Summary
단일 핵 절연은 세포막의 해리 및 세제 기반 과구화에 의존하며 최적화가 필요하며 기술 적 유물을 도입하는 경향이있는 단계입니다. 당사는 전체 조직에서 직접 그대로 핵을 신속하게 분리하기 위한 세제 및 효소 없는 프로토콜을 시연하여 단일 핵 RNA-seq(snRNA-Seq) 또는 ATAC-seq에 적합한 핵을 산출합니다.
Abstract
고처리량 전사체 및 후성 유전체 프로파일링은 단일 세포 또는 단일 핵 현탁액의 준비를 필요로 한다. 그대로 세포 또는 핵을 가진 현탁액의 준비는 해리와 투과화를 포함, 원치 않는 소음과 바람직하지 않은 손상을 소개 할 수있는 단계. 특히, 뉴런과 같은 특정 세포 유형은 개별 세포로 해리하기가 어렵습니다. 추가적으로, 핵을 방출하기 위하여 세포 막의 투과화는 시간 소모, 노동 집약적이고 재정적으로 실행 가능할 수 있는 시행 착오에 의하여 최적화를 요구합니다. 고처리량 시퀀싱을 위한 시료 제제의 견고성과 재현성을 향상시키기 위해 신속한 효소와 세제 없는 컬럼 기반 핵 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 20분 이내에 전체 제브라피시 뇌에서 핵을 효율적으로 분리할 수 있게 해줍니다. 고립 된 핵은 핵 형태와 골재에 대한 낮은 성향을 그대로 표시합니다. 또한, 유동 세포측정은 다운스트림 적용을 위한 세포 이물질의 핵 농축 및 클리어런스를 허용한다. 연조직 및 배양 세포에서 작동해야 하는 이 프로토콜은 고처리량 프로파일링에 활용할 수 있는 샘플 준비를 위한 간단하고 접근 가능한 방법을 제공하여 성공적인 단일 핵 RNA-seq 및 ATAC-seq 실험에 필요한 단계를 단순화합니다.
Introduction
단세포 RNA-seq(scRNA-Seq) 및 ATAC-seq는 단일 세포 해상도에서 복잡한 생물학적 시스템을 연구하는 다목적 도구입니다. 그(것)들은 세포 특수형 및 상태, 유전자 네트워크를 정의하고 세포 이질성을 평가하기 위하여 널리 이용됩니다. scRNA-seq를 수행하기 위한 전제 조건은 조직 해리에 의한 단일 세포 현탁액의 제조이다. 세포외 매트릭스 조성 및 기계적 특성의 변화로 인해 개별 조직은 단일 세포 서스펜션의 준비를 위해 해리 프로토콜의 최적화가 필요합니다.
단일 세포로 조직의 해리는 전형적으로 콜라게나아제, 디스파제 또는 트립신을 포함한 소화 효소를 가진 치료를 37°C1,,2,,3,,4에서포함한다. 전사 기계는 37 °C에서 활성 상태로 유지되므로 효소 해리는 mRNA 발현 아티팩트 및 노이즈5,,6을소개 할 수 있습니다. 특히, 장기간의 인큐베이션은 비균일한 방식으로 스트레스 반응성 유전자 및 열 충격 반응을 유도할 수 있으며, 실험7에서기술적 가변성을 유발할 수 있다.
단일 세포 현탁액생성의 또 다른 단점은 복잡한 형태학을 가진 실행 가능하고 그대로 셀 유형을 얻는 데 어려움이 있다는 것입니다. 특히, 뉴런, 지방세포 및 세포세포는8,9,,10,,11을분리하기 어렵다., 예를 들어, 우와 동료들은 성인 마우스 신장 12에서 scRNA 프로필에 구엽 포도세포의 부재를입증했다. 유사한 비최적 관찰은 뇌 조직8,,13,14에서상호 연결된 뉴런의회복에관한 것으로 만들어졌다. 요약하자기 프로토콜은 세포 유형을 쉽게 분리하기 위해 검출 편향을 도입하여 장기의 세포 아키텍처를 허위진술할 수 있습니다.
