粉末治疗的肺部没有出现任何炎症迹象。
图1：定制干粉充气器。
（A） 粉末在尖端的狭窄端附近包装。（B） 凝胶加载移液器尖端通过三向塞锁连接到 1 mL 注射器。该图改编自廖等人21。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：定制的光源进行灌引。
柔性光纤通过在镜头上创建一个小孔连接到 LED 手电筒。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：指导性坎努拉。
（A） 1 mL 塑料巴斯德移液器用于制作导管。（B） 移液器通过加热软化。（C） 加热的移液器被拉伸和切割。（D） 移液器的 A 部分用作细尖移液器。（E&F）移液器的 B 部分用作导管。创建斜面以方便灌引程序。可以进行一个小的开口（可选的），以增加管子的灵活性。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：灌引平台。
（A） 受管平台由安装在支架上的玻璃板组成。（B） 麻醉鼠标被放置在平台上，处于超平位置，通过用尼龙牙线钩住切口而悬浮。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：说明插管程序的示意图图。
（A） 导管斜面与气管开口的中线对齐。（B） 引导管插入气管，并准备进行粉末管理。（C） 粉末加载尖端（通过三向塞子连接到注射器）插入已放置在鼠标气管中的导管中。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：不同空气量的干粉的体内管理。
BALB/c 小鼠在体内使用喷雾干燥 （SD） 曼尼托粉进行静脉注射，这些粉末被分散在 0.3 mL、0.6 mL 和 1.0 mL 的空气中。在施用前和施用后18小时、24小时和48小时对小鼠的体重进行了监测。数据以体重变化百分比的平均值（n=2）的形式呈现。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：MRNA制剂作为干粉和重组液体气溶胶的体内管理。
BALB/c 小鼠使用定制的干粉充气器或重组液体气溶胶（75 μL PBS 中的 1 毫克）配方，在体内使用喷雾冷冻干燥 （SFD） 0.5% mRNA （luciferase） 配方作为粉末气溶胶 （1 毫克） 进行静脉注射。每只小鼠接受5微克的mRNA剂量。PBS （75μL） 用作控制。在24小时后（A）肺被隔离用于生物发光成像：（B） 测量肺组织的红斑狼疮蛋白表达。这些数据被表示为每毫克蛋白质的相对光单位 （RLU） 的平均值，由单向 ANOVA 分析，然后是 Tukey 的临时测试***p < 0.001 （n=4）。这个数字改编自邱等人16。请单击此处查看此图的较大版本。
图8：mRNA干粉配方的体内管理后，小鼠肺部的病理学。
（A） 未经处理的控制：小鼠在体内使用（B） LPS （10 毫克在 25μL PBS 中） 和（C）喷雾冷冻干 mRNA 粉 （1 毫克）。使用直立显微镜以 20 倍放大（比例杆 = 100 mm）查看幻灯片。这个数字改编自邱等人16。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本文介绍了用于干粉窒息和体内插管的定制设备。在粉末装载步骤中，干粉末被加载到 200 μL 凝胶加载移液器尖端。重要的是轻轻敲击尖端，使粉末在尖端的狭窄端松散包装。但是，如果粉末包装太紧，它们会卡在尖端，无法正确分散。建议中和粉末和移液器尖端的静电荷，以方便粉末装载，特别是低密度和低相对湿度的粉末。引导管是设备的关键部件。它用于促进将装有粉末的移液器尖端插入小鼠气管。导管的直径不应太宽：否则将很难将其插入气管，并可能伤害鼠标。导管管的直径应足够宽，以适应光纤和粉装移液器尖端，移液器尖端应突出导管管约1-2毫米。
气管开口的可视化能力在插管过程中至关重要，从而能够正确插入导管。气管开口由白色软骨组成，喉咙后部有规律的开闭运动。通过光纤照明，气管的开口可以很容易地可视化。通过细尖塑料移液器吹气少量空气，胸部的膨胀表示适当的插管。如果未观察到胸部的通货膨胀或在插入过程中感觉到阻力，请迅速收回引导管并重复步骤。
有一个广泛使用的商用干粉充气器12，17，18（材料表：这种设备现在已停产）。干粉被装进设备的样品室，从3mL塑料空气注射器或空气泵通过空气散开。为了测量排放的剂量，设备必须在粉末管理前后进行称重，这导致不准确，因为粉末的剂量通常非常小（相对于设备的质量）。与商用充气器相比，定制设备的最大优点是透明凝胶加载移液器尖端没有粉末，可以观察到粉末分散的成功。由于移液器尖端很轻，因此在施用前后还可以准确称重以测量排放的剂量。移液器尖端插入导管，而不是暴露在动物的气管中。使用气管中的水分或分泌污染尖端的风险最小（这可能会影响发射剂量测量的准确性）。由于移液器尖端是一次性的，价格低廉，不同的干粉配方可以提前加载到不同的提示。在同一动物实验中可以评估各种配方，无需设备清洁和剂量补充，从而节省时间并消除残留粉末交叉污染的风险。此外，商业充气器产生的粉末分散模式因配方而异。多项研究报告，商业充气器分散的干粉很容易聚集，在19日、20日施用时未能到达深肺。相比之下，其他由类似我们的设备分散的配方，据报有高肺沉积15，21，22。