scRNA-Seq.에서 시료 준비 중에 도입된 기술적 소음과 편견을 극복하기 위해 핵을 격리하고 프로파일링하면 매력적인 대안을 제공합니다. 핵 형태는 다른 세포 유형 사이에서 유사하기 때문에 핵의 분리는 복잡한 형태를 가진 그대로 및 실행 가능한 세포를 격리하는 문제를 우회합니다. 예를 들어, 우와 동료들은 scRNA-Seq12에서누락된 성인 마우스 신장의 단일 핵 RNA-Seq.(snRNA-Seq.)를 가진 구엽 포도세포의 성공적인 프로파일링을 시연하였다. 흥미롭게도, 단세포와 단핵 RNA-seq 사이 비교 연구 결과는 snRNA-Seq12를가진 긴장 및 열 충격 반응 유전자의 유도에 있는 감소를 건의했습니다. 연구 결과는 또한 2개의 방법에 의해 검출된 유전자 사이 높은 상관관계를 건의합니다. 그러나, 인간 microglia에 대한 최근 연구는 알츠하이머 병15에서유전 활성화를 검출하지 못했습니다. 따라서 특정 맥락에서, snRNA-Seq는 scRNA-Seq16,,17에적합한 대안이다. 또한, 핵 절연은 단세포 ATAC-Seq.에 활용될 수 있으며, 개별 세포 내의 개방 크로마틴 영역에 대한 정보를 제공한다.
핵 분리를 위한 프로토콜은 3개의 중요한 단계를 관련시킵니다: i) 핵을 풀어 놓기 위하여 세포막의 세제 기지를 둔 용해; ii) Dounce 균질화제를 사용하여 조직 균질화; iii) 그라데이션 원심분리 또는,유동 세포측정법(18,19,18,20,21,,22)을이용한 세포이물질의 농축 및 제거., 이 중, 처음 두 단계는 조직 유형에 따라 달라 지적으로 최적화 될 필요가있다. 온화한 세제는 세포막의 부분파열과조직(23)으로부터핵의비효율적인 회수로 이어집니다. 한편, 높은 수준의 세제와 가혹한 균질화는 핵막의 파열과 그들의 손실24,,25로이어집니다. 파열된 핵은 더 뭉쳐서 골재를 형성하는 경향이 있으며, 제거되지 않으면 다운스트림 프로파일링 실험에서 유물로 이어질 수 있습니다.
핵 분리를 위한 세제 최적화와 관련된 문제점을 회피하기 위해 세제 프리 및 스핀 컬럼 기반 방법을 사용하여 신선한 시료로부터 그대로 핵을 분리하는 프로토콜을 도입합니다. 프로토콜은 20 분 이내에 전체 기관에서 핵을 산출하여 관절 전사의 유도를 제한합니다. 절연 된 핵은 단일 핵 RNA-Seq 및 ATAC-seq를 위해 FACS로 농축 될 수 있으며 견고하고 재현 가능한 고처리량 프로파일링을 가능하게하는 간단하고 보편적 인 방법을 제공합니다.
Protocol
아래에 제시된 모든 절차는 기관(Université Libre de Bruxelles(ULB)과 국가 윤리 및 동물 복지 지침 및 규정에 따라 수행되었으며, 동물 복지 윤리위원회(CEBEA)의 대학 리브레 드 브뤼셀(프로토콜 578N-579N)의 승인을 받았습니다.
1. 조직 해부 전에 준비
- 제브라피시를 안락사하기 위해 PBS에서 0.2% 트리카인 솔루션을 준비합니다. 얼음에 용액을 진정.
- 조직을 다진 30mm 페트리 접시를 준비합니다.
- 얼음 차가운 1 x PBS (조직 샘플 당 10 mL)를 준비합니다.
- 원심분리기를 4°C로 식힙니다.
- 핵 분리의 경우 세제가 없는 핵 절연키트(재료 표)를 사용하십시오.
- 프로토콜을 시작하기 전에, 미리 냉각 버퍼 A와 B는 핵 격리 전에 적어도 30 분 동안 얼음에 배치하여 키트에 제공.
- 격리된 핵을 처리하기 위해 튜브 및 파이펫 팁과 같은 플라스틱 시약을 5% BSA 용액으로 코팅합니다. 이를 위해 PBS의 40mL에서 BSA 2 g를 용해하여 용액을 준비한다. 5%의 BSA로 플라스틱 품목을 코팅하면 플라스틱에 달라붙는 핵을 줄입니다. 이 단계는 고립 된 핵의 회복을 향상시킵니다.
- 파이펫 팁을 5% BSA 용액을 2-3번 피펫팅하여 코팅합니다. 팁을 2시간 동안 공기 건조시하십시오. 샘플당 10가지 플라스틱 팁을 준비합니다.
- 5% BSA로 채우면 핵 수집을 위해 튜브를 코팅합니다. 효율적인 코팅을 보장하기 위해 튜브를 3 번 반전하십시오. 용액을 제거하고 깨끗한 티슈 페이퍼에서 튜브를 거꾸로 2시간 동안 공기 건조시하십시오. 샘플당 키트에 제공되는 수집 튜브 1개를 코팅합니다. 또한 FACS 후 핵 수집을 위해 코팅된 1.5mL 튜브를 준비합니다.
참고: 유리 팁은 고집을 최소화하기 위해 플라스틱 파이펫 팁의 대안을 적극 권장합니다.
2. 제브라피쉬 뇌의 해부
- 제브라피시를 안락사하기 위해 25mL의 얼음 차가운 트리카인 용액으로 90mm 페트리 요리를 준비하십시오.
- 조심스럽게, 낚시 그물을 사용하여 탱크에서 제브라피쉬를 가져 와서 페트리 접시에 넣습니다.
- 5 분 동안 트리카인에 두고 물고기를 안락사.
- 날카로운 면도날로 동물을 참수합니다.
- 집게를 사용하여 두개골을 부드럽게 부수고 두개골의 복부와 등쪽에서 연조직, 피부 및 뼈를 제거합니다.
- 부드럽게, 얼음 차가운 PBS를 포함하는 신선한 30mm 접시로 뇌를 전송합니다.
- 스핀 컬럼의 시료 하중을 용이하게 하기 위해 면도날을 사용하여 뇌를 작은 조각으로 잘라낸다.
3. 단일 핵 절연
- 다진 조직을 핵 절연 키트에 제공된 필터 카트리지로 옮기고 200 μL의 콜드 버퍼 A를 추가하여 조직을 민감하게 한다. 키트에서 제공하는 플라스틱 막대를 사용하여 조직을 2 분 동안 갈아.
- 차가운 버퍼 A 300 μL을 추가하고 캡을 10분 동안 열어 얼음 위에 필터 카트리지를 인큐베이션합니다.
- 카트리지를 캡하고 튜브를 5번 반전하여 조직을 다시 중단합니다.
- 30 s용 16,000 x g의 원심분리기. 이 단계에서는 필터를 통과할 때 세포가 파열되고 고속 원심력이 적용됩니다. 통과하는 흐름에는 튜브 의 바닥에 펠릿이있는 손상되지 않은 핵이 포함되어 있습니다.
- 필터를 버리고 10 초 동안 적극적으로 소용돌이하여 펠릿을 다시 중단하십시오.
- 핵펠릿은 500 x g에서 3분 동안 용액을 원심분리하여 핵을 조심스럽게 버린다.
- 10 분 동안 600 x g에서 차가운 버퍼 B및 원심분리기의 0.8 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 이 단계에서 핵은 막 파편으로부터 분리됩니다. 얻어진 무색 펠릿에는 분리된 핵이 포함되어 있습니다.
- 5% BSA로 PBS의 500 μL에서 절연 된 핵을 다시 중단합니다. 정량화 후 FACS를 수행하기 위해 얼음에 핵 현탁액을 유지합니다.
4. 핵 형태의 시각화
- Hoechst 염색에 의한 핵 형태 확인. 이를 위해, BSA 코팅 팁을 사용하여 새로운 튜브에서 단일 핵 현탁액의 100 μL을 제거하십시오. 핵을 더하기 위해 Hoechst (1 mg /mL)의 0.1 μL을 추가하십시오. 튜브를 부드럽게 소용돌이시다.
- 이미징을 위해 핵 현탁액을 유리 바닥 접시로 전달합니다.
- ~405nm(바이올렛) 파장의 레이저 발산 설정을 이용한 형광 현미경을 이용한 핵을 이미지한다.