文献中还报告了其他类似的定制设备，用于将粉状气溶胶施用到动物的肺部。例如，Chaurasiya等人描述了使用管子进行管子的管子的灌输和粉末装载，在管内管进行粉末分散后，注射器与罐管相连。虽然他们的方法使用标准化的设备和材料（如示望镜，管和注射器）与较少的定制，这里的方法提供了一些明显的优势。首先，它允许在药物管理之前确认正确的内存。此步骤对经验不足的用户特别有帮助。其次，引导管可以起到保护盾的作用，防止气管中的任何分泌或水分污染凝胶加载移液器尖端，从而通过称重更准确地发射剂量测量。最后，更灵活的引导管与光纤一起可以更容易地进行灌导。
总之，本文准确介绍了一种定制的干粉充气器，它价格低廉、一次性、可重复且有效分散少量粉末。提到的入管过程是非侵入性的，快速的，可以安全准确地向小鼠提供粉末配方。它也可以用于管理肺分娩的液体配方。
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Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
作者要感谢李光耀先生、梁振英先生和苏华莱士先生，感谢他们在制造光源和粉末充气器方面给予的善意协助：和动物成像援助的学院核心设施。这项工作得到了香港研究资助委员会（17300319）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g | ||
| CleanCap Firefly Luciferase mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
| Dry Powder Insufflator | PennCentury | Model DP-4M | |
| Ketamine 10% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Light emitting diode (LED) torch | Unilite Internation | PS-K1 | |
| Mannitol (Pearlitol 160C) | Roquette | 450001 | |
| Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL) | Labcon | 1034-800-000 | |
| Nylon floss | Reach | 30017050 | |
| One milliliter syringe without needle | Terumo | SS-01T | |
| Optical fibre | Fibre Data | OMPF1000 | |
| PEG12KL4 peptide | EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2 | |
| Plastic Pasteur fine tip pipette | Alpha Labotatories | LW4061 | |
| Three-way stopcock | Braun | D201 | |
| Xylazine 2% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Zerostat 3 anti-static gun | MILTY | 5036694022153 |
References
- Newman, S. P. Drug delivery to the lungs: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 8 (8), 647-661 (2017).
- Setter, S. M., et al. Inhaled dry powder insulin for the treatment of diabetes mellitus. Clinical Therapeutics. 29 (5), 795-813 (2007).
- Muralidharan, P., Hayes, D., Mansour, H. M. Dry powder inhalers in COPD, lung inflammation and pulmonary infections. Expert Opinion on Drug Delivery. 12 (6), 947-962 (2015).