5. 핵의 FACS 기반 농축
- FACS를 수행하기 전에 40 μm 세포 여과기를 사용하여 핵을 BSA 코팅 튜브로 필터링합니다.
- 1,000 μL의 최종 부피에 5% BSA로 PBS를 추가하여 필터링된 서스펜션을 희석시.
- 두 라운드 하단 FACS 튜브를 '컨트롤'과 '스테인드'로 레이블을 지정합니다. '제어' 튜브는 얼룩이 없는 핵을 포함하고, '스테인드' 튜브에는 Hoechst 염색 핵이 있습니다.
- BSA 코팅 파이펫 팁을 사용하여 핵 현탁액의 250 μL을 '제어' 튜브로 옮길 수 있습니다.
- 나머지 750 μL 용액을 '염색'으로 표시된 FACS 튜브로 옮기고 핵을 얼룩지게 하기 위해 Hoechst 염료 1μL을 추가합니다. 느린 소용돌이로 섞으세요.
- 스테인드 되지 않은 제어 샘플을 셀 선별기로 로드합니다. 5000개의 이벤트를 기록합니다.
- 스테인드 샘플을 로드하고 5000 이벤트를 기록합니다.
- 단일 핵을 식별할 수 있는 FACS 게이트를 그립니다. 핵은 대조군과 스테인드 샘플 사이의 Hoechst 형광 신호를 비교하여 선택될 수 있다.
- 스테인드 튜브에서 5% BSA를 가진 PBS의 50 μL을 포함하는 새로운 1.5 mL 튜브로 Hoechst 양성 핵을 정렬합니다.
참고: 절연 핵은 다운스트림 적용의 요구 사항에 따라 원하는 매체로 수집될 수 있다.
Representative Results
--위에서 설명한 프로토콜은 제브라피시 뇌 조직에서 직접 단일 핵 현탁액을 생성하는 데 사용되었습니다. 격리는 전형적으로 20 분이 필요하고 세제 또는 소화 효소의 사용을 피하십시오. 프로토콜의 개별 단계를 요약하는 회로도는 도 1에제공되며, 이 단계는 지침에 사용할 수 있도록 인쇄할 수 있습니다.
도 1: 핵 분리를 위한 세제 없는 스핀 컬럼 기반 방법의 회로도.
신선한 제브라피쉬 뇌 조직에서 핵 추출 중에 수행된 개별 단계의 그래픽 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
핵 형태의 시각화
핵 형태학의 질적 확인을 위해, 고립된 핵은 Hoechst로 염색되고 형광 현미경 검사를 사용하여 시각화되었습니다. 핵은 그대로 나타났다, 둥글고 잘 분리(도 2). 중요한 것은 핵막 파열의 징후인 핵응집은 없었다는 점입니다.
그림 2: 제브라피시 뇌에서 분리된 단일 핵.
그들의 온전한 형태를 보여주는 Hoechst 염색 핵의 형광 현미경 현미경 심상. 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FACS 기반의 농축체
분리된 핵의 농축 및 세포 이물질의 제거는 Hoechst 형광 신호의 존재에 게이팅하여 혈류 세포측정에 의해 수행되었다. Hoechst 신호는 보라색, 405 nm, 레이저 (브릴리언트 바이올렛 421 – BV421)와 함께 여기에 검출되었다. 얼룩이 없는 핵은 배경 형광(도3A, 보충도 1A)을나타내었으며, 스테인드 핵은 강한 형광 신호를 나타내었다(도3B, 보충도 도 1B). 도 3C에도시된 바와 같이, 스테인드 및 Hoechst 염색 된 핵은 보라색 채널에서 잘 분리되었다.
도 3: 분리된 핵은 유동 세포면에서 강하고 특정 Hoechst 형광 신호를 표시합니다.
호흐트스트 염색의 분포를 나타내는 단일 핵 현탁액에 대한 히스토그램 플롯. Hoechst는 보라색, 405 nm, 레이저 (브릴리언트 바이올렛 421 – BV421)에 의해 흥분된다. 스테인드샘플(A)은10 0-1003의범위에서 신호를 표시하고, Hoechst 염색핵(B)은103-105 범위에서 신호를 방출한다. 스테인드(grey) 및 스테인드(blue)샘플(C)에의해 방출되는 형광 강도의 오버레이는 두 집단 간의 명확한 분리를 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 분리된 핵을 위한 유동 세포측정 제비 전략. 분리된 핵 현탁액을 위한 대표적인 흐름 플롯. 분리된 핵은 405nm에서 Hoechst를 흥분시키는 전방 산란 및 바이올렛 레이저 BV421을 사용하여 분석되었다. 스테인드 되지 않은샘플(A)은100-103 범위에서 BV421 신호를 표시하였다. 13130건 중 FSC-A(전체의 1.07%)를 기준으로 단일 핵으로 141개의 이벤트가 검출되었으며, BV421 신호(전체의 0%)를 기반으로 미염색된 핵에 대한 0개의 이벤트가 검출되었다. Hoechst 염색 핵(B)은103-105 범위에서 BV421 신호를 표시하였다. 50000건 중 FSC-A(전체의 4.84%)와 BV421 신호(전체의 4.83%)를 기반으로 한 Hoechst 양성 핵에 대한 2414건의 이벤트가 단일 핵으로 검출되었습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
단일 세포 해상도에서 전사체와 후성 유전체를 프로파일링하는 것은 생물학적 시스템의 연구에 혁명을 일으켰습니다. 고체 조직을 위한 단 하나 세포의 해상도에 연구 개별적인 세포 또는 핵으로 기관의 해리에 달려 있습니다. 해리는 시스템5,,6의정확한 표현의 개발을 방지 할 수있는 기술 유물을 소개 할 수있는 파괴적인 절차입니다. 예를 들어, 효소 해리는 뉴런이나 포도세포와 같은 복잡한 형태를 가진 세포에 해를 끼칠 수 있으며, 스트레스 및 열 충격 반응 유전자7,,12의발현을 유도할 수 있다. 또한, 해리 시 세제를 사용하면 핵막을 파열시키고응집(23,,25)으로이어질 수 있다. 따라서, 최고 품질의 단일 세포 또는 핵 현탁액을 얻기 위해 해리를 최적화하는 것이 고처리량 프로파일링 실험의 성공에 가장 중요하다.
여기서는 20분 이내에 제브라피시 뇌에서 온전한 핵을 추출할 수 있는 세제 및 효소없는 핵 분리 방법을 시연합니다. 프로토콜은 전형적인 형태와 견고한 무결성으로 핵을 산출한다(그림2). 6 mg의 단일 제브라피쉬 뇌에서, 프로토콜은 혈류계 수에 의해 결정된 총 60,000개의 핵을 산출합니다. 절연 된 핵은 snRNA-seq, ATAC-seq 및 면역 스테인닝을 포함한 여러 다운스트림 응용 프로그램에 활용 될 수있다. 상기 분리된 핵은 세포질 분획에서 교차 오염을 포함할 수 있고, 특히 내피성 망상및 미토콘드리아의 성분으로부터 포함될 수 있다. 높은 처리량 프로파일링 실험의 경우 세포 이물질, 특히 미토콘드리아의 간격이 강력히 권장됩니다. 유동 세포측정(도3)은핵의 정제를 위한 실행 가능한 옵션을 제공한다. 또는, 자당 그라데이션은 또한 이물질의 제거를 위해 이용될 수 있다.
프로토콜은 마우스 갑상선 (표시되지 않은 데이터)에서 테스트되었으며 제브라피시 뇌 조직과 유사한 결과를 제공합니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 단일 핵 서스펜션을 준비하기 위한 견고하고 재현 가능한 보편적 인 방법을 제공하여 고처리량 프로파일링 실험을위한 물류를 단순화하는 데 도움이됩니다.
Disclosures
저자는 이해상충이 없습니다. 기사를 공개 액세스하기 위한 지불은 미국 인벤드 바이오 테크놀로지스(Invent Biotechnologies Inc.)에 의해 이루어졌습니다.
Acknowledgments
우리는 원고에 대한 의견에 대한 박사 사빈 코스타글리올라와 싱 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 이 작품은 그랜트 번호 34772792에서 퐁드 드 라 레체쉬 시엔티피크 -FNRS에 의해 지원되었다 – S.P.S.에 MISU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
| Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
| Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
| Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
| Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
| Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
| Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
| Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
| PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
| Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
| Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
| Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
| Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
| Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
| Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
| Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
References
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