- de Boer, A. H., et al. Dry powder inhalation: past, present and future. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (4), 499-512 (2017).
- Das, S., Tucker, I., Stewart, P. Inhaled dry powder formulations for treating tuberculosis. Current Drug Delivery. 12 (1), 26-39 (2015).
- Okamoto, H., et al. Stability of chitosan-pDNA complex powder prepared by supercritical carbon dioxide process. International Journal of Pharmaceutics. 290 (1-2), 73-81 (2005).
- He, J., et al. Evaluation of inhaled recombinant human insulin dry powders: pharmacokinetics, pharmacodynamics and 14-day inhalation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (2), 176-184 (2019).
- Durham, P. G., Young, E. F., Braunstein, M. S., Welch, J. T., Hickey, A. J. A dry powder combination of pyrazinoic acid and its n-propyl ester for aerosol administration to animals. International Journal of Pharmaceutics. 514 (2), 384-391 (2016).
- Phillips, J. E., Zhang, X., Johnston, J. A. Dry powder and nebulized aerosol inhalation of pharmaceuticals delivered to mice using a nose-only exposure system. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (122), e55454 (2017).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals). European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Price, D. N., Muttil, P.
- Chang, R. Y. K., et al. Proof-of-Principle Study in a Murine Lung Infection Model of Antipseudomonal Activity of Phage PEV20 in a Dry-Powder Formulation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (2), (2018).
- Ito, T., Okuda, T., Takayama, R., Okamoto, H. Establishment of an Evaluation Method for Gene Silencing by Serial Pulmonary Administration of siRNA and pDNA Powders: Naked siRNA Inhalation Powder Suppresses Luciferase Gene Expression in the Lung. Journal of pharmaceutical sciences. 108 (8), 2661-2667 (2019).
- Patil, J. S., Sarasija, S. Pulmonary drug delivery strategies: A concise, systematic review. Lung India. 29 (1), 44-49 (2012).
- Ihara, D., et al. Histological Quantification of Gene Silencing by Intratracheal Administration of Dry Powdered Small-Interfering RNA/Chitosan Complexes in the Murine Lung. Pharmaceutical Research. 32 (12), 3877-3885 (2015).
- Qiu, Y., et al. Effective mRNA pulmonary delivery by dry powder formulation of PEGylated synthetic KL4 peptide. Journal of Controlled Release. 314, 102-115 (2019).
- Pfeifer, C., et al. Dry powder aerosols of polyethylenimine (PEI)-based gene vectors mediate efficient gene delivery to the lung. Journal of Controlled Release. 154 (1), 69-76 (2011).
- Kim, I., et al. Doxorubicin-loaded highly porous large PLGA microparticles as a sustained- release inhalation system for the treatment of metastatic lung cancer. Biomaterials. 33 (22), 5574-5583 (2012).
- Tonnis, W. F., et al. A novel aerosol generator for homogenous distribution of powder over the lungs after pulmonary administration to small laboratory animals. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (3), 1056-1063 (2014).
- Hoppentocht, M., Hoste, C., Hagedoorn, P., Frijlink, H. W., de Boer, A. H. In vitro evaluation of the DP-4M PennCentury insufflator. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (1), 153-159 (2014).
- Liao, Q., et al. Porous and highly dispersible voriconazole dry powders produced by spray freeze drying for pulmonary delivery with efficient lung deposition. International Journal of Pharmaceutics. 560, 144-154 (2019).
- Ito, T., Okuda, T., Takashima, Y., Okamoto, H. Naked pDNA Inhalation Powder Composed of Hyaluronic Acid Exhibits High Gene Expression in the Lungs. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 489-497 (2019).
- Chaurasiya, B., Zhou, M., Tu, J., Sun, C. Design and validation of a simple device for insufflation of dry powders in a mice model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 123, 495-501 (2018).
